重组hVEGFl65腺相关病毒载体构建及体外感染骨髓基质干细胞血管内皮生长因子的表达

背景:目前用于基因治疗的病毒载体对机体具有一定免疫原性,且存在潜在感染危险,限制了临床的应用.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,以其作为基因载体感染兔骨髓基质干细胞,体外检测病毒生物学活性及功能.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/11在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:兔骨髓基质干细胞由试验者原代培养,取自成年新西兰大白兔;人脐静脉内皮细胞取自健康产妇婴儿脐带,产妇对本实验知情同意.方法:从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.应用该重组病毒感染体外培养的兔骨髓基质干细胞主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率,感染AAV-HT1080测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.检测重组病毒的感染效率.ELISA法检测培养上清中血管内皮生长因子含量,人脐静脉内皮细胞管状血管形成试验检测血管内皮生长因子蛋白活性.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011 vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.重组病毒rAAV-VEGF165-GFP感染骨髓基质干细胞效率为40%,感染72h后骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子含量达(85.58±5.37)μg/L,分泌的血管内皮生长因子蛋白可以使人脐静脉内皮细胞拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP,该重组病毒能够高效感染兔骨髓基质干细胞并表达血管内皮生长因子,分泌的血管内皮生长因子蛋白具有良好的生物活性,可有效促进人脐静脉内皮细胞的增殖.     

重组转化生长因子β1腺相关病毒感染骨髓基质干细胞的活性☆

背景:目前常用基因载体具有一定缺陷性,无法直接在体内应用.应用腺相关病毒作为转化生长因子β1载体促进软骨修复的研究报道较少. 目的:构建重组转化生长因子β1腺相关病毒,测定病毒滴度,并测定重组病毒对骨髓基质干细胞的感染活性. 方法:PCR方法扩增转化生长因子β1基因,构建重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,与包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞包装重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度并鉴定.并感染体外培养的兔骨髓基质干细胞,检测重组病毒感染骨髓基质干细胞的效率及活性. 结果与结论:转化生长因子β1扩增产物测序结果正确,重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白双酶切后可见位于1.3 Kb附近转化生长因子β1条带.收获病毒滴度5.2×1011 v.g/mL.鉴定重组病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白包装成功.重组病毒感染骨髓基质干细胞后可于荧光显微镜下观测到绿色荧光蛋白的表达,感染效率达42%.结果证实,成功构建重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,能够高效感染兔骨髓基质干细胞.     

重组转化生长因子β1腺相关病毒感染骨髓基质干细胞的活性

背景：目前常用基因载体具有一定缺陷性,无法直接在体内应用。应用腺相关病毒作为转化生长因子β1载体促进软骨修复的研究报道较少。目的：构建重组转化生长因子β1腺相关病毒,测定病毒滴度,并测定重组病毒对骨髓基质干细胞的感染活性。方法：PCR方法扩增转化生长因子β1基因,构建重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,与包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper共转染AAV-293细胞包装重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白。应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度并鉴定。并感染体外培养的兔骨髓基质干细胞,检测重组病毒感染骨髓基质干细胞的效率及活性。结果与结论：转化生长因子β1扩增产物测序结果正确,重组骨架质粒pAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白双酶切后可见位于1.3Kb附近转化生长因子β1条带。收获病毒滴度5.2×1011v.g/mL。鉴定重组病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白包装成功。重组病毒感染骨髓基质干细胞后可于荧光显微镜下观测到绿色荧光蛋白的表达,感染效率达42%。结果证实,成功构建重组腺相关病毒rAAV-转化生长因子β1-绿色荧光蛋白,能够高效感染兔骨髓基质干细胞。     

携带人肝癌细胞CDK2基因的rAAV载体的构建与鉴定

目的构建携带人肝癌细胞CDK2基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体;方法设计能表达CDK2特异性的小干扰RNA(siRNA),构建pAKD-shRNA-CDK2重组质粒,采用磷酸钙共转染法将重组质粒pAKD-shRNACDK2、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共转染AAV-293细胞,采用定量PCR方法对病毒进行滴度测定;结果三质粒共转染AAV-293细胞48h后,荧光显微镜下检测到GFP绿色荧光,表明共转染成功,测定病毒平均滴度为3.56×1012v.g/ml。结论成功构建携带人肝癌细胞CDK2基因的重组腺相关病毒rAAV-shRNA-CDK2。     

