EGF、bFGF、NGF、RA对小鼠神经干细胞定向分化的调控

目的 观察EGF、bFGF、NGF、RA对小鼠神经十细胞(NSCs)增殖及定向分化的影响。方法 用无血清培养与单细胞克隆技术对小鼠胚胎脑组织进行分离、培养，随后分别加人EGF、bFGF、NGF、RA等因子观察其对NSCs定向分化的影响。结果 EGF培养的小鼠NSCs，2d后见细胞集落形成(典型克隆球)；克隆球中的细胞成圆形，形态规则，未见细胞突起，呈桑椹状聚集；经血清诱导分化后，则主要为星形胶质细胞，仅有个别的神经元。而bFGF培养的NSCs，生长良好，但克隆球数目较EGF组少，克隆球体积略小。3bFGF与EGF共同培养的NSCs，除诱导分化后，分化的细胞性质与EGF组的不同外，其余同EGF组。NGF对神经球的形成无明显的影响。RA组的克隆球数目量很少，形态以球形为主，部分细胞贴壁并出现突起。结论 EGF，bFGF对NSCs的增殖及分化种类均有一定的影响。而NGF与RA则主要影响其细胞的分化，且两者的共同点都是促使其向神经元方向分化。     

多细胞因子诱导成年鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的实验研究

目的观察大鼠骨髓基质细胞(rBMSCs)的生长特点及诱导条件下分化成神经细胞的能力,并对其机制进行初步探讨。方法以密度梯度离心分离骨髓基质细胞,在神经干细胞培养液中培养,采用四唑盐(MTT)法观察在培养液中添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)对BMSCs增殖的影响;观察添加脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)和维甲酸(RA)对rBMSCs的诱导分化情况;采用免疫组织化学法(ABC)检测诱导后的细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元核蛋白(NeuN)和胶质原性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)等特异性标志物的情况;以流式细胞分选确定神经元的比例。结果bFGF和EGF能在体外促进rBMSCs增殖,BDNF、NGF和RA能诱导rBMSCs来源的神经干细胞(NSCs)表达NSE、GFAP等特异性标志物。结论EGF、bFGF、BDNF、NGF、RA及适宜的培养液可使rBMSCs定向转化为NSCs,获得足够的目的细胞,进而分化为神经元样和神经胶质样细胞。     

成年骨髓间质干细胞体外诱导分化成神经细胞研究

目的：探索成年骨髓间质干细胞（ABMMSC）诱导分化为神经细胞（神经元和神经胶质细胞）的可行性，为ABMMSC在神经科学领域内的应用提供 参考。方法：以成年犬ABMMSC为实验对象，利用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（FGF）、维甲酸（RA）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）等作为增殖及分化诱导因子，采用两步法进行增殖培养，分化诱导；免疫细胞化学法进行细胞性质鉴定。结果：加入bFGF、EGF后增殖培养48h，换液、去除非粘附细胞，再增殖培养72h ,可见细胞分裂相（成纤维细胞样细胞）和簇样克隆形成（中小型细胞）。加入RA、BDNF、GDNF诱导3d，部分细胞有神经元特异性烯醇酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）成分表达；第10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成。经细胞成分（NSE、GFAP）鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论：ABMSC在体外培养条件下，经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用，可以向神经元、神经胶质前体细胞及其终末细胞方向分化。     

神经干细胞诱导分化神经元培养方法的建立

目的:诱导大鼠神经干细胞(NSCs)向神经元细胞系分化,建立体外培养神经元的模型。方法:从Wistar大鼠胚胎大脑分离、培养NSCs,小剂量碱性成纤维生长因子(bFGF)无血清条件培养基诱导NSCs定向分化,以免疫组化技术检测,与直接培养的海马细胞中NF200阳性细胞数以及神经元生长情况进行比较。结果:应用小剂量bFGF无血清培养基诱导NSCs定向分化7、10d,神经元生长良好,通过免疫组化检测到NF200阳性神经元数量多于直接培养的海马神经元(P<0.01)。结论:应用小剂量bFGF无血清条件培养基对NSCs进行定向诱导分化,培养的神经元生长良好,可作为体外神经元培养模型之一。     

胚胎大鼠嗅神经干细胞的培养及分化特性

目的建立胚胎大鼠嗅神经干细胞(NSCs)体外培养方法,研究其增殖和分化特性.方法采用添加丝裂原的无血清培养基分离、培养胚胎14 d(E14)大鼠嗅球NSCs,应用免疫细胞化学方法鉴定培养的NSCs及自然分化为特异性神经细胞的类型,测定NSCs的生长曲线.结果从E14大鼠嗅球分离、培养出表达nestin,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的NSCs.嗅NSCs的增殖依赖表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),其中EGF的促分裂增殖作用明显优于bFGF.结论从E14大鼠嗅球培养出具有自我增殖和多向分化潜能的NSCs.     

