EHFV微量细胞病变中和试验方法的建立及其在中和抗体检测中的应用

本文报道了一种新的流行性出血热病毒中和抗体检测方法即微量细胞病变中和试验。该法利用流行性出血热病毒在Vero细胞上繁殖时可引起细胞病变的特性，将32－100CCID50病毒液与等量待检出血清混合，37℃中和1．5小时后种入微量培养板孔中的细胞悬液中，培养6－8天后即可判定结果，用该法检测流行性出血热病人血清和灭活疫苗免疫机体后和中和抗体，获得了与空斑减少中和试验法基本一致或者更加敏感的结果。该法简单，特异、准确、敏感、快速、它的推广应用对加我国流行必出血热的血清分型和流行病学调查及疫苗制备毒株的筛选等基础研究工作均有较大的意义。     

肾综合征出血热病毒结构蛋白的纯化及免疫学特性分析

应用从肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者血清中提取的ＩｇＧ与活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ偶联，制备亲和层析柱，用此亲和层析柱从ＨＦＲＳＶ感染的小白鼠乳鼠鼠脑中提取出２种分子量为６７０００和５５０００的病毒结构蛋白。经ＥＬＩＳＡ证明，此病毒结构蛋白能与ＨＦＲＳ患者血清ＩｇＧ及抗ＨＦＲＳ病毒的ＭｃＡｂ反应，效价为１６０。与６株抗ＨＦＲＳＶＭｃＡｈ试验表明，此病毒结构蛋白能与Ｈ７株反应。血凝试验证明，此病毒蛋白不能凝集鹅红细胞、鸽血球和人＂Ｏ＂型血红细胞。将纯化的病毒结构蛋白免疫家兔，证明其有较强的免疫原性，可刺激家兔产生特异性抗体；微量中和试验及乳鼠中和试验证明，中和效价为２５６，说明纯化的病毒结构蛋白具有中和抗原位点；免疫血清对感染乳鼠有一定保护作用。     

单扩溶血技术在禽H5N1流感诊断中的应用

目的 了解单扩溶血技术对禽H5N1流感病毒抗原测定的最佳条件,以便使禽H5N1病毒抗体测定能在普通实验室内进行.方法 比较不同浓度,不同品种红细胞,琼脂糖种类和浓度对测定敏感性的影响,以及对该法的敏感性和特异性与微量中和试验进行了比较.结果 单扩溶血技术测定最佳条件为：病毒浓度为：1000 HA单位/0.1 ml浓鸡红细胞;琼脂糖浓度为：1.0%;补体采用后加法.该法的敏感性和特异性不亚于微量中和试验,同时未发现H1N1,尤其N1抗体对H5N1抗体测定有影响.结论 单扩溶血技术对禽H5N1病毒抗体测定的敏感性和特异性不亚于微量中和试验,并能在普通实验室对大量血清样本进行测定.     

人血清中寨卡病毒微量中和抗体检测方法的建立和应用CSCD

目的 建立人血清寨卡病毒（ZIKV）微量中和抗体检测方法,并用10例经核酸检测和/或病毒分离确诊的寨卡输入病例的急性期和恢复期血清样本进行分析验证.方法 采用分离自输入寨卡病例的寨卡病毒株开展组织培养微量中和抗体测定,在BHK21、VERO和VERO-E6 3种细胞系中选择感染寨卡病毒后能产生典型CPE的细胞系制备病毒储备液,滴定病毒滴度;使用100TCID50的病毒液与连续4倍稀释的经56℃ 30 min灭活的血清于37℃中和2h,然后加入细胞悬液.5％二氧化碳培养箱孵育,逐日观察CPE.结果 BHK21、VERO和VERO-E63种细胞系对寨卡病毒感染的敏感度不同,其中VERO细胞最为敏感,可出现典型的CPE;应用VERO细胞系建立寨卡病毒微量中和抗体检测方法能准确反映寨卡确诊病例急性期和恢复期血清中和抗体水平,并能作为一种特异性诊断方法.结论 寨卡病毒微量中和抗体检测方法不仅可用于人感染寨卡病毒的实验室诊断,还可用于人群血清流行病学调查.     

中国大陆首例人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)病例的实验室诊断

目的 对2005年10月湖南省湘潭市湘潭县发生的一名不明原因肺炎病例进行实验室检测,以确定导致该病例的主要病因.方法 采集病例呼吸道标本以及血清标本,对呼吸道标本利用分子鉴别诊断技术以及RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测病毒核酸;通过血凝抑制试验以及微量中和试验检测血清中的特异性抗体.结果 该病例所有的呼吸道标本H5N1病毒特异性核酸及病毒分离均为阴性.红细胞凝集抑制及微量中和实验显示,恢复期血清较急性期血清H5N1特异性抗体阳转并且有4倍以上增高.结论 通过实验室检测结果分析,该病例为中国大陆第一例人感染高致病性禽流感病毒（H5N1）实验室确诊病例.     

