精原干细胞移植后的体内迁移、增殖和分化

背景:精原干细胞移植对男性不育的治疗具有潜在的临床应用价值,但移植后干细胞体内迁移、增殖、分化的过程目前尚不完全清楚.目的:观测精原干细胞移植后的体内迁移、增殖和分化过程.方法:以出生后6～10 d的雄性C57BL/6小鼠为供体,通过复合酶消化、差速贴壁结合非连续性Percoll密度梯度离心的方法获取精原干细胞;以出生后6周的雄性C57BL/6小鼠为受体,腹腔注射白消安,破坏其内源性生精功能.实验组采用曲细精管微注射法将供体精原干细胞移植入受体睾丸内,对移植后细胞进行PKH26-GL荧光追踪分析,观察其体内迁移过程,以Western Blot和RFQ-PCR法检测睾丸组织α6-Integrin,c-kit,SCF蛋白及mRNA的变化.以未接受化疗和细胞移植的正常同系生小鼠作为阳性对照组,以单侧睾丸曲细精管微注射移植细胞递质作为阴性对照组.结果与结论:PKH26-GL荧光追踪移植细胞,移植后1周部分精原干细胞已向曲细精管基底膜迁移,移植后1个月精原干细胞已从曲细精管管腔迁移至曲细精管基底膜,并分裂增殖,移植后3个月曲细精管管腔内可见大量精子细胞形成.移植后1,2,3个月,各组α6-Integrin,c-kit蛋白表达均呈增加趋势(P < 0.01),阴性对照组、实验组SCF蛋白表达有增加趋势(P < 0.05);各组α6-Integrin,c-kit,SCF mRNA的表达均有增加趋势(P < 0.05).提示大剂量化疗后,生精上皮内仍存在一定数量的Sertoli细胞,这种精子发生的微环境并未完全破坏,外源性精原干细胞移植后能在受体Sertoli细胞所提供的微环境中增殖和分化.     

精原干细胞冷冻保存后再移植的生精功能

背景:精原干细胞的冷冻保存在男性不育治疗方面具有潜在的临床应用价值,但冷冻保存过的精原干细胞移植后,其精子发生过程及生精能力目前尚不完全清楚.目的:观测精原干细胞冷冻保存后移植的生精功能.方法:采用复合酶消化、差速贴壁结合非连续性Percoll密度梯度离心的方法获取雄性SD大鼠及雄性C57BL/6小鼠精原干细胞;以雄性BALB/c裸小鼠为受体,出生后6周予腹腔注射白消安破坏其内源性生精功能.将供体精原干细胞分为冷冻保存组与非冷冻保存组,分别以曲细精管微注射的方法异种移植精原干细胞,采用形态学方法观察生精过程;采集附睾精液,观察精子形态并进行体外受精实验.移植后1,2,3个月取受体睾丸组织,采用免疫组化SABC法检测α6-Integrin蛋白表达情况;移植后1周、1个月、3个月取受体睾丸组织,应用扫描电镜观察生精过程.结果与结论:冷冻保存前的精原干细胞活性率高于冷冻保存后的细胞活性率(P<0.01).冷冻保存组与未冷冻保存组受体睾丸组织精原细胞膜和细胞质中均有α6-Integrin的阳性表达,随时间增加而增加,两组间α6-Integrin蛋白的表达无统计学差异;SD大鼠精原干细胞移植后能在BALB/c裸小鼠生精上皮中克隆增殖,并能分化形成大鼠形态特征的精子,在小鼠精子发生巢内既有大鼠来源的精子发生,又有小鼠内源性精子发生,其供体来源的精子数量较小鼠自身来源的精子数量多.通过体外受精实验提示移植后的精原干细胞在受体内增殖分化形成的精子功能正常,具有受精的能力.结果说明采用常规方法冷冻保存的精原干细胞,移植后能在受体生精上皮中克隆增殖,并能分化形成成熟的精子.     

枸杞多糖对精原干细胞体外增殖的影响

背景:精原干细胞移植对不育具有潜在的临床应用价值,体外建立精原干细胞的培养系统获得数量较多的精原干细胞,仍是目前研究中亟待解决的问题。目的:观察枸杞多糖对精原干细胞体外增殖的影响。方法:采用两步酶消化法获取出生4～6d雄性C57BL/6小鼠睾丸Sertoli细胞与精原干细胞,将精原干细胞接种在Sertoli细胞饲养层上,再加入枸杞多糖或联合细胞因子添加到细胞培养液中。1周后以流式细胞仪检测细胞周期及细胞活性率,并检测各组精原干细胞GFRa-1、Thy-1、c-kit的阳性率。结果与结论:单独加入枸杞多糖后精原干细胞数量明显增加,增殖明显,联合加入胶质细胞源性神经营养因子与白血病抑制因子精原干细胞增殖更加明显(P<0.05)。并发现体外培养1周后的精原干细胞仍保持其睾丸组织内的精原干细胞特征,大多仍维持在未分化状态。表明在枸杞多糖或枸杞多糖联合胶质细胞源性神经营养因子及白血病抑制因子作用下,可促进精原干细胞体外增殖。     

