IL—6和B7双基因转染的小鼠EL—4肿瘤细胞诱导抗肿瘤免疫作用

目的：探讨ＩＬ－６和Ｂ７双基因转染的小鼠疫苗是否具有协同的抗肿瘤效应。方法：利用含小鼠Ｂ７分子和人ＩＬ－６分子ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体ｐＬｍＢ７ＳＮ和ｐＬｈＩＬ－６ＳＮ分别转染包装细胞株ＣＲＩＰ,经Ｇ１８抗 筛选后以吸Ｂ７或ＩＬ－６外源基因的病毒颗粒感染小鼠ＥＬ－４胸腺癌细胞,观察ＥＬ－４－ＩＬ－６、ＥＬ－４－Ｂ７、ＥＬ－４－ＩＬ６＋Ｂ７细胞在同基因宿主体内的致瘤性及作为抗肿瘤疫苗的能力。结果：相     

B7—1基因转当小鼠EL—4淋巴瘤细胞体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素

目的 研究Ｂ７－１基因转染小鼠ＥＬ－４淋巴瘤体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素－２。方法 以ＣＴＩＬ－２细胞检测ＥＬ－４Ｂ７－１＾＋免疫小鼠的脾细胞与癌细胞共育的ＭＬＴＣ培养上清中的ＩＬ－２活性。结果 ＥＬ－４Ｂ７－１＾＋免疫小鼠的ＳＰＬ经瘤细胞在体外刺激可诱生出明显的ＩＬ－２活性,而ＥＬ－４免疫小鼠的ＳＰＬ则无此作用,两者具有较明显的差异（Ｐ〈０．０１）。结论 Ｂ７－１基因转染小鼠ＥＬ－４淋巴瘤可在体外诱导免疫小鼠脾细胞产生较高水平的白细胞介素－２。     

联合应用白介素2和白介素6基因转染瘤苗抗肿瘤的实验研究

为了提高细胞因子基因转染瘤苗治疗肿瘤的效果，本实验观察了联合应用白细胞介素２（ＩＬ－２）基因转染瘤苗和白细胞介素６（ＩＬ－６）基因转染瘤苗治疗黑色素瘤实验性肺转移小鼠的效果，结果表明，联合治疗组荷瘤小鼠的肺转移结节数显著地少于单用瘤苗治疗组，其存活期也显著长于单一瘤苗治疗组，其脾脏细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）活性、天然杀伤细胞（ＮＫ）活性、淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ）活性以及ＩＬ－２和ＴＮＦ分泌水平均非常显著地高于单一瘤苗治疗组水平。实验结果说明，ＩＬ－２基因转染瘤苗与ＩＬ－６基因转染瘤苗联合应用后，能更有效地激活免疫功能达到更佳的抗肿瘤效果。     

IL-6和B7双基因转染的小鼠EL-4肿瘤细胞诱导抗肿瘤免疫作用

目的:探讨IL-6和B7双基因转染的小鼠肿瘤疫苗是否具有协同的抗肿瘤效应.方法:利用含小鼠B7分子和人IL-6分子cDNA的逆转录病毒载体pLmB7SN和pLhIL-6SN分别转染包装细胞株CRIP,经G418抗性筛选后以含有B7或IL-6外源基因的病毒颗粒感染小鼠EL-4胸腺瘤细胞,观察EL-4-IL-6、EL-4-B7、EL-4-IL-6+B7细胞在同基因宿主体内的致瘤性及作为抗肿瘤疫苗的能力.结果:相对亲本肿瘤细胞EL-4而言,单基因和双基因转染的EL-4细胞在小鼠体内的生长速度均明显减慢,小鼠存活时间均有一定延长,3种转基因的EL-4细胞经X-射线灭活后免疫小鼠,虽均未能阻止随后接种的EL-4细胞的生长,但小鼠存活时间都明显延长,IL-6和B7双基因转染的EL-4肿瘤细胞在抗肿瘤活性方面与IL-6或B7单基因转染的EL-4细胞差异无显著性.结论:与单基因表达疫苗比较,双基因表达疫苗没有表现出协同的抗肿瘤效应.     

