高效的雪旺细胞体外培养方法

目的 介绍有效地获得大量高纯度、高活性的雪旺细胞培养纯化方法。方法 选用2～3天的SD大鼠双侧臂丛神经和坐骨神经，在解剖镜下剥离除去神经外膜，剪碎后采用高浓度酶消化法种植培养。随后阿糖胞苷连续作用3天去除成纤维细胞，同时逐渐降低培液中胎牛血清浓度。并使用超低酶浓度消化传代。结果本方法可从新生鼠获取近4×10^6雪旺细胞，成活率为98％；S-100免疫荧光法鉴定雪旺细胞纯度达96％以上。传统方法获得约3×10^6雪旺细胞，成活率为92％；雪旺细胞纯度为90％。结论 本方法可以获得大量纯度高、活性好的雪旺细胞，值得进一步推广。     

一种简便的雪旺细胞培养方法

目的介绍一种简便的雪旺细胞培养方法。方法采用反复组织块种植法,进一步在2.5%胎牛血清条件下抑制成纤维细胞生长,进行雪旺细胞培养;以S-100抗体染色鉴定雪旺细胞。结果获得纯度在98%以上的大量高活性雪旺细胞。结论本方法可以简便的获得较高纯度的雪旺细胞,值得进一步推广。     

一种新的培养嗅鞘细胞方法(英文)

为了建立一种新的培养嗅鞘细胞的方法,从而为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞。本研究取新生鼠的嗅球最外两层经胰蛋白酶消化成单细胞悬液,经差速贴壁法纯化,观察并记录其形态特征;经HE染色以及神经生长因子蛋白受体p75(NGFR-p75)和S-100免疫组化染色鉴定并计算其纯度。结果显示,获得的嗅鞘细胞突起呈双极或三级,p75和S-100阳性细胞纯度达到91%。上述结果提示该方法经济易行,所获得的嗅鞘细胞纯度高、活性好。     

猪眼小梁组织眼前节灌流培养和组织块培养

目的了解猪眼小梁组织的灌流眼前节培养和组织块培养在青光眼研究中的应用。方法采用恒速眼前节灌流培养和组织块培养法培养猪眼小梁组织,用光学显微镜观察不同培养方法保存的小梁组织的状态。结果恒速(0.1mL/h)灌流猪眼前节,眼压可以稳定在正常眼压范围(10~12mmHg);在一定范围内,随着流速增加眼压能逐步升高。灌流培养的组织大体形态保留完好,组织层次清晰,细胞状态好。组织块原位培养的小梁组织,周边组织结构保留完好,细胞状态尚可,但是小梁网间隙不如灌流培养的小梁网间隙饱满。结论灌流眼前节培养法可作为短期高眼压模型,更接近小梁网的生理状态,小梁网的正常充盈是维持其功能和结构的必要条件。     

新生大鼠脊髓运动神经元的纯化培养与鉴定

背景：神经元是有丝分裂后的细胞,体外培养很难存活。脊髓运动神经元的分离、纯化和培养同时也是细胞培养的技术难点。 目的：建立新生大鼠脊髓运动神经元培养体系,并予以分类鉴定和测定其纯度。 方法：取新生大鼠脊髓腹侧组织分离成细胞悬液,经密度梯度离心及差速贴壁后纯化培养,采用免疫细胞化学双标染色法对培养盖片上的细胞予以鉴定、分类,结合Hoechst荧光染核,计数各细胞成分的含量。 结果与结论：细胞贴壁生长良好,神经元占85.8%,其中运动神经元达71.6%,星形胶质细胞占7.8%,NF200和胶质纤维酸性蛋白染色皆为阴性的细胞占6.4%。结果说明,取新生大鼠腹侧脊髓组织结合密度梯度离心及差速贴壁接种法可以培养出高纯度的脊髓运动神经元。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

