携带人VEGF_(165)和ANG-1双基因的腺病毒载体的构建及目的基因的表达

[目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pTrack-CMV中,构建携带双基因的腺病毒穿梭载体pTrack-CMV-VIA。进而使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒。通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测制备的腺病毒pAd-VIA感染的大鼠骨髓基质干细胞中外源基因VEGF165及Ang-1的表达。[结果]该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,证明基因序列正确。转染QBI-293A细胞后,可观察到GFP明显表达。重组合腺病毒载体pAd-VIA获得成功包装,扩增后病毒滴度为2×1010PFU/ml,大鼠骨髓基质干细胞转染48 h后,绿色荧光蛋白表达阳性,ELISA结果显示转染组在感染48 h后,培养细胞上清中的VEGF165浓度为(42.5±2.082)ng/105细胞,ANG-1浓度为(16.67±2.08)ng/105细胞,未转染组几乎未检测到外源基因的表达,有统计学差异(P0.05)。[结论]成功构建携带人VEGF165、ANG-1双基因共表达重组腺病毒载体,为组织工程人工骨血管化的研究奠定基础。     

腺病毒介导人VEGF_(165)和ANG-1双基因转染大鼠BMSCs及对其增殖的影响

[目的]探讨携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因的腺病毒表达载体pAd-VIA转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的体外表达及对BMSCs增殖的影响。[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因的腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,体外转染大鼠BMSCs,通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、Western-blotting、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测外源基因的表达,利用MTT法检测MOI(multiplicity of infection)=50、100、200、400 pfu/cell不同浓度腺病毒转染后对BMSCs增殖活性的影响。[结果]重组腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,体外转染BMSCs后,有大量的GFP表达,Western-blotting检测显示,转染组与VEGF165和ANG-1抗体结合,在45 KD和14.4 KD左右出现印迹条带;ELISA结果显示:转染组第1、2、3 d,上清中的VEGF165浓度和ANG-1浓度持续增加,未转染组均未检测到外源基因的表达,差异...     

腺病毒介导入VEGF165和ANG-1双基因转染大鼠BMSCs及对其增殖的影响

[目的]探讨携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因的腺病毒表达载体pAd-VIA转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的体外表达及对BMSCs增殖的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因的腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,体外转染大鼠BMSCs,通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、Western-blotting、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测外源基因的表达,利用MTT法检测MOI(multiplicity of infection)=50、100、200、400 pfu/cell不同浓度腺病毒转染后对BMSCs增殖活性的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,体外转染BMSCs后,有大量的GFP 表达,Western-blotting检测显示,转染组与VEGF165和ANG-1抗体结合,在45 KD和14.4 KD左右出现印迹条带;ELISA结果显示:转染组第1、2、3 d,上清中的VEGF165浓度和ANG-1浓度持续增加,未转染组均未检测到外源基因的表达,差异有统计学意义(P<0.01);不同浓度的腺病毒载体转染BMSCs后,促进细胞增殖,细胞生长曲线上移,在1、3、5、7 d转染组的OD值均大于未转染组,差异有统计学意义(P<0.01),第9 d,细胞进入平台期,转染组和未转染组的OD值差异无统计学意义(P>0.05).[结论]重组腺病毒pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,外源基因在体外得到有效表达,同时在观察时间内可以促进大鼠BMSCs的增殖.     

VEGF165慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建VEGF165慢病毒包装质粒,通过慢病毒介导VEGF165感染入骨髓间充质干细胞(hBMSCs)并验证其表达情况,为高表达VEGF的HBMSCs应用于血管再生和治疗临床创面愈合提供研究基础. 方法 2012年3月至2013年3月,采用聚合酶链式反应(PCR)从提取的人体组织总RNA逆转录扩增VEGF165,经双酶切后与pLVX-IRES-ZsGreen1真核载体连接,在脂质体介导下将重组质粒转染293T细胞,包装产生的病毒液感染HBMSCs,荧光显微镜下观察VEGF165荧光融合蛋白表达,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测VEGF165 mRNA的表达.对结果用SPSS13.0统计软件进行分析,P＜0.05为差异有统计学意义. 结果 双酶切产物于576 bp处出现特异性条带,测序结果与预期符合,表明所构建重组质粒pLVX-IRES-ZsGreen1+VEGF165结构正确.构建质粒转染293T细胞并产生高滴度含目的基因VEGF165的慢病毒,感染hBMSCs后,细胞在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白表达,qRT-PCR结果显示慢病毒感染组VEGF165 mRNA表达水平为32.27±1.05,显著高于对照组(P＜0.05). 结论 成功构建VEGF165慢病毒包装质粒,并感染hBMSC,为其基因治疗应用于临床提供了依据.     