携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装

背景:细胞分裂周期2(cell division cycle 2,cdc2)在神经变性疾病如阿尔茨海默病的神经元变性过程中扮演了重要角色.以腺相关病毒为载体对cdc2基因进行沉默,可能对神经变性疾病的神经元起保护作用.目的:包装携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV).设计、时间及地点:空白对照实验,于2007-10/2008-08在武汉同济医院神经科实验室完成.材料:Helper Free腺相关病毒系统(pAAV-MCS-EGFP、p-RC、p-Helper)及AAV-293细胞为Stratagene公司产品.方法:应用分子生物学方法构建生成pAAV-MCS-U6-cdc2-slRNA-EGFP表达质粒;用磷酸钙法将该质粒和p-RC、p-Helper质粒共转染AAV-293细胞,包装生成携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP).病毒感染AAV-293细胞后行Western Blot检测cdc2-siRNA对细胞内cdc2基因的沉默效果,并用斑点杂交方法测定该病毒的滴度.主要观察指标:pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP质粒中插入片段U6-cdc2-siRNA的测序;3质粒pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP、p-RC、p-Helper共转染AAV-293细胞; rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP感染AAV-293细胞后cdc2的表达.结果:①DNA测序证明U6-cdc2-siRNA已成功构建到表达质粒pAAV-MCS-EGFP中.②AAV-293细胞表达绿色荧光蛋白,共转染成功.③包装得到的重组腺相关病毒(rAAV-U6-cdC2-siRNA-EGFP)感染AAV-293细胞后能显著下调AAV-293细胞cdc2基因的表达量.④rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP的滴度为1×1012v.g/mL.结论:携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装获得成功.它具有沉默cdc2基因表达的功能.     

重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定

目的 探讨构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺病毒载体,为进一步的基因转染构建组织工程骨的血管化提供实验基础.方法 采用RT-PCR扩增的方法获得人源性的hVEGF165,并克隆入穿梭质粒pAdTraek CMV.构建的质粒pAdTrack CMV-VEGF165经酶切及测序鉴定正确后,通过pAdeasy 1质粒的介导与腺病毒包装质粒pAdTrack CMV.VEGF165共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后获得携带人VEGF的重组腺病毒pAdTrack CMV.VEGF165.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,测定病毒滴度.结果 PCR鉴定证实重组腺病毒含有人VEGF,病毒滴度为0.5×10"pfu/ml.结论 成功构建的携带人VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,为基因治疗构建组织工程骨血管化的研究奠定基础.     

重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP的构建与鉴定

背景:基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向,目的基因和载体是基因治疗的关键.目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)标志人脑源性神经营养因子(human brai-denved neurotrophic factor,hBDNF)基因重组腺病毒载体.设计、时间及地点:单.一样本观察,实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成.材料:感受态大肠杆菌DH-5 α购自美国Stratagene公司;pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre 、腺病毒包装系统AdMax 和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobixg- Biosysrerms公司.方法:以pDC316-hBDNF为模板,聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段,连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上,构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP.利用AdMax包装系统.穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度.主要观察指标:①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定.②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定.③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化.④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定.⑤纯化病毒的滴度测定结果.结果:经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP/mL,A260/A280值约为2.0,滴度为0.8×1010 CCID50/mL.结论:已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础.     

重组腺病毒载体Ad5-hTRX-EGFP的构建及其表达

本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础。设计含有NotⅠ和EcoRⅤ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP,利用Lipofectamine2000脂质体的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHG lox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包装扩增病毒,用氯化铯高速梯度离心、纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用流式细胞仪测定感染HEK293细胞的效率,Western blot方法验证细胞表达hTRX蛋白。结果显示,重组腺病毒质粒经PCR和NotⅠ、EcoRⅤ酶切鉴定,证实含有hTRX基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5.558×1010pfu/ml。病毒成功感染HEK293细胞,MOI=100时,感染效率达92.25%。经Western blot方法验证表明,感染后的HEK293细胞高表达hTRX蛋白。结论:应用细胞内同源重组方法成功构建了含hTRX基因的重组腺病毒载体,制备获得高滴度的病毒,能高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白,为后续研究奠定了基础。     