辐射致雄性小鼠不育症模型的建立及生精细胞损伤的初步分析

目的:构建辐射致雄性小鼠不育症模型,并对模型小鼠的生精细胞损伤进行初步分析。方法:不育症模型构建:65只雄性C57BL/6小鼠随机分为7组,正常对照组(A组)及6组60Coγ照射组,后者包括B组(12 Gy)、C组(6+6 Gy)、D组(10 Gy)、E组(6+4 Gy)、F组(8 Gy)、G组(4+4 Gy)。观察分析小鼠死亡情况(24w)及30、50、70 d受孕率。生精细胞损伤分析:72只雄鼠随机分为4组:正常对照组、6+4 Gy组、4+4 Gy组、6 Gy组。30、50、70 d观察睾丸组织切片(HE染色)并评估其生精功能(Johnsen评分);对PLZF阳性标记的精原干细胞(免疫组化法)计数。结果:A、E、F、G组生存时间较长,B、C组生存时间较短。30、50、70 d,D、E组受孕率均为0%。各照射组Johnsen评分均低于对照组(P0.05);6+4 Gy组的PLZF阳性细胞计数呈逐渐上升趋势,但均明显低于对照组(P0.05)。结论:6+4 Gy的60Co-γ射线照射7周龄的C57BL/6雄性小鼠,可以构建不育症模型。模型小鼠的PLZF标记的精原干细胞计数虽然低于对照组,但并非完全消失,提示不育症的原因并非精原干细胞的完全消亡。     

维生素A对体外培养小鼠精原干细胞生长增殖的影响

背景:维生紊A在体内对精原干细胞生长具有重要作用,目前还没有发现在体外培养过程中能够很好促进精原干细胞生长与分化的诱导物质.目的:探讨维生索A对体外培养小鼠精原干细胞生长增殖的影响.方法:无菌收集5～7 d龄昆明雄性小鼠双侧睾丸,采用差速贴壁联合非连续性Percoll密度梯度离心法分离纯化精原干细胞.无菌取出12～15 d龄昆明雄性小鼠双侧睾丸,酶消化法分离纯化Sertoli细胞,贴壁并极化后作为饲养层,将精原干细胞接种在单层Sertoli细胞上.设立2组,实验组向DMEM/F12培养液中加入1 g/L维生素A,对照组不添加维生素A.采用酶联仪测定精原干细胞生长增殖情况,流式细胞仪检测精原干细胞生长周期.结果与结论:共培养6,9,12,15d时,实验组精原干细胞吸光度值明显高于对照组(P＜0.05或0.01).随共培养时间的延长,实验组精原干细胞S期染色体含量逐渐增多,然后又逐渐下降,开始另一个分裂周期;与实验组比较,对照组精原干细胞S期染色体含量增长缓慢(P＜0.05).小鼠精原干细胞在体外培养过程中,维生素A可促进其增殖分化.     

枸杞多糖对精原干细胞体外增殖的影响

背景：精原干细胞移植对不育具有潜在的临床应用价值,体外建立精原干细胞的培养系统获得数量较多的精原干细胞,仍是目前研究中亟待解决的问题。目的：观察枸杞多糖对精原干细胞体外增殖的影响。方法：采用两步酶消化法获取出生4～6d雄性C57BL/6小鼠睾丸Sertoli细胞与精原干细胞,将精原干细胞接种在Sertoli细胞饲养层上,再加入枸杞多糖或联合细胞因子添加到细胞培养液中。1周后以流式细胞仪检测细胞周期及细胞活性率,并检测各组精原干细胞GFRa-1、Thy-1、c-kit的阳性率。结果与结论：单独加入枸杞多糖后精原干细胞数量明显增加,增殖明显,联合加入胶质细胞源性神经营养因子与白血病抑制因子精原干细胞增殖更加明显（P〈0.05）。并发现体外培养1周后的精原干细胞仍保持其睾丸组织内的精原干细胞特征,大多仍维持在未分化状态。表明在枸杞多糖或枸杞多糖联合胶质细胞源性神经营养因子及白血病抑制因子作用下,可促进精原干细胞体外增殖。     