EGF、bFGF、BDNF对大鼠海马神经干细胞增殖和分化的作用

目的：探讨EGF、bFGF、BDNF对大鼠海马神经干细胞（neural stem cells,NSCs)增殖和分化的作用。方法：建立大鼠海马NSCs原代和克隆培养模型，将EGF、bFGF单独或联合加入培养基中，应用相差显微镜及Nestin、GFAP、NSE免疫组织化学方法观察其对NSCs克隆形成及分化的影响，取EGF、bFGF联合作用传3代的NSCs进行贴壁培养，同时加入BDNF，观察其对NSCs定向分化的影响。结果：EGF促进海马NSCs增殖，但选移和分化少见；bFGF作用下NSCs迁移和分化明显；EGF、bFGF联合作用可形成大的NSCs克隆；EGF、bFGF、BDNF共同作用下可见典型的神经元样细胞，NSE染色阳性。结论：EGF促进大鼠海马NSCs的增殖，bFGF则主要促进其迁移和分化，BDNF可促进EGF、bFGF联合作用的NSCs定向分化为神经元。     

人脐血单个核细胞体外定向诱导向神经干细胞分化

背景：有文献报道应用不同的诱导剂如细胞生长因子和神经营养因子等，可将人脐血单个核细胞体外诱导为神经干细胞和/或成熟神经细胞，但诱导剂的使用方法以及剂量却各不相同。 目的: 联合应用不同的诱导剂将人脐血单个核细胞体外诱导分化为神经干细胞，并进行形态学观察和鉴定，以确定最佳诱导剂组合及最佳浓度。 设计、时间及地点：观察对比实验，于2007-05/2008-09在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成。 材料：新鲜脐血来源于足月分娩的健康孕妇。 方法:体外分离培养人脐血单个核细胞，在无血清DMEM/F12培养液中添加不同组合的诱导因子进行单个核细胞的诱导，以确定最佳诱导因子组合：①10μg/L神经生长因子(nerve growth factor，NGF)+ 体积分数为0.01 神经营养因子N2+体积分数为0.02 神经营养因子B27。②10μg/L NGF+ 10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)+体积分数为0.01 神经营养因子N2+体积分数为0.02 神经营养因子B27。③10μg/L bFGF+10μg/L表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)+体积分数为0.01 神经营养因子N2+体积分数为0.02神经营养因子B27。④10μg/L bFGF+10μg/L EGF。同时在无血清DMEM/F12培养液中添加不同浓度的bFGF和EGF进行单个核细胞的诱导，以确定最佳诱导浓度：①5μg/L bFGF+ 5μg/L EGF组。②10μg/L bFGF和10 μg/L EGF组。③20μg/L bFGF和20μg/L EGF组。 主要观察指标：①倒置荧光显微镜下观察脐血单个核细胞及各诱导剂组诱导分化为神经干细胞的形态特征。②免疫荧光检测10 μg/L bFGF和10μg/L EGF组神经干细胞巢蛋白nestin的表达情况。③流式细胞仪检测10μg/L bFGF和10μg/L EGF组诱导第7天和第15天的细胞nestin表达情况。 结果：①分离培养的脐血单个核细胞呈散在的圆形生长。②至诱导第7天，分化细胞出现突触样结构和生长端样结构，并可见多个细胞之间形成网络，符合神经干细胞样形态特征。③不同的细胞因子组合诱导的神经干细胞增殖和分化情况不同，含NGF实验组细胞长势相对最差，含bFGF和EGF实验组的细胞长势最旺盛，胞体较大而圆，细胞突起也粗大，呈三角形或锥形，突触样结构和生长端样结构明显可见，为最佳诱导因子组合。④10μg/L bFGF+10μg/L EGF组的细胞密度适中，伸出突起明显，神经细胞形态最特异，培养周期最短，为最适实验浓度。⑤细胞免疫荧光检测10μg/L bFGF+10μg/L EGF组诱导第7天细胞nestin阳性。⑥流式细胞仪分别检测对照组和10μg/L bFGF+10μg/L EGF组诱导第7天、第15天nestin阳性细胞数，差异均具有统计学意义（P < 0.05）。 结论：联合应用10μg/L bFGF和10μg/L EGF可较短时间内定向将人脐血单个核细胞体外诱导分化为神经干细胞。     

