VPA和As2O3对Molt-4细胞的协同作用及可能机制

本研究探讨丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）单药或与亚砷酸（arsenie trioxide，As2O，3）联用对人急性T细胞白血病细胞株Molt-4增殖活力的抑制、去甲基化作用及其可能机制。用MTT法检测药物对细胞增殖的抑制作用，利用金氏公式观察两药联用体外抗癌的协同作用。采用半巢式甲基化特异PCR（hnMS—PCR）检测p15INK4B基因甲基化，RT—PCR方法检测p15基因、DNA甲基转移酶DNMT-1、DNMT3A、DNMT3B的表达。结果表明：VPA和As2O3均可明显抑制细胞增殖，二者联用在体外有相加作用（Q值均大于0．85），在5mmol／LVPA与10μmol／LAs2O3联用时抑制率达（70．31±2．54）％。Molt-4细胞p15基因因高甲基化而失表达，经VPA和As2O3联合作用后p15基因甲基化程度明显下降，p15基因表达增强，两药联用时DNMT-1、DNMT-3A、DNMT3B mRNA的表达都有下降。结论：VPA可能通过抑制DNA甲基转移酶DNMT-1和（或）DNMT3B使p15INK4B基因去甲基化，使p15基因表达上调，恢复其活性。VPA和As2O3均可明显抑制Mol-4细胞增殖，两药合用有协同相加作用，可减少砷剂的副作用。     

5′-杂氮-2′-脱氧胞苷对高危组骨髓增生异常综合征细胞作用的体外研究

本研究探讨 5′ 杂氮 2′ 脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine ,5 Aza CdR ,Decitabine)对高危组骨髓增生异常综合征 (MDS)细胞体外作用的机制。以人MDS RAEB细胞株MUTZ 1细胞为研究对象 ,采用细胞培养技术、MTT增殖抑制实验测定细胞存活率及抑制率 ;用细胞形态学、流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸 (PS)转位及细胞凋亡 ;用RT PCR检测 p15INK4B基因、甲基转移酶 (DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表达 ;用甲基化特异PCR(MSP)方法检测 p15INK4B基因甲基化程度。结果表明 :5 Aza CdR对MUTZ 1细胞有生长抑制作用 ;作用后的细胞显示凋亡细胞的特征性改变。p15INK4B基因甲基化程度随 5 Aza CdR剂量增加而减弱 ,伴随 p15INK4B基因mRNA表达增加。经 3.2mmol/L 5 Aza CdR作用 4 8小时后 ,MUTZ 1细胞DNMT3A mRNA表达水平较未加药组明显下降 (灰度比为 0 .385∶0 .6 5 4 ,P <0 .0 5 ) ,DNMT1、DNMT3B mRNA表达水平与未加药组相比无明显改变。结论 :在 0 .4 - 6 .4mmol/L浓度范围 5 Aza CdR通过诱导MUTZ 1细胞凋亡而抑制该细胞生长 ,这可能是其抗肿瘤的主要机制之一。 5 Aza CdR可能通过下调DNMT3A mRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降 ,从而恢复其表达。     

丙戊酸钠对Molt-4细胞增殖的影响及其作用途径探讨

目的 观察丙戊酸钠(VPA)对人急性T细胞白血病细胞系Molt-4细胞增殖和细胞周期的影响,并探讨其对Molt-4细胞p15INK4B基因甲基化状态的影响.方法 不同浓度VPA作用Molt-4细胞后,用MTr法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期的变化,半巢式甲基化特异PCR(MSP)法检测p15INK4B基因甲基化状态,RT-PCR方法检测p15基因、DNA甲基转移酶DNMT-1、DNMT3A、DNMrT3B mRNA的表达.结果 VPA可明显抑制细胞增殖,影响Molt-4细胞周期分布,5.0mmol/L VPA作用Molt-4细胞48 h,G0/G1期细胞为(66.87±3.31)%,S期细胞为(8.47±2.56)%,与未加VPA组相比,S期细胞明显下降,G0/G1期细胞明显升高(P＜0.05).经VPA作用后Molt-4细胞p15基因甲基化程度明显下降,p15基因表达水平明显增加,DNMT-1、DNMT3B mRNA表达水平下降,以DNMT-1下降较明显.结论 VPA可能通过抑制甲基转移酶DNMT-1和(或)DNMT3B表达使p15INK4B基因去甲基化,使p15基因表达上调,从而抑制Molt-4细胞增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期.     