用于包装腺相关病毒293细胞的培养

背景:腺相关病毒作为一种主要的基因工程载体,已被广泛应用。但腺相关病毒是缺陷性病毒,需要包装细胞提供E1蛋白。腺相关病毒293细胞作为重要的腺相关病毒特异性包装细胞,能反式产生E1,但腺相关病毒293细胞娇嫩,培养困难,生物学特性易发生改变。因此,有必要建立一种腺相关病毒293细胞的培养方案以满足基因工程的需要。目的:建立一种体外培养腺相关病毒293细胞的方法。设计:开放性实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科。材料:腺相关病毒293细胞株购于Stratagene公司。高糖型DMEM粉(Gibco公司),AAV Helper-Free系统三质粒(Stratagene公司)。方法:实验于2006-10/2007-04在武汉同济医院神经内科实验室完成。在体外将腺相关病毒293细胞复苏,用高糖型DMEM生长培养基培养,当细胞单层融合度达到50%时传代和冻存,并倒置显微镜下观察细胞的生长状态,记录生长曲线。荧光倒置显微镜下观察,根据腺相关病毒293细胞在共转染腺相关病毒系统三质粒后以及被腺相关病毒上清感染后能否激发出绿色荧光,鉴定其包装腺相关病毒的生物学特性。主要观察指标:①腺相关病毒293细胞形态学观察。②生长曲线。③腺相关病毒包装。结果:①倒置显微镜下显示,腺相关病毒293细胞贴壁生长良好,呈现不规则的多角形,胞浆透亮,胞核隐约可见。②生长曲线显示,细胞传代后第1天为生长适应期,2～5d为生长活跃期,6d后细胞进入生长平台期。③荧光倒置显微镜下观察到,腺相关病毒293细胞激发绿色荧光,共转染腺相关病毒系统三质粒成功。腺相关病毒293细胞被腺相关病毒上清感染后激发出绿色荧光,腺相关病毒包装成功。结论:本实验的培养方法简单有用,培养的腺相关病毒293细胞可保持良好的腺相关病毒包装功能。     

携带肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体重组腺相关病毒的构建及鉴定

目的:构建一种携带肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)基因的重组腺相关病毒(recombined adeo-associated virus,rAAV)载体。方法:实验于2005-09/2006-04在中山大学附属第一医院普通外科实验室完成。首先构建携带可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体基因的穿梭质粒pAAV-sTRAIL,利用磷酸钙共沉淀法将穿梭质粒共转染入HEK293细胞中,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒rAAV-sTRAIL。以噬斑分析法筛选单克隆重组腺相关病毒;聚合酶链反应法鉴定阳性重组腺相关病毒;氯化铯密度梯度离心法纯化病毒;紫外分光光度仪测定病毒颗粒数及纯度,噬斑分析法测定病毒感染滴度;Western blot检测rAAV-sTRAIL在293细胞中的表达情况。结果:成功构建了重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL,制备的病毒纯度好、滴度高,且在293转导细胞中能有效表达目的基因sTRAIL。结论:构建的重组腺相关病毒载体rAAV-sTRAIL,为组织工程相关细胞转基因构建及临床应用提供先进的载体系统。     

EGFP标记的hVEGF165重组腺病毒构建新方法及其相关特性的体外研究

利用细菌内同源重组法快速构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子 16 5(hVEGF165)重组腺病毒载体 ,并对其相关特性进行体外研究。首先将hVEGF165cDNA亚克隆到含EGFP基因的腺病毒穿梭质粒 pAdTrack CMV中 ,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy 1共同电击转化大肠杆菌BJ5183 ,同源重组获得重组腺病毒质粒 pAd EGFP/hVEGF165,鉴定后通过脂质体法转染HEK2 93细胞 ,产生重组腺病毒Ad EGFP/hVEGF165。通过体外试验观察病毒的形态、均一性和安全性 ,靶细胞的感染效率及hVEGF165的表达情况。结果显示 ,通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功地构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad EGFP/hVEGF165;借助于EGFP的表达 ,直接在荧光显微镜下观测到靶细胞的感染效率和外源基因的表达。经纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一 ,滴度可达 2× 10 12 pfu/ml。病毒感染Hela细胞后经多次传代未见细胞病变。以感染复数 (MOI) =10 0感染hUVEC可获得最大增殖刺激作用。同样浓度感染小鼠骨髓单个核细胞效率达 2 7.3% ,培养上清中hVEGF165蛋白含量达 1385± 332 pg/ 10 6cells。结论 :细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点 ,辅以EGFP为标记基因可以直观检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。利用该     

Recombinant adenovirus expressing adeno-associated virus cap and rep proteins supports production of high-titer recombinant adeno-associated virus.