BCG对Th细胞免疫调节作用的研究

目的探讨BCG对小鼠Th1/Th2细胞免疫反应的调节作用,研究BCG是否增强小鼠Th1型免疫反应.方法将实验动物分为对照Ⅰ组、BCG14组、对照Ⅱ组、BCG42组.BCG14组、BCG42组给予BCG每次0.03 mL, 隔日1次腹部皮下注射,对照组注射相同剂量的生理盐水.第14天,将对照Ⅰ组、BCG14组分别处死取脾脏,BCG42组则继续行BCG免疫,至第42天对照Ⅱ组及BCG42组处死取脾脏.用ELISA法测定脾脏单个核细胞（MNCs）培养上清液中IL-4、IL-5、IFN-γ含量.结果 BCG14组、BCG42组IFN-γ水平较对照组明显增加（t=3.73、3.86,P〈0.01）.BCG14组IFN-γ水平与BCG42组比较差异无显著性意义（t=1.68, P〉0.05）.其他两项指标与对照组比较差异无显著性（t=1.05～1.17, P〉0.05）.结论 BCG能上调小鼠Th1型免疫反应.     

B7—1基因转染小鼠EL—4淋巴瘤细胞的致瘤性研究

目的研究Ｂ７１基因转染小鼠ＥＬ４淋巴瘤细胞的致瘤性，为制备基因转染瘤苗提供实验依据。方法将Ｂ７１基因转染小鼠ＥＬ４淋巴瘤细胞后，用Ｇ４１８选择和克隆的方法获得高表达Ｂ７１分子的ＥＬ４Ｂ７１＋细胞，然后进行小鼠的体内致瘤试验。结果ＥＬ４Ｂ７１＋细胞接种小鼠后，与野生型ＥＬ４（ＥＬ４Ｗｔ）相比，肿瘤结节形成时间和荷瘤小鼠存活时间明显延长，ＥＬ４Ｂ７１＋细胞协同ＩＬ２接种小鼠后，效果更加显著。结论Ｂ７１基因转染小鼠ＥＬ４淋巴瘤细胞的致瘤性比野生型ＥＬ４（ＥＬ４Ｗｔ）低。     

甘草酸对免疫诱导再生障碍性贫血小鼠骨髓造血功能的影响

目的:探讨甘草酸对免疫诱导再生障碍性贫血(再障)小鼠骨髓造血功能的影响,寻求治疗免疫诱导再障的方法。方法:BALB/c小鼠72只,适应性喂养1周后,随机分为实验组(64只)及正常对照组(8只)。实验组小鼠首先制造再障模型。将制模后小鼠再分为模型对照组(40只)及甘草酸组(24只)。将甘草酸组再分为低、中、高剂量组,每组8只,低、中、高剂量组小鼠每天经灌胃分别给予10、20、30mg/(kg.d)甘草酸,连续14 d,于第15天脱臼处死小鼠,分别检测血象、骨髓单个核细胞(BMNC)、CFU-GM、BFU-E,用原位末端标记法(TUNEL)测定胸腺淋巴结混合细胞、骨髓单个核细胞、外周血单个核细胞凋亡率。其余40只模型对照组小鼠每天经灌胃给予等体积生理盐水,并分别于第3、5、7、10、15天各处死一批次小鼠。8只正常对照组小鼠只给予等体积生理盐水。检测指标同上。结果:甘草酸组WBC、Hb、BMNC、CFU-GM、BFU-E明显高于模型对照组(P<0.05,P<0.01),且具有剂量-效应关系。模型对照组骨髓单个核细胞凋亡率、胸腺淋巴结混合细胞凋亡率、外周血单个核细胞凋亡率均高于正常对照组(P<0.01)。甘草酸组骨髓单个核细胞凋亡率高于正常对照组(P<0.01)而低于模型对照组(P<0.01),外周血单个核细胞凋亡率高于正常对照组及模型对照组(P<0.05,P<0.01),胸腺淋巴结混合细胞凋亡率高于正常对照组(P<0.01)。结论:甘草酸通过促进成熟淋巴细胞凋亡而有助于免疫诱导再障小鼠骨髓造血功能的恢复。     