bFGF和BDNF对小鼠神经干细胞体外增殖分化的影响

目的观察碱性成纤维生长因子（bFGF）和脑源性神经生长因子（BDNF）对小鼠源性神经干细胞（NSCs）体外增殖及分化的影响。方法用无血清培养与单克隆技术对小鼠胚胎脑组织进行分离、培养,根据培养液中所加营养因子的不同将传代的NSCs分为bFGF组、BDNF组、bFGF＋BDNF组,观察不同组别对NSCs的定向分化作用。结果与bFGF和BDNF组相比,bFGF＋BDNF组细胞分化为神经元的比例较高（P〈0.05）。结论 bFGF可以提高BDNF诱导小鼠NSCs向神经元分化的比例。     

碱性成纤维生长因子和表皮生长因子对脊髓神经干细胞增殖与分化的影响

目的观察碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对胚胎脊髓神经干细胞(NSC)增殖与分化的影响。方法从14 d胚胎大鼠的脊髓组织中分离培养脊髓NSC,并随机分为3组:EGF组、bFGF组和bFGF+EGF组。通过光镜观察不同时间点各组脊髓NSC克隆细胞团数量及直径大小,并采用免疫荧光染色检测各组脊髓NSC向神经元和星形胶质细胞分化的情况。结果①EGF组培养1、3、7 d后NSC克隆细胞团数量和直径均少于bFGF和bFGF+EGF组,差异有统计学意义(P0.05)。而bFGF+EGF组仅在培养1 d时克隆细胞团数量多于bFGF组,在培养3、7 d时差异无统计学意义。②EGF组分化细胞中神经元比例显著少于bFGF和bFGF+EGF组,星形胶质细胞数量明显大于bFGF和bFGF+EGF组,差异有统计学意义(P0.05)。而bFGF和bFGF+EGF组组间差异无统计学意义。结论 EGF对脊髓NSC克隆形成有一定作用,而bFGF能较好地促进克隆细胞团的形成及生长,两者联合应用在培养早期可显著促进克隆细胞团形成。EGF可诱导脊髓NSC更多分化为星形胶质细胞,而bFGF则可促进脊髓NSC向神经元分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经元样细胞分化的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）离体分离和培养方法,探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、全反式维甲酸（RA）、神经营养因子（BDNF）在体外诱导BM—SCs向神经元样细胞分化的作用。方法采用出生3周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,传至第3代时,分为三组：A组,bFGF＋EGF＋RA进行诱导分化;B组,BDNF＋RA进行诱导分化;C组,RA诱导分化。在倒置显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫细胞化学技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）单抗鉴定。结果A组诱导5d后有大部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达。而B组可有部分NSE阳性细胞、C组细胞有少量NSE阳性细胞。结论bFGF＋EGF＋RA、BDNF＋RA和RA均可在诱导BMSCs向神经样元细胞分化,bFGF＋EGF＋RA组更优于和BDNF＋RA组及RA组。     

成鼠骨髓基质细胞分化为神经元的体外研究

目的 :通过一定的培养条件 ,使骨髓基质细胞 (BMSC)分化为神经元和胶质细胞。方法 :以含有 EGF、b FGF的培养液培养 BMSC,经传代、换液去除杂质细胞 ,撤掉 EGF、 b FGF并加胶质细胞条件培养液及 BDNF,待细胞分化后进行形态学观察及 NSE、 GFAP染色。结果 :撤掉 EGF、 b FGF并加 BDNF,胶质细胞条件培养液后 2天可见分化细胞 ,NSE阳性细胞占细胞总数的 38.47± 3.2 7% ,GFAP阳性细胞占细胞总数的 5 0 .73± 3.2 6 % ,GFAP阳性细胞占细胞总数的 5 0 .73± 4.6 5 %。结论 :本实验通过 EGF、 b FGF及适宜的培养液成功对骨髓基质细胞进行定向 ,使其转化为神经干细胞并最终诱导其分化为神经元和胶质细胞     