北京株和广州株SARS病毒与非典型肺炎患者血清中和抗体反应观察

目的 研究北京和广州地区分离的SARS病毒的抗原性关系，为非典型肺炎疫苗候选株的筛选提供依据。方法 采用Reed-Muench法测定BJ01和GZ01株病毒的滴度，分别选取北京和广州地区SARS病人血清各6份，采用固定病毒．稀释血清法进行微量细胞交叉中和试验，测定两地病人血清对BJ01和GZ01株病毒的中和抗体水平及交叉中和能力，分析这两株SARS病毒抗原性的差异。结果 北京和广州两地的非典型肺炎病人血清能够中和本地分离的SARS病毒。两地血清可互相交叉中和BJ01和GZ01株SARS病毒。中和抗体水平相同。结论 北京和广州两地分离的SARS病毒BJ01和GZ01株抗原性相似、差异较小。     

用抗个体基因型单克隆抗体在小鼠体内诱导抗Ⅱ型脊髓灰质炎病毒中和抗体

本实验制备了针对Ⅱ型脊髓灰质炎病毒保护性单克隆抗体表面的一个个体基因型的同系抗个体基因型单克隆抗体,2-17C3SCC Ab_2。2-17C3SCC Ab_2识别一个抗原部位相关的种间个体型因型。将用蛋白A-Sepharose从杂交瘤细胞培养上清液中纯化的2-17C3SCC Ab_2注入4～6周龄BALB/C小鼠体内,检测小鼠血清中具有相应个体基因决定簇的抗体的表达。用2-17C3SCC Ab_2免疫小鼠可诱导具有互补特异性的抗体。而且微量病毒中和试验提示,2-17C3SCC Ab_2可以取代抗原的诱导脊灰病毒中和抗体的作用,因而可以作为单克隆抗体基因型疫苗。     

新型冠状病毒抗体检测结果的标准化和平行比较北大核心CSCD

目的通过世界卫生组织(world health organization,WHO)新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)抗体国际标准品(international standard,IS)(G样本)、抗体参考盘(样本E、F、H、I、J)的应用降低SARS-CoV-2抗体检测结果差异、提高检测结果一致性。方法利用基于SARS-CoV-2活病毒的微量中和试验、假病毒中和试验以及商品化的ELISA试剂盒对WHO的SARS-CoV-2抗体IS和参考盘等共10个样本(A~J)分别进行检测,对检测结果进行分析比较。结果以IS为参考品确定其他样本的相对浓度,降低了检测结果之间的差异。假病毒中和试验、ELISA检测血清抗体参考盘结果与基于SARS-CoV-2 HB02株的中和试验基本一致,个别试剂可检测弱阳性样本。结论SARS-CoV-2抗体IS的使用促进了血清学检测方法的标准化,抗体参考盘适用于基于SARS-CoV-2原型株的所有检测方法,假病毒中和试验、ELISA等在一定程度上可作为活病毒中和试验的替代方法。     

肾综合征出血热病毒微量细胞培养法和空斑法的比较

对肾综合征出血热病毒的微量细胞的培养法和空斑法进行了比较。４株ＨＦＲＸ病毒及３株特异性ＭｃＡｂ的测定结果表明，微量细胞培养法测量的病毒滴度高于空斑法，但后者检测ＭｃＡｂ的中和效价却高于前者。     

H5N1禽流感病毒HA假病毒的构建及特性研究

目的 构建包膜蛋白为H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,对其生物学特性进行研究,并将其初步应用于H5N1禽流感病毒的血清检测.方法 将我国分离的高致病性H5N1禽流感病毒的HA基因插入真核表达质粒,得到pLP-HA,与假病毒构建体系的三种质粒pLP1,pLF2和pEmGFP,瞬时共转染人胚肾细胞293T,48 h收集假病毒上清,对其感染性,血凝活性进行测定,并应用于微量中和实验.同时,构建了优化HA基因的假病毒以及一株含有越南禽流感病毒HA基因的假病毒,进行比较.结果 电镜下观察到假病毒颗粒的存在;Western-Blot表明HA蛋白存在于假病毒颗粒中;HA假病毒与野生型活病毒的微量中和实验相比,两者结果具有很好的相关性.结论 成功构建了不同高致病性H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,所构建的假病毒可以应用于微量中和实验.研究发现不同禽流感病毒株HA蛋白假病毒的包装效率不同,并且真核表达优化基因并不能显著提高假病毒颗粒包装效率.     