白介素-18对树突状细胞瘤苗的抗肿瘤作用

目的：进一步提高树突状细胞（DC）瘤苗的抗肿瘤作用。方法：以腺病毒为载体转染目的基因至DC，研究DC瘤苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用。分别以乳酸脱氢酶（LDH）释放法、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、自然杀伤细胞（NK）活性和细胞因子的分泌水平。结果：IL-18／gp100-DC瘤苗对荷瘤小鼠具有显著的治疗作用。IL-18／gp100-DC瘤苗治疗后，能明显增强CTL和NK活性，提高IFN-r和IL-2的分泌水平，使体内肿瘤细胞发生明显坏死，瘤体及瘤周有大量炎性细胞浸润。CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞为发挥抗肿瘤作用所必须，NK细胞也起到一定的作用。结论：辅助性T细胞1（Th1）型细胞因子IL-18基因修饰的gp100-DC瘤苗能有效地诱导抗肿瘤免疫反应。     

白细胞介素12基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用

目的：研究白细胞介素12（IL-12）基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用。方法：用含IL-12基因的腺病毒载体,在体外以不同感染系数感染Lewis肺癌细胞,并分别接种于C57BL/6小鼠皮下,观察其致瘤性的变化;并用Lewis肺癌细胞及B16黑色素瘤细胞再 次攻击免疫后的C57BL/6小鼠,观察肿瘤发生情况。 结果：以各种感染系数AdCMVIL-12制备的瘤苗,接种于小鼠皮下后,无肿瘤生长,完全消除了Lewis肺癌细胞的致瘤性;瘤苗注射6 d后,用Lewis肺癌细胞再次攻击,仍无肿瘤生长,抑瘤率达100%;用B16黑色素瘤细胞攻击,10~12 d均有肿瘤生长,说明此瘤苗具有肿瘤特异性。结论：AdCMVIL-12能消除Lewis肺癌细胞的致瘤性,并能诱导显著的抗肿瘤免疫反应,对肿 瘤的复发及转移有较好疗效。     

大蒜油对辐射致小鼠白细胞减少的预防作用

目的：研究大蒜油对辐射引起的白细胞减少的预防作用，并初步探讨其作用机制。方法：雄性BALB/c小鼠120只，按外周血白细胞数量随机分为6组：正常对照组、辐射模型组、碳酸锂阳性对照组、大蒜油低、中、高剂量组。观察小鼠接受辐射前后外周血白细胞数量的改变以及脾脏系数、脾结节计数和骨髓DNA含量的变化。结果：与辐射模型组相比，大蒜油低、中、高剂量组外周血白细胞数量分别升高了51%、59%和350%，大蒜油中、高剂量组骨髓DNA含量分别增加了56%和82%，大蒜油中、高剂量组脾脏系数分别增加了20%和39%，大蒜油低、中、高剂量组小鼠脾结节计数分别升高了41%、65%和71%(P均＜0.05)；与碳酸锂阳性对照组相比，大蒜油高剂量组白细胞数量升高了117%，脾脏系数增加了17%(P＜0.05)。结论：大蒜油对辐射引起的白细胞减少有一定的预防作用，且效果优于升白细胞药物碳酸锂；其机制可能是刺激骨髓增生造血，同时刺激脾脏和脾结节增生造血。     

双表达B7-1、B7-2基因肿瘤疫苗治疗小鼠肝癌优于单表达疫苗的研究

目的:研究B7-1、B7-2基因对肿瘤的免疫治疗作用。方法:应用转染有B7-1、B7-2基因的肝癌细胞株H22/B7-1、H22/B7-2,建立小鼠肝癌模型,观察小鼠成瘤期、荷瘤小鼠存活期及肿瘤结节大小。结果:各实验组动物都发生肿瘤,接种H22/B7-1 H22/B7-2组成瘤率低,对照组动物肿瘤呈进行性生长;组间成瘤潜伏期不同,与对照组相比,凡接种有H22/B7-2的小鼠肿瘤形成有迟发性;接种转B7基因细胞的小鼠肿瘤生长都较对照组慢;同时接种H22/B7-1和H22/B7-的小鼠能负载大于107的肿瘤细胞。转基因细胞在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导CTLs的能力明显增强。结论:B7-1、B7-2都能增强肝癌细胞的免疫原性。B7-2在抗肿瘤早期发挥作用,B7-1随后起放大和调节作用。B7-1与B7-2联用效果优于单一应用。     