人胚脑与脊髓神经干细胞体外生物学特性的差异

目的:探讨人胚脑源性神经干细胞和脊髓源性神经干细胞的体外培养和分化的差异。方法:从人胚脑组织和脊髓组织中分离培养神经干细胞,分为EGF组、bFGF组、EGF±bFGF组,在连续传代过程中观察并比较神经干细胞体外培养特性的差异:用血清诱导神经干细胞分化,观察其分化状况的不同。结果:从人胚脑组织分离的细胞在bFGF 单独存在时无法形成神经球,在EGF或EGF±bFGF存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球;从人胚脊髓组织分离的细胞在EGF单独存在时无法形成神经球,在bFGF单独存在时只形成少量神经球,在EGF±bFGF存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球。同样在EGF±bFGF存在的情况下,脑源性于细胞的增殖速度较快。经血清诱导后,脑组织来源的干细胞分化为NSE阳性细胞数明显多于脊髓组织来源的干细胞,二者之间的差异具有显著性(P<0．05)。结论:脑源性和脊髓源性神经干细胞在生长和分化方面有明显差别:脑源性神经干细胞可在bFGF或EGF士bFGF存在的情况下长期传代,而脊髓源性神经干细胞只能在EGF±bFGF存在的情况下长期传代,脑源性干细胞的增殖能力明显高于脊髓源性干细胞;脑源性干细胞较脊髓源性干细胞更易分化为神经元。     

Hepatocyte growth factor promotes proliferation and neuronal differentiation of neural stem cells from mouse embryos

Hepatocyte growth factor (HGF), originally cloned as a hepatocyte mitogen, has recently been reported to exhibit neurotrophic activity in addition to being expressed in different parts of the nervous system. At present, the effects of HGF on neural stem cells (NSCs) are not known. In this study, we first report the promoting effect of HGF on the proliferation of neurospheres and neuronal differentiation of NSCs. Medium containing only HGF was capable of inducing neurosphere formation. Addition of HGF to medium containing fibroblast growth factor 2 or epidermal growth factor increased both the size and number of newly formed neurospheres. More neurons were also obtained when HGF was added in differentiation medium. In contrast, neurosphere numbers were reduced after repeated subculture by mechanical dissociation, suggesting that HGF-formed neurospheres comprised predominantly progenitor cells committed to neuronal or glial lines. Together, these results suggest that HGF promotes proliferation of neurospheres and neuronal differentiation of NSCs derived from mouse embyos.     

食蟹猴脑室下区成体神经前体细胞培养及鉴定

目的分离、培养成年食蟹猴脑室下区神经前体细胞并研究其生物学特性。方法取成年食蟹猴脑室下区组织,经木瓜蛋白酶和脱氧核糖核酸酶消化后,接种于DMEM-F12无血清培养基中。结果神经前体细胞可以增殖形成神经球,经免疫细胞化学方法检验这些细胞呈现巢蛋白nestin阳性,神经球分化后的细胞表达胶质细胞的标记物及神经元的标记物。脑室下区来源的神经球进行自主分化时可分化成神经元和胶质细胞,但分化成神经元的比例都很少。结论从食蟹猴脑室下区分离培养的细胞可以在体外增殖形成神经球,并可分化为神经元和胶质细胞,符合神经前体细胞的生物学性状。     

人小龄胚胎神经干细胞的分离培养、扩增及鉴定

目的 探索人胚胎神经干细胞的体外分离培养条件，从而在体外大量扩增神经干细胞；并观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎脑分离神经干细胞，部分细胞冻存，另一部分细胞进行体外培养。采用无血清培养液，加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激细胞增殖，进行体外扩增、传代培养。采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元及胶质细胞。结果 从人胚胎脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经干细胞球，这些神经干细胞球可在体外扩增及传代培养。免疫荧光法鉴定神经干细胞球中大部分为神经上皮干细胞蛋白(nestin)表达阳性细胞。贴壁后可以分化出神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性的细胞。经冻存后的胎脑细胞也能培养出具有同样特征的神经干细胞。结论 在含有EGF和bFGF的无血清培养液中，从人胚胎脑能分离培养出神经干细胞，并能在体外大量扩增。这为人类神经干细胞的进一步研究和应用提供了材料。     

Effects of Epimedium flavonoids on proliferation and differentiation of neural stem cells in vitro

Abstract

Objective: The purpose of this study is to investigate the effects of Epimedium flavonoids (EF), which is extracted from a traditional Chinese Epimedium herb, and its effect on the proliferation and differentiation of neural stem cells (NSCs) in vitro.