一种新生SD大鼠皮质源性神经元的培养方法

BACKGROUND: Primary culture in vitro of neurons plays an important role in the development, regeneration, signal transduction mechanisms, neuropharmacology and gene expressions of the nervous system. OBJECTIVE: To establish a simple method for primary culture of high-purity cortical neurons in neonatal Sprague-Dawley rats. METHODS: Cortical tissues were acquired from neonatal Sprague-Dawley rats born 1 day. In traditional experimental group, the whole cortex was removed; in improved experimental group, the cortical tissues, 2-3 mm thick on the brain surface were removed. Single cell suspensions were prepared after papain digestion and centrifugation and were then seeded onto 24-well culture plates containing neuron solutions for primary culture (1×105 per well). Cells were identified by neuronal specific markers MAP-2 and Tuj1 after 3-day culture. The number of neurons and neurite length were observed under inverted phase contrast microscope and recorded at 6, 24, 48 and 72 hours, 5 and 7 days of culture, resprctively. RESULTS AND CONCLUSION:The cultured cells expressing MAP-2 and Tuj1 were neurons that could be used in the following experiments. The purity of neurons in the improved experimental group was 92% at 3 days, while only 51% in the traditional experimental group. Cells in both two groups had attached to the wall presenting with small processes at 6 hours, and a simple neural network formed at the 3rd day until dense neural networks could be found at the 5th day. To conclude, our culture method herein is simple and convenient, and can be used to produce neurons with high purity, which will be helpful for the experimental studies on cortical neurons from Sprague-Dawley rats. 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

悬浮组织块法分离培养SD 大鼠脂肪干细胞的实验研究

目的:建立SD 大鼠脂肪干细胞悬浮组织块分离培养法。方法:取正常SD 大鼠股沟处脂肪组织,用悬浮组织块法和组织块贴壁法分离培养SD 大鼠脂肪干细胞,观察细胞的生长状况及形态特征。取第3 代对数期细胞,CCK-8 法绘制其生长曲线;免疫荧光法检测其表面抗原CD29、CD44、CD45 的表达情况;分别用成脂、成骨诱导培养液进行诱导分化,油红O、茜素红染色定性鉴定。结果:两种方法体外培养得到的SD 大鼠脂肪干细胞形态为梭形纤维样,生长力旺盛,生长曲线为典型的“S冶型;免疫荧光法检测显示第3 代细胞强表达CD29、CD44,CD45 表达阴性;细胞成脂诱导培养14 d 后,油红O 染色为阳性;成骨诱导培养14 d 后,茜素红染色为阳性。结论:悬浮组织块法可以分离培养出SD 大鼠脂肪干细胞,方法简便,为体外分离培养SD 大鼠脂肪干细胞提供了一种新的方法。     

骨髓间充质干细胞向雪旺细胞诱导分化方法的研究进展

细胞移植技术治疗周围神经损伤已成为新兴的组织工程学研究热点。骨髓间充质干细胞(BMSCs),由于其具有扩增快、便于分离提纯、可以体外诱导分化成为雪旺细胞(SC)的特性,有可能成为雪旺细胞的有效替代品和组织T程化神经的新型种子细胞。就种子细胞雪旺细胞和骨髓间充质干细胞的生理功能、生物学特性、体外诱导骨髓间充质干细胞生成雪...     

组织块法与酶消化法培养大鼠毛囊干细胞的比较

背景：研究证实毛囊干细胞比毛囊间表皮干细胞更有增生能力,近年来受到广泛关注,成为种子细胞的研究热点。 目的：比较组织块法和两步酶法培养大鼠毛囊干细胞的生物学特性。 方法：体式显微镜下分离大鼠触须部的毛囊,分别用组织块法和两步酶法培养毛囊干细胞,利用反复差速贴壁法纯化细胞,定期观察细胞生长状况及形态,流式细胞仪检测第3代毛囊干细胞CD34、β1整合素的表达。 结果与结论：两步酶法获得的细胞生长速度快,获得的细胞量多,而组织块法获得的细胞生长速度较慢,获得的细胞量也少。流式细胞仪分析显示酶消化法培养组PE-CD34、FITC-β1整合素的表达分别为(39.52±19.57)%和(93.46±4.73)%,组织块法培养组相应为(19.20±11.53)%和(363.57±14.42)%,两组间差异有显著性意义(P < 0.05)。总的来说,两种方法均能培养出实验所需毛囊干细胞,可根据不同实验需求选择恰当的培养方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