AS_2O_3逆转人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因甲基化状态及激活转录的实验研究

本研究旨在探讨三氧化二砷(As2O3)逆转恶性淋巴瘤CA46细胞株p16基因甲基化状态和调节转录作用及其可能的机制。以高甲基化的恶性淋巴瘤细胞株CA46作为研究基因甲基化与表达关系的实验对象。采用SRB法检测As2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力的影响;nMSP法检测药物作用后p16甲基化状态变化;RT-PCR法检测p16、甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达;利用流式细胞术DNA倍体分析法探讨As2O3对恶性淋巴瘤细胞周期的影响。结果表明:①As2O3作用CA46细胞株72小时后p16基因甲基化程度明显减弱,p16基因异常甲基化的现象被逆转;②未处理组细胞p16基因呈微弱表达,As2O3作用72小时后p16基因表达增强,0.5μmol/L组、1.0μmol/L组和2.0μmol/L组p16基因表达阳性条带与β-actin灰度的比值分别为(0.33±0.10)、(0.57±0.11)、(0.67±0.09),阳性对照灰度比值为(0.73±0.13),差异有统计学意义(p0.01);③与未处理组相比,As2O3作用72小时后甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性,而DNMT1表达不受影响;④与对照组相比,3组不同浓度As2O3均能明显抑制肿瘤细胞生长,G0/G1期细胞增加。结论:As2O3可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B或(和)直接逆转p16基因甲基化状态,使p16基因表达上调,并恢复其活性,从而实现其细胞周期调控功能,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制肿瘤细胞的增长。     

巢式MSP检测砷剂诱导人多发性骨髓瘤U266细胞系p16基因去甲基化及转录

本研究探讨用高灵敏度的DNA甲基化检测方法及DNA克隆测序分析法检测三氧化二砷(As2O3)的去甲基化作用,并对其可能的去甲基化作用机制进行分析。采用巢式甲基特异性PCR法(nested-methylation specificPCR,n-MSP)、DNA克隆测序分析法检测As2O3作用前后U266细胞株p16基因甲基化状态,应用RT-PCR检测p16、DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNMT3A、DNMT3B基因mRNA的表达,以生长曲线、MTT法、集落形成实验检测As2O3对骨髓瘤细胞生长和增殖的抑制作用。利用流式细胞仪DNA含量分析法探讨As2O3对多发性骨髓瘤细胞系U266周期的影响。结果表明:①未处理组U266细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变,而经As2O3作用的U266细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶,这说明U266细胞存在p16基因甲基化,As2O3作用后p16基因异常甲基化的现象被逆转;②未处理组细胞p16基因不表达,As2O3作用72小时后p16基因表达增强,0.5μmol/L组、1.0μmol/组和2.0μmol/组p16基因表达阳性条带灰度值与β-肌动蛋白比值分别为(0.22±0.10)、(0.59±0.11)、(0.68±0.09),阳性对照灰度比值为(0.77±0.13),差异有非常显著的统计学意义(P<0.01);③与未处理组相比,As2O3作用72小时后甲基转移酶(DNMT)1、DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性;④与对照组相比,3组不同浓度As2O3均能明显抑制骨髓瘤细胞生长,G0-G1期细胞增加。结论:As2O3可能通过抑制甲基转移酶(DNMT1)、DNMT3A、DNMT3B和(或)直接对p16基因去甲基化,使p16基因表达上调,恢复其活性,从而实现其对细胞周期的调控功能,将细胞阻滞于G0-G1期,抑制骨髓瘤细胞的增长。     

5''''-杂氮-2''''-脱氧胞苷对高危组骨髓增生异常综合征细胞作用的体外研究

本研究探讨5'-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR,Decitabine)对高危组骨髓增生异常综合征(MDS)细胞体外作用的机制.以人MDS-RAEB细胞株MUTZ-1细胞为研究对象,采用细胞培养技术、MTT增殖抑制实验测定细胞存活率及抑制率;用细胞形态学、流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(PS)转位及细胞凋亡;用RT-PCR检测p15INK4B基因、甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表;用甲基化特异PCR(MSP)方法检测p15INK4B基因甲基化程度.结果表明5-Aza-CdR对MUTZ-1细胞有生长抑制作用;作用后的细胞显示凋亡细胞的特征性改变.p15INK4B基因甲基化程度随5-Aza-CdR剂量增加而减弱,伴随p15INK4B基因mRNA表达增加.经3.2mmol/L 5-Aza-CdR作用48小时后,MUTZ-1细胞DNMT3AmRNA表达水平较未加药组明显下降(灰度比为0.3850.654,P＜0.05),DNMT1、DNMT3BmRNA表达水平与未药组相比无明显改变.结论在0.4-6.4 mmol/L浓度范围5-Aza-CdR通过诱导MUTZ-1细胞凋亡而抑制该细胞生长,这可能是其抗肿瘤的主要机制之一.5-Aza-CdR可能通过下调DNMT3AmRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降,从而恢复其表达.     