单克隆抗体免疫斑点试验用于脊髓灰质炎病毒定型的初步研究

血清中和试验是目前唯一公认的肠道病毒定型方法,因为在其它血清学实验系统中,异型肠道病毒之间存在着交叉反应。近年来,我们实验室获得了在非中和血清学实验系统中仍具有型特异性的抗肠道病毒的单克隆抗体,为非中和血清学实验用于肠道病毒定型提供了可能性。本文报道用免疫斑点试验进行脊髓灰质炎病毒定型研究的     

柯萨奇病毒B 组5 型VP1 蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测。方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白。用His Trap HP亲和层析柱纯化重组蛋白,以纯化的目的蛋白为抗原,免疫雄性SD大鼠获得VP1蛋白多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,微量中和实验测定抗体的中和活性,Western blot检测抗体的特异性,免疫组化检测抗体对组织中抗原的识别。结果:成功构建了VP1-pET-28a重组载体,并且在BL21细胞中成功诱导表达,亲和层析柱纯化后蛋白纯度大于90%。ELISA测得抗体的效价为1∶128 000,微量中和实验显示抗体没有中和活性,Western blot分析显示抗体能与CVA16和EV71交叉反应,免疫组化实验表明抗体能够识别组织中的CVB5抗原。结论:本研究成功制备了CVB5 VP1蛋白的高效价的多克隆抗体,为CVB5病毒疫苗和病毒诊断的研发提供了有效的工具。     

汉滩病毒G2重组腺病毒的表达及其基因免疫的研究

目的:在VeroE6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(AdenoG2),并探讨其诱导免疫应答特性。方法:以HTNVAdenoG2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物。以表达产物免疫BALB/c小鼠后,用ELISA、微量细胞培养中和试验及淋巴细胞增殖试验检测体液及细胞免疫应答。结果:用HTNVAdenoG2感染VeroE6细胞后,可检测到HTNV糖蛋白G2的表达。用HTNVAdenoG2免疫小鼠后,可诱导产生抗HTNV糖蛋白G2的特异性抗体,抗体效价为1∶40。微量细胞培养中和试验的结果表明,HTNVAdenoG2还可刺激小鼠产生低水平的中和抗体;但淋巴细胞的增殖反应不明显。结论:在VeroE6细胞中成功地表达了HTNV糖蛋白G2。以HTNVAdenoG2免疫小鼠后,主要刺激小鼠产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,而特异性的细胞免疫应答不明显。本研究结果为HTNV基因工程疫苗的研制提供了实验依据。     

肠道病毒71型与脊髓灰质炎病毒抗体交叉反应性研究

通过临床血清样本研究及实验动物验证,探讨肠道病毒71型(EV71)与脊髓灰质炎病毒(PV)之间的抗体交叉反应性。以酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测健康儿童血清中IgG型抗体与EV71及PV的反应性;用原核表达与亲和纯化等方法分别获得EV71和PV的衣壳蛋白VP1及非结构蛋白3C;将PV-VP1、EV71-VP1、EV71灭活疫苗及PV灭活疫苗(IPV)分别经皮下免疫BALB/c小鼠制得免疫血清,以蛋白免疫印迹实验分别研究PV-VP1或EV71-VP1小鼠阳性血清与EV71-VP1和PV-VP1的反应情况,进一步以竞争ELISA试验分别研究EV71-VP1对PV-VP1与其特异性免疫血清特异结合的影响。微量中和试验研究PV阳性抗血清对EV71的体外中和效应。结果:已接种PV疫苗但未曾感染EV71的健康儿童的IgG抗体与EV71有较高的反应性,且针对EV71及PV两种病毒的IgG抗体的相对含量成正相关;蛋白免疫印迹实验显示PV-VP1与EV71-VP1免疫的小鼠抗血清中存在交叉抗体,竞争ELISA试验进一步表明EV71-VP1蛋白能明显抑制PV-VP1与其特异性免疫血清抗体的结合,反之亦然。但中和实验揭示PV阳性血清在体外不能中和EV71病毒。PV之间存在大量交叉反应性抗体,但PV免疫后产生的与EV71交叉反应的抗体是非中和性质抗体。非中和抗体可能通过免疫调理效应在EV71病毒的致病的过程中发挥重要作用。     

用单克隆抗体作柯萨奇病毒A24型抗原分析

用我国分离的一株C A24 V制备的单克隆抗体,对10株C A24病毒作了抗原分析。8个荧光阳性的单抗对所试验的9株C A24 V均呈现明显荧光反应,其中4个对C A24原型株荧光试验也阳性,另4个则为阴性。5个具有中和作用的单抗均不中和C A 24原型株,其中一个单抗对新加坡E H24/70株有低滴度中和,3个单抗中和日本分离的二株病毒及我国1986年福建分离的一株病毒。而所有这5个单抗均中和我国1986年从河南、上海分离的二株病毒及1988年从北京、辽宁和福建分离的三株病毒。     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1的构建及免疫效果研究