一种组合式组织工程动态培养仪

随着组织工程技术应用的多样化,为不同的目标组织提供不同的培养条件,改进工程组织的化学和生物力学性能,或通过不同的培养条件诱导干细胞向不同方向分化,这些得到了学者们越来越多的关注。结合中国现有的实验室条件,中国医学科学院,北京协和医学院整形外科医院自主研发了一种组合式组织工程动态培养仪,以为不同的目标工程组织提供不同的动态培养环境。     

雪旺细胞增殖的研究进展

随着周围神经组织工程学的发展,雪旺细胞的研究越来越受到重视。在周围神经损伤后,雪旺细胞对周围神经再生过程中的形态和功能的修复起着不可替代的作用,因此雪旺细胞的增殖情况对于周围神经损伤后的修复就尤为重要。其增殖速度的提高可大大改善神经桥接体移植的存活率,为临床神经移植术的成功赢得宝贵的时间。本文从雪旺细胞的功能、增殖机制及其影响因素入手,为雪旺细胞的临床应用提供理论依据。     

MicroRNA-21促进大鼠雪旺细胞增殖的实验研究

目的:探讨神经损伤后microRNA-21(miR-21)促进雪旺细胞增殖的分子机制。方法:通过实时荧光定量PCR检测miR-21的表达。通过脂质体介导将人工合成的miR-21模拟物(mimic)及其阴性对照转染大鼠雪旺细胞,CCK-8法检测转染miR-21的雪旺细胞的增殖。流式细胞术分析miR-21对雪旺细胞细胞周期的影响。使用Western blotting实验分析转化生长因子β诱导蛋白(TGFBI)和cyclin D1的表达水平。结果:miR-21在损伤模型组中的表达分别为假手术组和正常神经组织的(7.87±0.75)和(7.75±0.80)倍(P0.01)。miR-21 mimic组miR-21的表达分别为对照组和空白组的(2.21±0.14)和(2.29±0.21)倍(P0.05)。转染48 h后miR-21 mimic组CCK-8实验的A450值较阴性对照组和空白对照组增高(P0.05)。实验组细胞增殖指数高于阴性对照组和空白对照组(P0.01)。同时与对照组相比,转染miR-21后48 h实验组细胞TGFBI明显降低,cyclin D1表达增多(P0.05)。结论:miR-21可促进雪旺细胞增殖,其机制可能与其下调TGFBI的表达有关。     

乳鼠雪旺氏细胞的纯化培养研究

目的：获得高纯度的乳鼠雪旺氏细胞。方法：采用出生后３～５天乳鼠的坐骨、臂丛神经，植块法培养乳鼠雪旺氏细胞；并通过精细剥除神经外膜、组织块反复再植、低浓度胰酶快速消化、差速贴壁法的有机结合对雪旺氏细胞进行纯化；继用抗Ｓ－１００蛋白单抗通过间接免疫荧光法及ＡＢＣ法进行细胞鉴定。结果：首次植块获得的细胞经纯化后雪旺氏细胞可高达８５％以上，反复植块者可达９５％，甚至高达９８％。结论：本方法简单、稳定，所获得的雪旺氏细胞纯度高、数量大、受非实验因素影响小     