精原干细胞和睾丸组织的同种异体移植

背景:精原干细胞作为精子发生过程的基础和前提,其自我更新和分化途径目前仍不完全清楚。目的:观察非免疫缺陷动物新生Wistar大鼠的精原干细胞和睾丸组织移植于去势成年Wistar大鼠后的成活及生长发育情况。设计、时间及地点:组织细胞形态学水平的随机动物对照实验,于2007-04/08在广西医科大学实验动物中心外科实验室完成。材料:选用健康新生7～9d雄性Wistar大鼠为供体,受体为经过严格检疫合格的8～12周的成年雄性Wistar大鼠,体质量180～220g。方法:取新生雄性大鼠睾丸,采用两步法组合酶顺序消化制备大鼠精原干细胞悬液,以Percoll不连续密度梯度离心法初步纯化精原干细胞。取10只成年雄性大鼠,切除双侧睾丸形成去势大鼠,按随机数字表法分为2组,每组5只。精原干细胞悬液移植组将制取好的1mL精原干细胞悬液在5min内注射至受体背部皮下。睾丸组织块移植组将制备好的已剖开的睾丸组织植入受体背部皮下,每个受体移植2个睾丸4块睾丸组织。主要观察指标:移植物的生长发育情况,移植8周末移植物的组织学特点及C-kit免疫组化定性分析结果。结果:精原干细胞悬液移植后,移植物未见成活生长。睾丸组织块移植后移植物部分...     

c-kit和P13K(P110α)在实验性隐睾精原细胞中的表达

目的:检测SD大鼠实验性隐睾早期不同时点精原细胞c-kit和H3K(P110α)的表达及其细胞周期的变化,探讨睾丸受热作用旱期,温度对精原细胞增殖的影响.方法:育龄期SD雄性大鼠32只,按随机数字表法分为实验组(n=24)和对照组(n=8).实验组建立隐睾模型,建模后1-3周末三个时点,随机8只取睾丸标本.对照组不干预取睾丸标本.SP免疫组化法观察睾丸形态学变化,非连续性Percoll密度梯度离心结合差速贴壁的方法纯化富集各组精原细胞,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Westemblot)检测各组精原细胞c-kit和P13K的mRNA及蛋白表达:流式细胞仪检测各组精原细胞的细胞周期.结果:对照组c-kit主要表达于精原细胞,而精母细胞、精子细胞有少量表达.实验组生精细胞明显减少,到第3周时仅见单层散在于基膜强表达c-kit的精原细胞,实验组各时点和对照组精原细胞大部分处于G0/G1期,s期及G2/M期均较少,实验组组间及与对照组比较无统计学差异性(P>0.05).结论:实验性隐睾可导致精原细胞的增殖信号增强,但并未诱导精原细胞处于增殖期的细胞增加,即体腔温度对体内精原细胞的增殖影响不大.     

白细胞介素3与c-kit~+Lin~-细胞的增殖

背景:c-kit+Lin-即为骨髓衍生肝干细胞,与其他造血干细胞类似,c-kit+Lin-细胞的数量有限,难以满足科研的需要。目的:观察在无血清无基质的条件下,白细胞介素3和因子组合对扩增c-kit+Lin-细胞的影响。方法:采用免疫磁珠法分离小鼠骨髓c-kit+Lin-细胞,在干细胞因子、肝细胞生长因子、FLt-3配基、促血小板生成素和白血病抑制因子组合中添加不同剂量的白细胞介素3培养7d,检测细胞总数、c-kit+Lin-细胞扩增倍数及细胞凋亡率。结果与结论:各因子组均可显著扩增c-kit+Lin-细胞,扩增倍数7~19倍不等。随白细胞介素3剂量加大,虽然细胞总数上升,但是超过一定浓度后c-kit+Lin-细胞扩增反而不明显。40μg/L白细胞介素3组细胞总数扩增245.41倍,但c-kit+Lin-细胞扩增仅为15.80倍,与20μg/L白细胞介素3组差异有显著性意义(P<0.05)。但40μg/L白细胞介素3组细胞凋亡率最低,仅为4.66%。提示白细胞介素3能协同干细胞因子+肝细胞生长因子+FLt-3配基+促血小板生成素+白血病抑制因子有效地扩增c-kit+Lin-细胞,其表型并不受影响,但过高剂量反而促使干细胞分化。20μg/L剂量的白细胞介素3扩增效果最佳。     

小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法的建立

背景:组织块培养睾丸生殖细胞对污染不容易控制,胰蛋白酶消化接种培养睾丸生殖细胞可能损伤细胞.目的:建立一种切实可行的小鼠睾丸间质细胞体外原代培养方法.方法:小鼠睾丸间质细胞的分离采用胶原酶消化法,纯化采用Percoll 等密度梯度离心法,活率鉴定采用锥虫蓝拒染法,纯度鉴定采用3.-羟基固醇脱氢酶染色方法.结果与结论:小鼠睾丸间质细胞纯度达可达90%以上;体外培养的细胞形态完整、增殖速度快、贴壁生长状态良好.说明实验成功建立了小鼠睾丸间质细胞的体外原代培养模型.