目的:构建巨噬细胞源趋化因子(Macrophage-derived chemokine,MDC)与柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)VP1融合基因腺病毒载体疫苗Ad/MDC-VP1,并观察对小鼠的免疫效果.方法:利用AdEasy-1系统构建重组腺病毒Ad/MDC-VP1及腺病毒Ad,并检测融合蛋白MDC-VP1的表达.BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组,每组18只,分别肌肉注射Ad/MDC-VP1和Ad,免疫2次,间隔2周.分别用ELISA法和微量中和试验法检测血清CVB3 VP1特异性IgG抗体和中和抗体;末次免疫后3周,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击后检测小鼠血中病毒滴度并观察保护率.结果:Ad/MDC-VP1和Ad构建成功,并检测到MDC-VP1融合蛋白的表达.Ad/MDC-VP1组血清CVB3 特异性VP1 IgG、中和抗体水平、特异性CTL活性较对照组明显增强(P＜0.01);病毒攻击后实验组血中病毒滴度明显降低,生存率明显高于对照组(P＜0.01).结论:Ad/MDC-VP1能提高小鼠细胞和体液免疫水平,增加病毒攻击后的保护率.     

两种商品化新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒的应用性能评价

目的评价两种商品化新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)中和抗体检测EIA试剂盒的应用性能。方法使用两种商品化SARS-CoV-2中和抗体ELISA检测试剂盒(A和B), 以疫苗免疫前血清44例、免疫后1个月血清120例、COVID-19患者愈后6个月的恢复期血清64例作为样本盘, 进行中和抗体检测, 同时通过活病毒微量中和试验(micro-neutralization test, micro-NT)检测上述血清样本的50%中和抗体滴度(50% neutralization titer, NT50)。分析两种商品化试剂盒与活病毒中和试验在定性及定量结果上的一致性。结果定性结果分析发现, 以micro-NT检测结果作为标准, A和B试剂盒的阳性符合率分别为97.40%和100.00%;阴性符合率分别为97.30%和95.95%;约登指数分别为0.95和0.96。定量结果分析发现, 对于疫苗免疫后样本, A、B试剂盒与micro-NT检测结果的相关系数分别为0.24(P<0.05)和0.5...     

DTaP-sIPV联合疫苗中SabinIPV 免疫原性研究

目的 探讨吸附无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗（DTaP-sIPV）的制备工艺,并比较不同配比的DTaP-sIPV中Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（SabinIPV）三针基础免疫大鼠的中和抗体效价,为确定联合疫苗的最佳制备工艺及抗原剂量配比提供参考.方法 用不同配比的SabinIPV,制备两批DTaP-sIPV,进行各项指标的检定及稳定性试验,并联合单独的Sabin IPV和GSK制备的DTaP-wIPV对56只Wistar大鼠进行3针免疫,每针间隔1个月,每次免疫后30 d采血并分离血清,采用微量中和试验测定血清中抗脊髓灰质炎病毒3个型别的中和抗体效价.结果 两批DTaPsIPV的各项检定指标均符合〈中国药典〉三部（2005版）要求,且稳定性良好.大鼠经3针基础免疫后,其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体的几何平均滴度均显著上升,3针免疫后抗体阳转率已经达到100%.结论 经此制备的DTaP-sIPV安全、稳定、有效,且DTaP-sIPV中的SabinIPV在大鼠中有良好的免疫效果,经3针免疫可产生高水平的中和抗体.     

犬多价高免血清的研制及应用

目的：研制犬多价高免血清用于犬病毒性传染病的紧急预防和治疗。方法：选择1岁以上临床检查健康的昆明狼种犬及部分土犬20，用犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬传染性肝炎病毒(ICHV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPTV)弱毒和强毒多次交叉免疫，颈动脉无菌采血，分离血清，实验室采用微量中和试验、血凝抑制试验来检测抗体效价。结果：应用本制品高免血清在临床上取得了较好的效果。结论：研制成稳定、高效的犬多价高免血清，并获得了较好的经济效益和社会效益。     

快速荧光灶抑制试验的应用和改进

快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)是世界卫生组织(World Health Organisation,WHO)推荐的狂犬病病毒中和抗体检测标准方法,已被应用于狂犬病疫苗免疫效果评估、狂犬病疫苗新型免疫方案评估、狂犬病诊断试剂和方法评估、狂犬病被动免疫制剂评价.对RFFIT的改进包括自动化判读结果和用表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组狂犬病病毒做为攻击病毒,这些改进目前尚未获得广泛应用,传统RFFIT仍然是值得推广的狂犬病病毒中和抗体检测方法.