Induction of anti-hepatoma immunity by recombinant retrovirus expressing B7-1 /B7-2 costimulatory molecules

The effechve activation of ttllnor-specific T cellsPlays a pivotal mle in anti-tUInor inUnwhty. As we haVeknown, T cell elevation ~ires 2 distinct signalingevents. The fial signal is derived from the binding of Tcell receptor (TCR) tO itS antigen-MHC complex, whichspeCified foe inteedon between T cells and talget cells.The seCOnd signal is delivend by accessory or costilnulatory moleCules such as CD28, LFA-l, ICAM-l, and so.Llj. The moSt ~rtant among them is CD28, whichhas been d…     

吸烟对大鼠肺组织B7-1/B7-2及其相关配体表达的影响

目的 通过研究吸烟对大鼠肺组织B7-1/B7-2及其相关配体表达的影响,探讨专职抗原提呈细胞(APC)在吸烟所致肺部慢性炎症发生发展中的作用.方法 将30只健康雄性Wistar大鼠随机分为不吸烟组、吸烟6周组和吸烟12周组,每组10只.采用免疫组化半定量法测定大鼠气道周围肺间质中慢性炎症细胞胞膜B7-1B7-2、CD28和CTLA-4的表达水平.结果 吸烟6周组与吸烟12周组大鼠肺组织B7-1、B7-2、CD28和CTLA-4表达量较不吸烟组均显著增高(P＜0.01),吸烟12周组较吸烟6周组表达量也均增高(P＜0.01),随吸烟时间的延长各指标表达量均呈上升趋势.结论 吸烟可引起大鼠肺组织B7/CD28/CTLA-4表达水平的增高,提示APC可能在吸烟所致肺部慢性炎症发生发展中起重要作用.     

狼疮性肾炎外周血单个核细胞B7-1和B7-2 mRNA表达异常及其与疾病活动的关系

目的观察活动期和静止期狼疮肾炎(LN)外周血单个核细胞(PBMC)B7-1(CD80)和B7-2(CD86)mRNA表达及其与疾病活动的关系,以探讨B7-1和B7-2mRNA表达异常在LN自身免疫发生中的作用及临床意义.方法以正常人为对照,分离15例活动期和13例静止期的LN患者PBMC,采用半定量反转录PCR的方法,检测PB-MC的B7-1和B7-2mRNA表达.B7-1和B7-2mRNA表达与SLE疾病活动评分指数(SLEDAI)的相关关系用直线相关分析.结果静止期LN组B7-1和B7-2mRNA表达与正常人对照组相比无显著性差异(P＞0.05),活动期LN组B7-1mRNA有明显的上升(P＜0.05),B7-2mRNA表达增高更加显著(P＜0.01).B7-2mRNA的增高与SLEDAI呈直线正相关关系(r＝0.8641,P＜0.05).结论活动期狼疮性肾炎存在着B7mRNA表达的异常,B7-2mRNA的增高与SLEDAI呈直线正相关关系.     

X射线对小鼠腹腔巨噬细胞表达B7-1和B7-2的影响

目的 :观察 X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 1和 B7- 2的影响。方法 :采用免疫组织化学法 ( ABC法 )。结果 :小鼠腹腔巨噬细胞表达 B7- 2达到高峰的时间早于 B7- 1,而且 B7- 2表达幅度也高于 B7- 1。剂量 -效应关系的研究表明 ,B7- 1和 B7- 2的表达均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时也出现一个峰值。但在不同分度分析结果中发现 ,低剂量 X射线照射组的高密度细胞百分数比较大剂量组多。结论 :B7分子的表达上调可能是参与低剂量电离辐射免疫增强效应的重要因素。     

用射线照射的B7-1转基因细胞进行肿瘤疫苗的研究

目的探讨用放射的B71转基因细胞进行肿瘤疫苗疗法的效果。方法将重组人B7-1基因真核表达载体导入CAK-1肾细胞瘤细胞,利用转基因细胞治疗观察其抗肿瘤效果。结果转基因细胞的肿瘤原性较CAK-1／Wt、CAK-1／pCDNA3组明显降低（P〈0．001）。同时免疫原性明显增强,以^60Co照射的CAK-1／B7-1细胞免疫后,小鼠体内诱发了抗CAK-1／Wt的系统性、保护性免疫。用^60Co灭活的转基因细胞作为瘤苗进行实验性治疗,能够延长小鼠的生存时间,减慢肿瘤的生长速度,CAK-1／H7-1的应用提高了肿瘤治疗效果（P〈0．01）。结论放射的转基因细胞及其表达的H7细胞因子可以有效地激发机体的抗肿瘤免疫应答,B71表达肿瘤细胞应用可以成为一种很有前景的肿瘤疫苗。     

