STAT3真核表达质粒的构建及对胃癌细胞增殖的影响

目的 构建人信号转导和转录激活因子3（STAT3）真核表达载体,研究STAT3基因对人胃癌细胞株MGC803的影响。方法 构建pcDNA3-STAT3真核表达质粒,经脂质体介导转染胃癌细胞株MGC803。RT-PCR和Western blotting检测转染后STAT3、P-STAT3(Y705)、P-STAT3(S727)、Survivin 和 PCNA在MGC803细胞中mRNA和蛋白水平的表达,CCK-8法检测pcDNA3-STAT3对细胞MGC803的影响。结果 测序及酶切鉴定证实,真核表达质粒pcDNA3-STAT3构建成功。Western blotting和RT-PCR实验结果证实,与转染空载体组相比,转染重组质粒组STAT3、P-STAT3(Y705)、P-STAT3(S727)、Survivin 和 PCNA在蛋白水平和mRNA水平的表达均明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。CCK-8实验结果显示,与转染空载体组相比,转染重组质粒组人胃癌细胞株MGC803增殖能力明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 真核表达质粒pcDNA3-STAT3可以提高STAT3基因在人胃癌细胞株MGC803中的表达,并且增强胃癌细胞的增殖能力。     

稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株的建立

目的 建立稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株。方法 使用阳离子脂质体分别将真核表达载体pCMV-Cdx2-HA或空载体pCMV-HA转染至人胃癌细胞MGC-803中,G418筛选出阳性克隆后扩大培养。RT-PCR和Western Blot技术检测各组胃癌细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达情况,将挑选出的稳定株命名为MGC-803/Cdx2细胞（转染组）和MGC-803/EV细胞（空载体组）;流式细胞仪检测MGC-803细胞（未转染组）、MGC-803/EV细胞和MGC-803/Cdx2细胞的细胞周期和凋亡情况。结果 成功筛选出稳定过表达Cdx2基因的MGC-803胃癌细胞,即MGC-803/Cdx2细胞;与MGC-803细胞和MGC-803/EV细胞比较,MGC-803/Cdx2细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达明显增加（P<0.05）,而且细胞周期G0/G1期比例和凋亡率也明显增加（P<0.05）。结论 成功构建了稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株,而且Cdx2过表达使细胞周期停滞、凋亡增加。     

稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

目的 构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的cDNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORα cDNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pcDNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的cDNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORα mRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。     

Survivin基因沉默抑制胃癌MGC-803细胞增殖并增强其对塞来昔布的敏感性

目的研究Survivin基因沉默对人胃癌MGC-803细胞增殖和对化疗药物塞来昔布敏感性的影响。方法设计合成Survivin的siRNA序列,LipofectamineTM2000转染入MGC-803细胞。采用RT-PCR和Western blotting检测Survivin在干扰后mRNA和蛋白的表达情况,利用流式细胞仪检测细胞周期。通过MTT法和细胞克隆形成试验法察Survivin基因沉默后MGC-803细胞对塞来昔布的敏感性。结果 Survivin基因沉默48 h后,MGC-803细胞的Survivin基因和蛋白表达明显降低(P<0.05)。细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数减少(P<0.05)。Survivin基因沉默组细胞对塞来昔布的敏感性显著性增强(P<0.05)。结论 Survivin特异性siRNA能显著沉默MGC-803细胞Survivin基因,抑制细胞增殖,并增强MGC-803细胞对塞来昔布的敏感性。     

抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及对人卵巢癌细胞系SW626增殖的影响

目的 构建抑癌基因PTEN的真核表达载体,研究外源性PTEN基因稳定表达对人卵巢癌细胞系SW626体外增殖的影响.方法 构建PTEN基因的真核表达载体pcDNA3.1/PTEN,转染重组质粒pcDNA3.1/PTEN于体外培养的人卵巢癌细胞系SW626,筛选并获得稳定表达PTEN基因的细胞克隆,应用RT-PCR和western blot分析PTEN基因的mRNA及蛋白质表达,MTT实验分析细胞增殖能力.结果 稳定转染PTEN基因的细胞系有外源目的 基因的mRNA及其蛋白表达.MTT实验表明,pcDNA3.1/PTEN 转染组细胞增殖能力低于pcDNA3.1(-)转染组和对照组 (P＜0.05).结论 外源性抑癌基因PTEN的稳定表达可抑制人卵巢癌细胞系SW626的增殖.     