It has been difficult to produce a chimeric vector containing both Ad and AAV rep and cap, and to grow such chimeric vectors in 293 cells. By recombination in vitro in a bacterial host, we were able to produce recombinant plasmid AdAAV (pAdAAVrep-cap), which could be used to generate recombinant AdAAV (rAdAAVrep-cap) after transfection into 293 cells. A recombinant adenovirus, rAdAAVGFP, in which the green fluorescent protein (GFP) gene is flanked by the AAV terminal repeats cloned into the E1-deleted site of Ad was also generated. Co-infection of rAdAAVrep-cap together with rAdAAVGFP into 293 cells resulted in production of high titers of rAAV expressing GFP. It was noted that the titer of rAdAAVrep-cap was lower than the titer of control AdCMVLacZ. The lower titer of rAdAAvrep-cap was associated with expression of Rep protein. Non-homologous recombination occurs after high passage and results in deletions within the AAV rep genes. These results indicate that (1) rAdAAVrep-cap can be produced; (2) rAdAAVrep-cap + rAdAAVGFP is a convenient and efficient way to transfect 293 cells to grow high titer rAAV; and (3) frozen stock is required to avoid propagation of rep-deleted pAdAAVrep-cap.     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景:骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的:观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法:体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1:3比例的混合液转染,并分为3组:转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论:转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P<0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P>0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P<0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

HA1重组慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建ha1基因慢病毒载体并获得稳定的产毒细胞,为进一步研究异基因造血干细胞移植后ha1介导的GVHD和GVL的分离机制奠定基础。将已构建好的T-ha1质粒酶切获得目的基因后,将目的基因定向克隆入慢病毒表达质粒pRRLSIN、cPPT、PGK/GFP、WPRE,构建含有ha1基因的重组慢病毒载体,经PCR、酶切及测序鉴定其正确性,并将成功构建的pLenti-ha1质粒与包装质粒一起共转染293T细胞,通过实时定量PCR测定病毒滴度。结果表明：含有ha1基因的重组慢病毒载体经PCR、酶切和测序鉴定构建正确,且测定的病毒滴度为2.0×108TU/ml。结论：本研究成功地构建了ha1的慢病毒载体。     

携带人内皮抑素基因的重组腺病毒构建及表达

目的：内皮抑素是目前发现的作用最强的内皮绌胞抑制因子，但内皮抑素蛋白极不稳定，难以制备及应用，故需要借助基因治疗发挥其抑制血管生成的作用。实验利用AdEasy-1系统构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒，并在人血脐静脉内皮细胞中表达出内皮抑素蛋白。 方法：实验于2006-03／10在中山大学生命科学院完成。以Pshuttle—Endostatin质粒为模扳，应用特异引物，通过聚合酶链反应扩增纯化得到Endostatin基因片断，经测序鉴定后，酶切插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中，再与骨架质粒AdEasy—1在人肠杆菌BJ5183中进行同源重组，重组质粒经筛选、提取、纯化后，经酶切及测序鉴定正确，再大最扩增为腺病毒载体，线性化后利用脂质体2000转染AAV293细胞包装并扩增，得到的病毒液纯化扩增后，感染人脐静脉内皮细胞，反转录聚合酶链反应检测感染绌胞中目的基因的表达，蛋白免疫印迹检测感染细胞中蛋白的表达。 结果：获得的Endostatin基因片段经酶切及测序答定正确，重组腺病毒质粒经酶切及测序鉴定正确，成功转染AAV293细胞，包装并扩增出病毒液，纯化后测滴度为2．06×10^10pfu／mL，进一步感染人脐静脉内皮细胞，在其中检测到目的基因及蛋白表达. 结论：人内皮抑素重组腺病毒pAd—Endo构建成功，且可在人脐静脉内皮细胞中表达出相应的目的摹囚及蛋白，     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165）不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的：观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1：3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义（P〈0.05）,但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义（P〉0.05）,转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义（P〈0.05）,hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。