Expression of co-stimulatory molecules B7-2 and PD-L1 on peripheral blood mononuclear cells in patients with chronic hepatitis B virus infection

Objective

To explore the roles of the expression of the co-stimulatory molecule, B7-2, and the co-inhibitory molecule, PD-L1, on peripheral blood mononuclear cells in the mechanism of immunotolerance in chronic hepatitis B virus infection.

Methods

Thirty HBV infected patients in the immunoreactive phase and 20 patients in the immunotolerant phase were enrolled in the study, while 20 healthy volunteers were used as controls. RT- PCR and real-time PCR methods were used to detect the expression levels of B7-2 and PD-L1 mRNA in peripheral blood mononuclear cells in chronic HBV infected patients.

Results

The B7-2 expression in immunoreactive and immunotolerant patients was significantly lower than that in the controls (P all < 0.01); B7-2 expression in immunoreactive patients was significantly lower than in immunotolerant patients (P < 0.01). PD-L1 expression in immunoreactive patients and immunotolerant patients was significantly higher than that in normal controls (P all < 0.01). The PD-L1/B7-2 ratios in immunoreactive and immunotolerant patients were significantly higher than that of the healthy controls (P all < 0.01); the PD-L1/B7-2 ratio was significantly higher in the immunoreactive patients than in the immunotolerant patients (P < 0.01).

Conclusion

In chronic HBV infection, changes in the expression of co-stimulatory and co-inhibitory molecules imply a protective adjustment against the patient's immune response that may result in increased immunotolerance and persistent HBV infection.     

B7-1基因转染抑制胃癌生长和转移的实验研究

目的:研究B7-1基因转染胃癌细胞对人胃癌生长和转移的影响.方法:将重组质粒B7-1pcDNA3.1(+)和空载体pcDNA3.1(+)分别转染SGC-7901细胞(简称S),用G418筛选分别建立稳定转染细胞株SGC-7901/B7-1pcDNA3.1(+)(简称S-B)和SGC-7901/pcDNA3.1(+)(简称S-P).RT-PCR和流式细胞术分别从mRNA和蛋白水平检测B7-1基因表达,检测细胞周期分布,计算细胞增殖指数.分离人外周血单个核细胞(PBMC),分别与S-B、S-P、S共培养,检测PBMC黏附力和杀伤力,检测胃癌细胞凋亡情况.将S-B、S-P、S分别接种于BALB/c裸鼠胃大弯侧,观察B7-1基因转染对胃癌生长及淋巴转移的影响.结果:S-B高表达B7-1基因,S-P和S不表达B7-1基因.S-B、S-P、S增殖指数无显著差异.S-B与PBMC黏附力和杀伤力均明显高于S-P和S,而S-P与s无显著差异.种植S-B小鼠成瘤率和转移率均低于S-P和S,HE染色见淋巴细胞广泛浸润于S-B种植形成肿瘤组织及转移淋巴结.结论:B7-1基因提高胃癌细胞免疫原性抑制胃癌生长和淋巴转移.     

人B7-1 cDNA的克隆及鉴定

目的:克隆人B7-1全长cDNA以构建相应腺病毒表达载体。方法:根据B7-1基因序列设计并合成可扩增B7-1 cDNA的特异性引物,用RT-PCR法从骨髓细胞总RNA中扩增B7-1 cDNA,并克隆至pGEM-T载体中,经酶切鉴定后再行序列分析。结果:逆转录多聚酶链反应扩增产物长度与预期的889 bp一致;用M13正、反向引物行序列测定,证实克隆出的序列与GenBank的B7-1 cDNA序列完全一致;人B7-1全长cDNA被成功地插入到质粒pGEM-T中。结论:克隆人B7-1全长cDNA为构建相应腺病毒表达载体及应用B7-1行肿瘤免疫基因治疗提供了可能性。