RI基因真核表达载体的构建及其对人脐静脉内皮细胞的影响

目的构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,并检测核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因与血管生成素(angiogenin,ANG)的关系及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖及迁移能力的影响。方法用RT-PCR方法扩增RI基因,酶切后将其插入pcDNA3.1,构建融合表达载体pcDNA3.1-RI,在脂质体介导下转染HUVECs,RT-PCR检测RI、ANG基因的mRNA表达水平;Western blot检测RI、ANG、MMP-2、MMP-9的表达水平;CO-IP法检测ANG和RI的相互作用,MTT法检测细胞的增殖活力,流式细胞仪检测细胞周期分布。结果真核表达质粒构建成功;转染pcDNA3.1-RI组细胞RI基因的mRNA及蛋白的表达较2个对照组(转染pcDNA3.1空载体组和未转染质粒组)均呈显著性增加(P<0.05),而ANG基因的mRNA及蛋白的表达均降低(P<0.05),MMP-2、MMP-9蛋白表达水平亦降低(P<0.05);CO-IP法检测到ANG和RI在细胞内能结合;转染pcDNA3.1-RI质粒到HUVECs细胞后细胞的增殖活力明显降低(P<0.05),G0～G1期比例明显增加,S期减少。结论成功构建的真核表达质粒能显著增加RI基因及其蛋白水平的表达,RI可以直接在转录水平上降低ANG的表达,在细胞内与ANG结合,从而影响内皮细胞的增殖、迁移能力。     

TGFB1抑制A549细胞增殖的分子机制研究

①目的 构建并鉴定TGFB1真核表达载体pcDNA3.1/TGFB1,探讨TGFB1抑制A549细胞增殖的可能机制.②方法 采用基因重组技术将TGFB1 CDS 插入真核表达载体pcDNA3.1 (+),构建TGFB1真核表达质粒.脂质体介导转染肺癌细胞A549,分为正常对照、空质粒及转染组.MTT和集落形成实验检测各组细胞活性和细胞增殖能力.Real-time- PCR及Western blot方法 检测各组中TGFB1、p53、Bax和Fas的mRNA和蛋白的表达水平.③结果 酶切和测序结果 证实TGFB1真核表达质粒构建成功.MTT和集落形成实验结果 显示pcDNA3.1/TGFB1转染组、细胞活性和细胞增殖能力明显降低(P<0.01).pcDNA3.1/TGFB1转染组与正常对照组、空质粒组比较:TGFB1、p53、Bax和Fas mRNA表达显著增加(P<0.01);TGFB1、p53、Bax和Fas蛋白的表达水平显著增加(P<0.01).④结论 TGFB1可能通过上调p53、Bax和Fas蛋白的表达抑制肺癌细胞A549的增殖.TGFB1有可能成为肿瘤生物治疗的靶点.     

转染反义MIF对人胃癌细胞的影响

目的 探讨反义巨噬细胞移动抑制因子(MIF)对人胃癌MGC-803细胞的影响.方法 将胃癌MGC-803细胞分为pcDNA3.1-Anti MIF组与空白对照组.pcDNA3.1-Anti MIF组采用转染技术将MIF反义RNA真核表达质粒(pcDNA3.1-AntiMIF)转入MGC-803细胞;空白对照组转染pcDNA3.1-sh-MIF质粒.qRT-PCR与蛋白质印迹法检测转染效率;采用MTT法、侵袭实验、AnnexinV-FITC和PI染色法分别检测反义MIF对MGC-803细胞增殖、侵袭、凋亡的影响.结果 qRT-PCR结果显示,pcDNA3.1-Anti MIF组MIF mRNA表达量(2.086±0.248)较空白对照组(6.992±0.342)明显下调;Western blot显示,pcDNA3.1vAntiMIF组MIF蛋白表达水平量(0.361±0.043)较空白对照组(1.171±0.091)明显下调;MTT实验结果显示,pcDNA3.1-AntiMIF组MGC-803细胞的OD值(0.436±0.017)较空白对照组(0.563±0.019)明显下降;侵袭实验结果显示,pcDNA3.1-AntiMIF组穿过基质胶的MGC-803细胞数(73.67±8.54)较空白对照组(137.30±11.91)明显减少;AnnexinV-FITC和PI染色法结果显示,pcDNA3.1-AntiMIF组MGC-803细胞的凋亡率(21.61±4.62)%较空白对照组(7.67±0.63)%明显增加.以上各项指标比较差异均具有显著统计学意义(P<0.01).结论 反义MIF能抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖与侵袭,并能诱导凋亡.     