成年大鼠雪旺细胞增殖和纯化研究

目的：探索成年大鼠雪旺细胞的体外培养和纯化方法。方法：取成年大鼠背根神经节采用植块法培养，坐骨神经采用酶消化法分散培养。各分三组，第一组为阿糖胞苷处理组；第二组为免疫溶解处理后加垂体浸出液组；第三组为对照组。以活细胞计数和S-100标记相结合判断雪旺细胞增殖和纯化程度。结果：采用植块培养法至第2周末，雪旺细胞纯度在第一、二和三组分别为90％、97％和50％。分散培养至第18天，雪旺细胞纯度第一组94％，第二组大于97％，第三组80％。细胞数量第一组增加1．4倍，第二组增加5．1倍，第三组增加2．4倍。结论：采用免疫溶解处理后加垂体浸出液方法培养成年大鼠来源的雪旺细胞，可得到数量多纯度高的雪旺细胞。     

不同浓度基底膜组份对雪旺细胞生长的影响

目的：了妥不同浓度的基底膜成分对体外培养雪旺细胞生长的影响。方法：用不同浓度的基底膜成分修饰培养板底，并设置空白对照，将纯化的雪旺氏细胞以相同数量接种至各组孔内；观察细胞生长．培养72h后以MTT法和3H-TdR掺入法检测各组细胞的增殖情况，数据进行统计学分析。结果：层粘连蛋白，纤维粘连连蛋白和IV型胶原促雪旺细胞分裂增殖的最低浓度分别是：10μg/ml、10μg/ml、3μg/ml；发挥最大促进效应的浓度分别是：500μg/ml，300μg/ml和100μg/ml。结论：不同的基底膜组份和修饰浓度对雪旺细胞分裂增殖所发挥的作用强度不同，本实验为组织工程化神经桥接体的优化修饰提供了实验基础。     

雪旺细胞促进周围神经再生机制的研究进展

雪旺细胞(SCs)具有强大的可塑性。周围神经损伤后,雪旺细胞去分化为修复表型,主导了修复过程。c-Jun氨基末端激酶、有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等多种信号通路和转录调节因子参与调控雪旺细胞介导的修复程序。本综述讨论了雪旺细胞促进周围神经再生的主要信号通路与转录调节因子。     

外源性心脏营养素1：保护PC12细胞和许旺细胞的可能性

背景：外周神经损伤后的很短时间内,神经和肌肉已经开始发生不可逆的退变。如何延缓外周神经损伤后的退变过程,并创造一定的微环境作为其恢复的基础。 目的：探讨外源性心脏营养素1保护PC12细胞和许旺细胞的作用。 方法：获得并培养许旺细胞和PC12细胞,分别进行完全培养基培养、无血清培养基培养和50 ℃高温培养,心脏营养素1组中加入一定量的外源性心脏营养素1溶液,对照组中加入等量无菌DMEM溶液培养24 h。应用CCK-8比色法测定PC12细胞和许旺细胞的存活率,乳酸脱氢酶试剂盒测定上清液中乳酸脱氢酶活性,硫代巴比妥酸法测定丙二醛浓度,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶活性。 结果与结论：加入心脏营养素1后PC12细胞和许旺细胞存活率明显增高,乳酸脱氢酶释放量、丙二醛浓度明显减少,超氧化物歧化酶活性显著增加。证实外源性心脏营养素1能够明显减轻缺血和热应激刺激对PC12细胞和许旺细胞的损伤从而起到保护作用,其作用机制可能与心脏营养素1与细胞表面受体结合激活了抗凋亡蛋白的表达有关。     