基因重组免疫毒素白细胞介素18-PE38融合基因治疗类风湿性关节炎的初步研究

目的构建白细胞介素18(interleukin18,IL-18)-PE38融合基因的真核表达载体,并研究其在小鼠软骨细胞及3T3细胞中的表达,探讨类风湿性关节炎的基因治疗方法. 方法经限制性内切酶双酶切从质粒PRKL459K-IL18-PE38中获取IL-18-PE38融合基因, 将其与真核表达载体PsecTag2B连接,转化感受态菌,挑取单克隆培养并提取质粒,EcoRⅠ单酶切鉴定.脂质体转染法将构建的真核表达载体转染入3T3细胞及小鼠软骨细胞中,分别设置空载体对照,通过荧光免疫细胞化学法鉴定转染后瞬时表达情况. 结果 EcoRⅠ单酶切后电泳鉴定显示,所构建的真核表达载体PsecTag2B-IL-18-PE38片段长度约为6 000 bp.荧光免疫细胞化学法、荧光显微镜摄片均显示转染融合基因组荧光表达强,空载体对照组荧光表达微弱. 结论 IL-18-PE38融合基因真核表达载体构建成功,并在小鼠软骨细胞及3T3细胞中表达,为类风湿性关节炎的基因治疗研究奠定基础.     

人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及在骨髓间充质干细胞的表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)165腺病毒表达载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞研究其相关特性。方法利用细菌内同源重组技术快速构建Ad-VEGF165腺病毒重组质粒,经酶切及测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组Ad-VEGF165腺病毒,并进行电镜观察及滴度测定。感染大鼠骨髓间充质干细胞观察VEGF165基因的转录和表达。结果酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒含有hVEGF165cDNA,电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在,测定包装的病毒滴度为6.3×1010TCID50/ml。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学及免疫印迹检测骨髓间充质干细胞内有VEGF165的转录和表达。结论构建的VEGF腺病毒表达载体可有效感染骨髓间充质干细胞,并在体外高效表达,为将表达VEGF基因的骨髓间充质干细胞用于基因治疗提供了实验依据。     

VEGF15基因表达载体的构建和鉴定

目的：构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的特异表达,为重组VEGF165进一步的生物学活性和临床研究奠定基础.方法：采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,在脂质体介导下将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,以抗生素培养基筛选抗性细胞,并对抗性细胞进行单克隆化,采用双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blotting等方法对目的蛋白在细胞中的特异表达进行分析鉴定.结果：完成真核表达载体pcDNA3.1（＋）-VEGF165的构建,并成功转染NIH/3T3细胞,筛选到一批G418抗性的阳性细胞,单克隆化的阳性细胞（吸光度值0.345±0.064）与空载体转染（吸光度值0.114±0.012）的对照比较,有显著的VEGF165表达（P〈0.01）,SDS-PAGE和Western Blotting检测到VEGF165在扩大培养的克隆细胞中的特异表达.结论：应用pcDNA3.1（＋）-VEGF165载体转染的NIH/3T3细胞可高效表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白.     

血管内皮细胞生长因子体外转染血管内皮祖细胞的研究

目的 探讨脂质体介导血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染血管内皮祖细胞(EPC)应用于基因治疗的可行性、安全性。方法 体外分离、培养、免疫组织化学及流式细胞仪鉴定EPC,转染VEGF后用免疫组织化学和ELISA检测EPC表达VEGF蛋白,噻唑蓝(MTT)检测EPC对VEGF质粒转染的敏感性。结果 EPC表达CD_(34)、CD_(31)、KDR及CD_(133)细胞表面标志,转染后EPC胞内表达VEGF。脂质体介导PcDNA3.1(-)/VEGF_(165)质粒转染、PcDNA3.1(-)/VEGF_(165)空质粒转染、不转染任何质粒的3组EPC培养基上清中表达的VEGF分别为(352±35)ng/L、(45±5)ng/L、0 ng/L(P<0.05),VEGF质粒转染对EPC增殖无影响。结论 EPC可作为VEGF转染的靶细胞,用于基因治疗。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建血管内皮生长因子165重组腺病毒