人AQP5真核表达质粒的构建及其在胃癌细胞中的表达

目的构建人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒,观察水通道蛋白5(AQP5)基因在胃癌AGS细胞中的稳定表达。方法采用基因重组技术将人AQP5cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His,构建人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒。脂质体介导空载体pcDNA3.1/myc-His和表达质粒pcDNA3.1-AQP5/myc-His分别转染人胃癌AGS细胞株,G418筛选,挑取阳性克隆,扩大培养,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)分别检测AQP5mRNA和蛋白表达。结果双酶切和基因测序结果均证实人pcDNA3.1-AQP5/myc-His真核表达质粒构建成功。AQP5转染组与空白对照组、空载体组比较,AQP5mRNA表达显著增加(P<0.05),AQP5蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论成功构建人AQP5真核表达质粒并获得稳定表达AQP5基因的胃癌AGS细胞系,为进一步研究AQP5蛋白对胃癌恶性表型的影响奠定实验基础。     

健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G）基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。     

转录因子E2F-1过表达抑制胃癌细胞MGC-803的增殖

目的 了解E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803增殖、生长和细胞周期的影响。方法 PCR扩增E2F-1基因片段;然后经限制性内切酶 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后将E2F-1定向克隆到真核表达载体pCMV-HA2中转化筛选。用脂质体Lipofectamine2000将该载体转染MGC-803胃癌细胞,然后用含G418的培养基筛选获得具Genectin抗性的过表达E2F-1的胃癌细胞株。RT-PCR和Western blotting技术检测MGC-803/E2F-1细胞内E2F-1表达情况。对稳定转染E2F-1的胃癌MGC-803/E2F-1细胞(实验组)、转染空载体的MGC-803/EV(阴性对照组)及未转染的MGC-803细胞进行MTT法检测,绘制生长曲线和计算细胞增殖率;流式细胞仪检测各组细胞周期分布。结果 RT-PCR和Western blotting 实验证实重组载体pCMV-E2F-1-HA2成功转入胃癌细胞内,并稳定过表达E2F-1。MTT法检测发现,与MGC-803/EV细胞组和MGC-803细胞组相比,胃癌MGC-803/E2F-1细胞的生长受到明显抑制,增殖率下降(26.61±5.19)% vs （93.4±10.29）%、（100±0.00）%,均P <0.01);细胞周期分析显示MGC-803/E2F-1组的细胞在G0/G1期所占比例为70.63%,高于MGC-803/EV组（60.03%,P<0.01）和MGC-803细胞组（60.43%,P<0.01）;MGC-803/E2F-1组的细胞在S期所占比例为(11.27%),明显低于MGC-803/EV组（28.70%,P<0.01）和MGC-803细胞组（29.70,P<0.01）。结论 E2F-1基因过表达抑制胃癌细胞的增殖和生长,细胞周期停滞在G0/G1期。     

稳定过表达Cdx2基因胃癌细胞株的建立

目的 建立稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株.方法 使用阳离子脂质体分别将真核表达载体pCMV-Cdx2-HA或空载体pCMV-HA转染至人胃癌细胞MGC-803中,G418筛选出阳性克隆后扩大培养.RT-PCR和Western Blot技术检测各组胃癌细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达情况,将挑选出的稳定株命名为...     

人胃癌细胞株MGC-803 FHIT基因转染对阿霉素敏感性的影响

目的：将FHIT基因导入该基因表达缺失的人胃癌细胞株MGC-803,探讨胃癌中FHIT基因表达对阿霉素（ADM）敏感性的影响。方法：将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pRcCMV-FHIT用脂质体介导转入FHIT蛋白表达缺失的胃癌细胞株MGC-803,筛选阳性克隆,同时以空载体pRcCMV转染的胃癌细胞及未转染的胃癌细胞株作为对照,以ADM作用于三组细胞,用MTT法测定细胞的生长抑制率,用流式细胞仪检测ADM处理前后各组胃癌细胞的凋亡率及细胞周期的变化。结果：经ADM处理后,转染FHIT基因的MGC-803细胞的凋亡水平（40.66%）与空质粒转染组（13.94%）及胃癌细胞株组（15.81%）相比明显增高（P＜0.01）,并且FHIT基因与ADM有轻度的协同促进凋亡作用（P＜0.05）;同时ADM处理前后实验组胃癌细胞的生长周期较对照组均出现了明显的G0/G1期阻滞（74.43% vs 56.30%,99.27% vs 95.10%）,且细胞的生长抑制率存在浓度和时间依赖性。结论：外源性FHIT基因表达与ADM协同促进MGC-803细胞凋亡及细胞周期阻滞,FHIT基因可增加胃癌细胞对ADM的敏感性。     