表没食子儿茶素没食子酸诱导人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因去甲基化及转录

本研究旨在探讨表没食子儿茶素没食子酯酸（epigallocatechin-3-gallate．EGCG）诱导人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因去甲基化及转录激活的可能机制。以生长曲线、MTT法检测EGCG对CA46细胞生长和增殖的抑制作用；利用流式细胞仪DNA含量分析法探讨EGCG对CA46细胞周期的影响；采用巢式甲基特异性PCR法（nested—methylation specific PCR，n-MSP）及DNA克隆测序分析法检测EGCG作用前后CA46细胞p16基因甲基化状态；应用RT—PCR检测p16、DNA甲基转移酶（DNMT3A、DNMT3B）基因mRNA的表达。结果表明：与对照组相比，3组不同浓度EGCG均能明显抑制CA46细胞生长，G0／G1期细胞增加；不同浓度EGCG作用48小时后p16基因甲基化程度减弱；未处理组细胞p16基因呈微弱表达，未用药组、不同浓度EGCG（6、12、24）μg／ml处理组条带灰度值与β-actinl比值分别为（0．05±0．01）、（0．19±0．03）、（O．39±0．10）、（0．85±0．09），各处理组p16基因mRNA表达明显高于未用药组，其差异有显著意义（P〈0．05）；与对照组相比，EGCG作用48小时后CA46细胞甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达均下降。结论：EGCG可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B和（或）直接对p16基因去甲基化，使p16基因mRNA表达上调，恢复其活性，从而实现其时细胞周期的调控功能，将细胞阻滞于G0／G1期，抑制CA46细胞的增殖     

急性白血病患者DNA甲基转移酶基因的表达其及临床意义

为了探讨DNA甲基转移酶(DNMT)基因在成人急性白血病(AL)患者中的表达及其与临床预后之间的 关系,对72例AL患者和20例正常人的骨髓采用RT-PCR方法进行DNMT、p15INK4B、mdrl mRNA水平的检测;对 56例AL患者和14例正常人p15INK4B基因启动子区域CpG岛甲基化率,采用甲基化特异性PCR方法进行检测。结 果表明:AL患者组所有3种DNMT表达均明显高于对照组(P<0.01),改用细胞增殖核抗原(PCNA)为内对照, 差别仍有统计学意义。AL患者3种DNMT基因表达之间呈明显正相关,表现为协同的高表达;p15INK4B、mdrl与 DNMT表达呈明显负相关。DNMT因同时阳性患者组完全缓解(CR)率明显高于DNMT基因部分阳性或阴性 患者组(P<0.01)。p15INK4B基因在56例AL患者中,31例(55.4％)完全甲基化,12例(21.4％)部分甲基化,14例 正常人在同一条件下则无1例甲基化。结论:DNMT基因在成人AL患者有异常高表达,其可能通过促使抑癌基因 启动子区域过甲基化,而使其转录失活,从而导致白血病恶性克隆的形成。对于高表达DNMT的AL患者,可能对 化疗更敏感,提示DNMT基因高表达可能是临床预后较好的指标。     

As2O3诱导急性淋巴细胞白血病细胞系Molt4细胞p15基因表达的研究

目的 探讨砷剂与甲基化的关系。方法 先用甲基化特异的PCR检测急性T淋巴细胞白血病细胞系Molt4细胞p15基因甲基化,然后用RT－PCR方法检测用As2O3处理或未处理Molt4细胞的p15基因mRNA表达,用流式细胞仪检测细胞周期并绘制生长曲线。结果 Molt4细胞p15基因发生甲基化,p15 mRNA不表达,Molt4细胞与As2O3一起培养后,p15基因mRNA重新表达,G0－G1期细胞明显增多,Molt4细胞生长受到抑制。结论 As2O3能够去p15基因甲基化,激活p15基因的mRNA表达,恢复p15基因的细胞周期负调节功能。     