目的利用AdEasy腺病毒载体系统构建血管内皮生长因子165（VEGF165）重组腺病毒，并在293T细胞中扩增。方法将PCR获取的VEGF165基因酶切并插入到pAdTrack-CMV中，构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165，经PmeI酶切线性化后，采用电穿孔转化到事先电转化腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中，挑选同源重组菌落。提取质粒并用Pac I酶切鉴定，线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞，包装成重组腺病毒颗粒，荧光显微镜下观察绿色荧光表达，并扩增收集重组腺病毒，测定病毒滴度。结果经限制性内切酶检测、基因测序及和绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒，并扩增出10^9pfu／mL的高滴度重组腺病毒。结论成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒载体，为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础。     

hVEGF165基因转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建携带hVEGF165基因的重组腺病毒载体pAdxsi-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-hVEGF165,体外转染大鼠BMSCs,观察转染后hVEGF165的表达情况以及对BMSCs生长增殖的影响,为进行血管再生的基因治疗奠定实验基础。方法将hVEGF165从原始质粒切下连接到pShuttle-巨细胞病毒-EGFP重组穿梭载体,并转移至pAdxsi载体上,获得重组腺病毒载体质粒pAdxsi-EGFP-hVEGF165,进行酶切鉴定及基因测序。采用PacI限制性内切酶线性化pAdxsi-EGFP-hVEGF165,并转染人胚肾细胞HEK293,收获重组腺病毒,测定病毒滴度。贴壁法培养Wistar大鼠BMSCs,体外转染携带EGFP基因的重组腺病毒(pAdxsi-EGFP),荧光倒置相差显微镜及流式细胞术确定最佳病毒感染复数(multiplicities of infection,MOI)。依据最佳MOI转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165至BMSCs,采用Western blot、RT-PCR及ELISA法检测转染后hVEGF165的表达;MTT法评价转染后BMSCs生长增殖情况。结果酶切鉴定及基因测序提示重组腺病毒载体质粒含有hVEGF165 cDNA;经多轮感染、扩增后,病毒滴度可达1×1010 pfu/mL。荧光倒置相差显微镜观察转染pAdxsi-EGFP后MOI为150 pfu/cell时转染效果最佳,流式细胞仪检测转染效率约88%。Western blot和RT-PCR检测示,pAdxsi-EGFP-hVEGF165转染BMSCs 48 h后在蛋白质和基因水平均可有效表达hVEGF165;ELISA检测示其含量在7 d达高峰,在20 d时仍有表达,1、3、5、7、9、11、13、15、20 d各时间点hVEGF165含量均显著高于EGFP基因转染组及未转染组(P<0.05)。MTT结果显示,各时间点转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165的BMSCs与未转染组细胞的吸光度(A)值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMSCs是一种较理想的基因载体细胞,成功制备的重组腺病毒载体质粒可在MOI值为150时将hVEGF165基因有效转染至BMSCs;转染后hVEGF165表达水平较高、持续时间较长,且对BMSCs的生长增殖无明显影响。     

血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究

目的 检测人血管内皮生长因子(VEGF)基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞(BM-SC)VEGF表达的影响.方法 分离并培养兔骨髓基质干细胞,利用脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165转染兔BMSC,G418筛选稳定表达pcDNA3.1-VEGFl65的细胞克隆,RT-PCR、Western blot法检测转染前后细胞中VEGF165 mRNA和蛋白的表达.结果 通过筛选获得了稳定表达pcDNA3.1-VEGF165的细胞克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot结果显示:稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165 mRNA和蛋白的表达,空白和空载体组未见VEGF表达.结论 pcDNA3.1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165 mRNA和蛋白,可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞.     

血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建及转染内皮祖细胞的实验研究

目的：利用细菌内同源重组法构建含血管内皮生长因子（VEGF）165基因的重组腺病毒，并观察其在内皮祖细胞（EPCs）中的表达，为进一步研究其在慢性肾脏病中的作用奠定基础。方法：用限制性内切酶XbaⅠ＋HindⅢ从质粒载体中切出VEGFl65基因片段，与KpnⅠ＋HindⅢ双酶切的pAdTrack-CMV形成转移质粒pAdTrack-CMV-VEGFl65，PmeI酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，由人胚肾293细胞包装成Ad-VEGFl65，PCR和westem blot法鉴定其表达。贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs，Ad-VEGFl65基因体外转染EPCs，检测转染后目的基因的表达情况。结果：利用CSCI，法由pAdTrack-VEGFl65和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态茵，可获得阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因，病毒滴度1．4×10^10pfu／ml。Ad-VEGFl65转染培养第6天的EPCs后24h开始，培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加。结论：成功制备的重组体腺病毒Ad-VEGFl65转染体外培养的EPCs后，在体外能有效高表达目的基因产物，为今后VEGF在肾脏病中的深入研究奠定了基础。     