Methods: The single cells isolated from the hippocampi of 1 day old neonatal rats were cultured in a serum-free condition medium DMEM/F12 (1 : 1) with different concentrations of EF or 20 ng/ml epidermal growth factor (EGF) and 10 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF). After 7 and 28 days, the neurospheres' diameters were measured. The formed neurospheres were cultured in the differentiation medium containing EF or 10% fetal bovine serum (FBS). After 12 hours and 7 days, immunofluorescent studies for nestin, Musashi-1, BrdU, β-III-tubulin, NF-200 and GFAP were performed. The number and lengths of 10–15 axons of NF-200 immunopositive cells were measured.

Results: The results showed that the isolated cells had the ability to propagate as neurospheres in the medium with 200 and 400 m g/ml EF, but without any EGF or bFGF, and the volume of neurospheres increase gradually from 7 to 28 days. In comparison with FBS control, the number of NF-200 positive neurons had significantly increased in the EF groups where the newborn neurons were morphologically more mature and able to migrate farther away from neurospheres than in the FBS control.

Discussion: The results demonstrate that EF effectively promotes the proliferation and differentiation of NSCs in vitro, suggesting that EF may have new properties of regulating central nervous system function by neurogenesis.     

bFGF and heparin but not laminin are necessary factors in the mediums that affect NSCs differentiation into cholinergic neurons

OBJECTIVES: Neural stem cells (NSCs) are self-renewed, pluripotent cells that can differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Cholinergic neurons are an important kind of neurons that play an essential role in the treatment of Parkinsonism and epilepsy. We are interested in how different mediums affect NSCs differentiation into cholinergic neurons. METHODS: NSCs were isolated from the striatum corpora of embryonic brain in a 14-day pregnant rat. Cells were cultured in basic mediums [F12/DMEM (1:1) including 1% B27 (v/v) and 20 ng/ml EGF] but with different combinations of three supplements: bFGF (20 ng/ml), heparin (5 mug/ml) and laminin (1 mug/ml). After 7 days culturing, cells were immunized with choline acetyltransferase (ChAT), a marker enzyme of cholinergic neuron. RESULTS: We found ChAT could not be detected in the basic mediums with only one supplement. Then, we tested the combination of two out of three. We found that ChAT positive cells could only be detected in the medium with bFGF and heparin (FH). However, when we added the laminin into the FH, more ChAT positive cells appeared. DISCUSSION: This finding suggests that bFGF and heparin are essential in the mediums that affect NSCs differentiation into cholinergic neurons, and laminin is an important positive factor in this process.     

Comparative analysis of in vitro conditions for rat adult neural progenitor cells

Various protocols have been published for in vitro expansion and maintenance of adult neural progenitor cells (ANPC). However, there are only few data comparing these protocols regarding their influence on proliferation, migration and differentiation. Freshly isolated ANPC from olfactory bulb (BO) and dentate gyrus (DG) of adult rat brains forming neurospheres and expressing the neural stem cell markers nestin and Sox-2 were used in a comparative analysis of five different medium combinations. Medium containing N2 and fetal calf serum (FCS), but no additional cytokines was unsuitable for an effective long-term expansion of ANPC due to a significantly reduced proliferation rate. Media containing BIT, basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor AB (PDGF-AB) and leukemia inhibitory factor (LIF) or B27, bFGF and EGF are recommendable for the cultivation of DG-derived ANPC as neurospheres only. Unlike, culture media containing BIT, bFGF, EGF and PDGF-AB or N2, bFGF and EGF were suitable for all applications tested as they responded similarly regarding proliferation, migration and expression of differentiation markers. The results of the present study might help to improve the effective in vitro expansion of ANPC derived from rare human tissue samples.