5-氮杂脱氧胞苷对白血病细胞生长作用及相关基因表达的影响

目的　探讨甲基化抑制剂 5 氮杂脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine,5 aza CdR)去甲基化治疗白血病的作用机制。方法　采用MTT实验、硝基四氮唑蓝 (NBT)还原实验和DNA凝胶电泳的方法 ,观察 5 aza CdR对白血病细胞株和原代细胞增殖、分化和凋亡的影响 ;通过RT PCR和甲基化特异性PCR方法检测DNA甲基转移酶 (DNMT)、p15、p5 3、bcl 2基因表达变化和p15基因的甲基化状态。结果　 5 aza CdR对HL 6 0、K5 6 2细胞和白血病原代细胞的生长抑制有明显的剂量依赖性和时间依赖性。 0 .5 μmol/L 5 aza CdR对HL 6 0细胞有较明显的促分化作用。不同浓度 5 aza CdR处理细胞后 ,有不同程度的p15、p5 3mRNA表达上调和bcl 2mRNA表达下调 ,DNMTmRNA表达水平在处理前后无明显变化。在原代白血病细胞中 ,p15基因甲基化程度随着 5 aza CdR浓度的增加逐渐减低。结论　 5 aza CdR对白血病细胞株和原代细胞的增殖均有明显的抑制作用 ,其作用机制可能与p15、p5 3基因的上调以及bcl 2基因的下调有关 ,p15 INK4B基因甲基化程度的降低 ,主要与 5 aza CdR的竞争性抑制有关 ,而不是由DNMT基因的下调所致     

砷剂诱导多发性骨髓瘤细胞socs-1基因去甲基化作用的研究

本研究探讨三氧化二砷（As2O3）对人多发性骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226细胞内socs-基因甲基化状态的影响。用MTT法观察As2O3对骨髓瘤细胞增殖情况的影响，采用甲基特异性PCR法检测As2O3作用前后骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226 socs-1基因的甲基化状态，以实时定量PCR技术定量检测细胞株给药前后socs-1基因mRNA的表达变化，流式细胞技术检测As2O3诱导的骨髓瘤细胞的凋亡情况。结果表明：人骨髓瘤细胞株U266、RPMI8226均存在不同程度的socs-1基因CpG岛甲基化，socs-1基因不表达的现象。As2O3作用72小时后socs-1基因甲基化程度明显减弱或消失，socs—1基因在mRNA水平上表达明显增强，与各野生型细胞株相比，差异具有显著性P〈0．05），且细胞生长抑制明显，早期、晚期细胞凋亡比率明显升高，并呈现剂量依赖性。结论：As：03可诱导socs—1基因甲基化状态的改变，使基因表达上调，恢复其活性，这为进一步阐明As2O3诱导骨髓瘤细胞凋亡的可能机制和As2O3治疗多发性骨髓瘤的可能机制提供新的思路和新的研究方向。     

As_2O_3对Jurkat细胞株hdpr1基因去甲基化作用机制的研究

本研究探讨三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株hdpr1抑癌基因去甲基化的影响及其作用机制。采用CCK8法检测As2O3对Jurkat细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测As2O3作用前后细胞周期的变化,甲基化特异性PCR（MSP）检测As2O3对hdpr1基因甲基化模式的影响,用半定量RT-PCR检测As2O3对hdpr1基因、DNA甲基转移酶基因dnmt1、dnmt3a、dnmt3b mRNA表达水平的影响。结果表明：As2O3可明显抑制Jurkat细胞的增殖并呈时间-浓度依赖性;As2O3阻滞Jurkat细胞周期于G0/G1期（p〈0.05）,呈浓度依赖性;As2O3能够逆转Jurkat细胞株hdpr1基因的高甲基化并诱导其mRNA重新表达,同时下调dnmt1、dnmt3a、dnmt3b mRNA的表达水平,亦呈浓度依赖性。结论：As2O3抑制Jurkat细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,其机制可能为下调dnmt1、dnmt3a、dnmt3b基因的表达,诱导Jurkat细胞中异常甲基化的hdpr1基因去甲基化并使其恢复表达。     