人血管内皮生长因子165基因转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

Objective To establish an effective method of transfecting human marrow mesenchymal stem cells (MSC) with human vascular endothelial growth factor 165 ( VEGF 165) gene. Methods MSCs isolated and cultured in vitro were divided into transfection group (pShuttle-CMV/VEGF 165 plasmid was transfected into MSCs through liposome-mediating method), empty plasmid group (pShuttle-CMV vehi-cle was transfected into MSCs as control), liposome group (liposome was transfected into MSCs as control) and control group(normal culture). Expressions of Mrna and protein of MSCs were determined by RT-PCR, enzyme-linked immunosorbent assay and Western Blot. Sensitivity to MSCs on VEGF plasmid transfec-tion was detected by MTT test. Results Expression level of VEGF 165 gene Mrna in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively 0.89 ± 0.03, 0. 34 ± 0.04, 0.40 ± 0.03, and 0.30 ± 0.03, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0. 01 ). Content of VEGF protein in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively (778 ± 35 ), (543 ± 24), (561 ± 28), (571 ± 23) pg/Ml, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0.01 ). In the transfection group, expression level of VEGF protein peaked on 7th day after transfec-tion, which was decreased gradually later. In transfection group, expression level of V EGF 165 protein was obviously higher than that of the other three groups ( P <0. 01 ), and no inhibitory effect of VEGF plasmid transfection on MSCs proliferation was found. Conclusions The method for transfecting human VEGF 165 gene into MSCs is established in this research, through which target gene and protein can express effectively.     

人血管内皮细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞对脂肪颗粒移植存活率的影响

目的 检测大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)经人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染后,对脂肪颗粒移植存活率的影响.方法　利用FuGENE HD介导VEGF165基因体外转染SD大鼠BMSCs,与取自SD大鼠的脂肪组织混合后移植于大鼠背部,类似方法设立未转染组及DMEM液空白对照组.检测脂肪组织存活率及再生血管密度.结果　转染组存在外源性基因和蛋白的表达,脂肪组织存活率及再生血管密度高于未转染组,且两者均高于对照组.结论　转染VEGF165基因的BMSCs具有更强的促血管再生作用,可提高游离移植脂肪的存活率.     

大鼠葡萄糖转运体3真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建大鼠葡萄糖转运体3（GLUT3）的真核表达载体，为进一步研究葡萄糖转运体3对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定基础。方法以逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）的方法从大鼠脑组织中获取GLUT3全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3，随后用Lipofectamine^TM2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR的方法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组织化学的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果克隆的大鼠GLUT3全长cDNA大小约1．5kb且无碱基突变，以构建的重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体3的表达。结论成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体3的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-Glut3，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因。     

人PPFP基因的重组慢病毒载体的构建和表达

目的 构建含人PAX8/PPARγ/融合基因(PPFP)基因重组慢病毒载体并检测其表达性能.方法 从已构建好的含PPFP的质粒克降模板PEGFP-C-PPFP中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取目的 基因PPFP,将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含Flag基因)中,得到重组的pGC-FU-PPFP,通过PCR、酶切、测序和分析比对验证PPFP基因后,将pGC-FU-PPFP质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞,获得携带PPFP基因和Flag基因的重组慢病毒,收集并浓缩病毒上清液,测定重组病毒的滴度.通过Western blot鉴定PPFP-Flag融合蛋白在靶细胞内的表达进一步验证目的 基因在靶细胞中的表达.结果 经PCR扩增获得2591 bp的目的 基因片段,构建的重组质粒经PCR、酶切及测序和分析比对鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒滴度达3.5×10~7转导单位TU/ml;感染的293T细胞,Western blot结果显示条带大小为90 KDr,可判断目的 基因PPFP在293T细胞中表达.结论 成功构建PPFP基因慢病毒载体质粒pGC-FU-PPFP,并建立慢病毒过表达系统.     

人血管内皮细胞生长因子腺病毒表达系统的构建及体外表达

目的　构建人VEGF12 1腺病毒表达载体 ,探讨应用血管内皮细胞生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因治疗骨科缺血性疾患的可行性。　方法　采用分子克隆技术 ,从pCDI/VEGF12 1质粒获得hVEGF12 1cDNA ,经穿梭质粒pShuttle克隆到腺病毒质粒上 ,构成Adeno VEGF12 1腺病毒重组质粒 ,经酶切及测序鉴定正确后 ,包装成为重组Adeno VEGF12 1腺病毒 ,并进行电镜观察及滴度测定。用病毒感染小鼠骨髓基质细胞 ,用逆转录PCR方法检测VEGF12 1基因在骨髓基质细胞中的转录 ,用免疫印迹及免疫组化方法检测VEGF蛋白的表达。　结果　经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功 ,电镜显示包装细胞中有病毒存在 ,包装的病毒滴度为 8× 10 10 pfu/ml,RT PCR证实有VEGF12 1mRNA的转录 ,免疫印迹及免疫组化检测有VEGF12 1蛋白的表达 ,而对照未见VEGF12 1转录和表达。　结论　构建的VEGF12 1腺病毒表达载体可在体外表达 ,VEGF基因治疗有可能用于骨科缺血性疾患