miR-21在周围神经损伤时调控雪旺细胞凋亡

目的:探讨周围神经损伤时,微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)与雪旺细胞(SC)凋亡的关系及相关分子机制。方法:采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测动物模型中miR-21以及人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)的表达情况;通过将miR-21类似物(miR-21-mimic)、miR-21抑制物(miR-21-inhibitor)和阴性对照miRNA(negative control miRNA,NC-miRNA)转染入RSC96细胞中,构建出过表达miR-21的雪旺细胞株(MI-SC)、抑制miR-21表达的雪旺细胞株(IN-SC)及表达对照miRNA的雪旺细胞株(NC-SC);采用流式细胞仪检测3组细胞的凋亡情况;real-time PCR检测3组细胞中miR-21以及PTEN的表达情况;Western blot检测3组细胞中PTEN及凋亡相关蛋白激活型caspase-3(cleaved caspase-3)的表达情况。结果:神经损伤组miR-21的表达量与对照组相比明显升高,神经损伤组PTEN mRNA的表达水平与对照组相比明显降低;与NC-SC相比,上调miR-21组细胞的凋亡比例减少,PTEN mRNA及蛋白的表达水平降低,cleaved caspase-3的表达水平降低,下调miR-21组细胞的凋亡比例增加,PTEN mRNA及蛋白的表达水平升高,cleaved caspase-3的表达水平升高(P0.05)。结论:miR-21可能通过下调PTEN的表达抑制雪旺细胞的凋亡,从而可能在周围神经的损伤修复中发挥作用。     

坐骨神经瓦勒变性大鼠许旺细胞生物学特性及分泌功能变化

背景：研究表明外周神经损伤后,许旺细胞在基底膜管内形成Bunger带,引导再生轴突延伸,但具体作用机制目前尚不清楚。 目的：观察大鼠坐骨神经损伤后瓦勒变性对许旺细胞生物学特性及分泌功能的影响。 方法：建立大鼠坐骨神经横切模型,分为坐骨神经瓦勒变性组(坐骨神经横断组)和手术对照组。采用神经段单酶消化法分离培养许旺细胞,光镜下观察细胞形态变化,S-100免疫荧光鉴定。取第1代许旺细胞,利用计数法绘制14 d内许旺细胞的生长曲线,MTT法检测14 d内许旺细胞增殖活性,酸性磷酸酶法检测许旺细胞黏附能力,ELISA法检测神经生长因子浓度。 结果与结论：坐骨神经段培养第14天,坐骨神经横断组神经段边缘可见大量许旺细胞,呈线形排列;手术对照组许旺细胞数量少,呈散在分布,两组许旺细胞S-100均呈阳性表达。许旺细胞传代培养第3天,两组许旺细胞均进入对数增长期,随时间延长,细胞数及细胞增殖吸光度值均呈上升趋势,坐骨神经横断组细胞数及增殖吸光度值明显高于手术对照组(P < 0.05);坐骨神经横断组许旺细胞黏附能力明显高于手术对照组(P < 0.05);ELISA法检测示,坐骨神经横断组神经生长因子浓度在培养第4,6,8,10,12,14天时均高于手术对照组(P < 0.05)。结果表明大鼠坐骨神经损伤后两三周,瓦勒变性对许旺细胞生物学功能具有显著影响,可诱导许旺细胞幼稚化,促使许旺细胞在短期内迅速分裂增殖,并分泌大量神经营养因子及细胞外黏附成分,为再生轴突的延伸提供适宜的神经微环境;并增加细胞黏附能力,为外周神经损伤修复提供适宜的神经微环境。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

Models and methods to study Schwann cells

Schwann cells (SCs) are fundamental components of the peripheral nervous system (PNS) of all vertebrates and play essential roles in development, maintenance, function, and regeneration of peripheral nerves. There are distinct populations of SCs including: (1) myelinating SCs that ensheath axons by a specialized plasma membrane, called myelin, which enhances the conduction of electric impulses; (2) non‐myelinating SCs, including Remak SCs, which wrap bundles of multiple axons of small caliber, and perysinaptic SCs (PSCs), associated with motor axon terminals at the neuromuscular junction (NMJ). All types of SCs contribute to PNS regeneration through striking morphological and functional changes in response to nerve injury, are affected in peripheral neuropathies and show abnormalities and a diminished plasticity during aging. Therefore, methodological approaches to study and manipulate SCs in physiological and pathophysiological conditions are crucial to expand the present knowledge on SC biology and to devise new therapeutic strategies to counteract neurodegenerative conditions and age‐derived denervation. We present here an updated overview of traditional and emerging methodologies for the study of SCs for scientists approaching this research field.