PHI调控Molt-4细胞组蛋白甲基化诱导p15基因去甲基化后再表达

本研究探讨异硫氰酸苯己酯(PHI)对急性T淋巴细胞性白血病Molt-4细胞组蛋白H3K4、H3K9甲基化,及p15基因的去甲基化的调控作用及诱导沉默基因重新表达的机制。用Western blot方法检测PHI作用后Molt-4细胞的组蛋白H3K4、H3K9甲基化状态及P15蛋白的表达的变化;应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测PHI作用前后Molt-4细胞株p15基因甲基化状态的变化;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Molt-4细胞经过PHI处理后p15基因的mRNA的表达变化。结果表明,PHI作用于Molt-4细胞可增强组蛋白H3K4甲基化表达,抑制组蛋白H3K9甲基化表达,并呈浓度及时间依赖性;PHI作用于Molt-4细胞5天后,p15基因的甲基化程度减弱,p15基因的异常高甲基化现象被逆转,沉默的p15基因重新表达;p15 mRNA、P15蛋白表达增加,并呈浓度依赖性。结论:PHI可能通过特异性调节组蛋白H3K4、H3K9甲基化水平,引起染色体空间结构发生变化,使p15基因的CPG岛去甲基化,从而诱导p15基因重新表达。     

5-Aza-cytidine is a potent inhibitor of DNA methyltransferase 3a and induces apoptosis in HCT-116 colon cancer cells via Gadd45- and p53-dependent mechanisms

Methyltransferase inhibitors commonly used in clinical trials promote tumor cell death, but their detailed cytotoxic action is not yet fully understood. A deeper knowledge about their apotosis-inducing mechanisms and their interaction with DNA methyltransferases (DNMTs) DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b might allow the design of more effective drugs with lower cytotoxicity. 5-aza-cytidine (5-aza-CR), a potent inhibitor of DNMT1, is known to induce demethylation and reactivation of silenced genes. In this study, we investigated the p53 dependence of apoptotic, cell cycle, and growth inhibitory effects of 5-aza-CR, as well as the influence on the expression level of DNMT1, DNMT3a, and DNMT3b in the colon cancer cell line HCT-116. Exposure to 5-aza-CR induced the up-regulation of genes promoting cell cycle arrest and DNA repair (p21(WAF1) and GADD45) or apoptosis (p53, RIPK2, Bak1, caspase 5, and caspase 6). In parallel, there was a down-regulation of antiapoptotic Bcl2 protein and the G(2)/M-mediator cyclin B1. Co-incubation with pifithrin-alpha (PFT-alpha), a selective p53 inhibitor, restored GADD45, Bcl2, cyclin B1, and p21(WAF1) expression levels and almost completely reversed the growth inhibitory, cell cycle, and apoptotic effects of 5-aza-CR. 5-aza-CR treatment caused global demethylation and reactivation of p16(INK4) expression. There was a marked decrease in DNMT1 and DNMT3a mRNA expression, with PFT-alpha reversing these effects. However, 5-aza-CR treatment did not modulate DNMT3b expression. Our data demonstrate that 5-aza-CR action in HCT-116 is mediated by p53 and its downstream effectors p21(WAF1) and GADD45. This is the first report to show a link between p53 and regulation of DNMT1 and de novo methyltransferase DNMT3a.     

雷公藤内酯醇逆转Jurkat细胞apc基因甲基化及其机制的初步研究

本研究探讨中药雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞中抑癌基因——apc基因去甲基化作用,并对其机制进行初步探讨。采用生长曲线、MTT法、集落形成实验及流式细胞术DNA含量分析法分别探讨TPL对Jurkat细胞生长、增殖及细胞周期的影响。以巢式甲基特异性PCR检测TPL对Jurkat细胞apc基因甲基化模式的影响,半定量RT-PCR检测TPL作用后Jurkat细胞apc基因、甲基转移酶dnmt3a、dnmt3bmRNA的表达,Western blot检测TPL作用前后APC蛋白的表达水平。结果表明:与对照组相比,不同浓度TPL均能明显抑制Jurkat细胞生长、增殖,并呈时间及剂量依赖性,48小时IC50为19.7ng/ml;未处理组Jurkat细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变,而经TPL作用的Jurkat细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶,这表明Jurkat细胞存在apc基因甲基化;TPL作用后apc基因的高甲基化被逆转,并呈剂量依赖性;未处理组APC蛋白不表达,TPL作用48小时后APC蛋白表达增强,亦呈剂量依赖性。结论:小剂量TPL可明显抑制Jurkat细胞的生长;TPL可通过甲基转移酶和(或)直接作用使apc基因去甲基化,使apc基因表达上调,恢复其活性,从而抑制Jurkat细胞的增殖。