外源性FHIT基因对人胃癌细胞株MGC-803增殖与凋亡的影响

目的：研究三联脆性组氨酸基因（fragile histidine triad,FHIT）对胃癌细胞株MGC 803增殖与凋亡作用的影响,并探讨FHIT基因的抑癌机制。方法：通过脂质体介导把质粒pRC/CMV-FHIT及pRC/CMV转染到有FHIT基因表达缺失的胃癌细胞株MGC-803,用G418对转染后细胞进行筛选,用Western blot对获得G418抗性的细胞进行FHIT基因表达的鉴定。用MTT法、克隆形成试验及流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。 结果：转染FHIT基因的MGC-803细胞有外源性FHIT基因的表达,其增殖活性减弱、克隆形成能力降低、凋亡率增加、生长周期出现明显的G₀/G₁期阻滞,且与对照组差异均有统计学意义。结论：向胃癌细胞中导入外源性FHIT基因可以抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡并引起细胞生长周期阻滞。     

血管生成素-1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究

目的:探讨人血管生成素-1(Ang1)及其与血管内皮生长因子165(VEGF165)共同作用对人胃癌细胞的生物学作用,研究其在肿瘤发生中的作用机制。方法:应用复制缺陷型腺病毒(Ad)-绿色荧光蛋白(GFP)、Ad-Ang1、Ad-VEGF165和Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染人胃癌细胞株MGC-803,使用MTT比色法分析它们对胃癌细胞增殖的影响;通过流式细胞仪分析血浆饥饿时其对凋亡的影响;使用免疫细胞化学法检测Ki-67的表达;应用RT-PCR方法半定量检测bcl-2 mRNA、bax mRNA的表达情况。结果:MTT结果显示24、48和72 h Ad-Ang1转染组、Ad-VEGF165转染组和Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染组吸光度均明显高于Ad-GFP组及对照组(P<0.05);Ad-GFP组与对照组相比无显著差异(P>0.05);Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2转染组吸光度明显高于Ad-Ang1转染组和Ad-VEGF165转染组(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示Ad-Ang1、Ad-VEGF165及Ad-Ang1 Ad-VEGF165/2处理组与对照组及空转染组相比均能够显著抑制细胞凋亡(P<0.01)。免疫细胞化学法显示各转染组Ki-67表达强度均显著高于对照组和Ad-GFP组(P<0.01)。RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA在各转染组中的表达要明显高于对照组(P<0.05);bax mRNA在各转染组中的表达要明显低于对照组(P<0.05)。结论:Ang1、VEGF165和Ang1 VEGF165/2能够明显促进人胃癌细胞MGC-803增殖,抑制血浆饥饿时的凋亡,Ang1 VEGF165/2组的作用要显著强于Ang1组和VEGF165组。     

血管生成素-1在体外对人胃癌细胞生物学作用的研究

目的：探讨人血管生成素-1（Ang1）及其与血管内皮生长因子165（VEGF165）共同作用对人胃癌细胞的生物学作用,研究其在肿瘤发生中的作用机制。方法：应用复制缺陷型腺病毒（Ad）．绿色荧光蛋白（GFP）、Ad-Ang1、Ad-VEGF165和Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2转染人胃癌细胞株MGC-803,使用MTT比色法分析它们对胃癌细胞增殖的影响;通过流式细胞仪分析血浆饥饿时其对凋亡的影响;使用免疫细胞化学法检测Ki-67的表达;应用RT-PCR方法半定量检测bcl-2mRNA、bax mRNA的表达情况。结果：MTT结果显示24、48和72h Ad-Ang1转染组、Ad-VEGF165转染组和Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2转染组吸光度均明显高于Ad-GFP组及对照组（P〈0．05）：Ad-GFP组与对照组相比无显著差异（P〉0．05）;Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2转染组吸光度明显高于Ad-Ang1转染组和Ad-VEGF165转染组（P〈0．05）。流式细胞仪检测结果显示Ad-Ang1、Ad-VEGF165及Ad-Ang1＋Ad-VEGF165／2处理组与对照组及空转染组相比均能够显著抑制细胞凋亡（P〈0．01）。免疫细胞化学法显示各转染组Ki-67表达强度均显著高于对照组和Ad-GFP组（P〈0．01）。RT-PCR结果显示bcl-2 mRNA在各转染组中的表达要明显高于对照组（P〈0．05）;bax mRNA在各转染组中的表达要明显低于对照组（P〈0．05）。结论：Ang1、VEGF165和Ang1＋VEGF165／2能够明显促进人胃癌细胞MGC-803增殖,抑制血浆饥饿时的凋亡,Ang1＋VEGF165／2组的作用要显著强于Ang1组和VEGF165组。     

cdx2真核表达质粒的构建

目的：构建含有cdx2全长基因的真核表达质粒并在人胃上皮细胞系中表达。方法：从人结肠上皮组织中提取总RNA,RT-PCR获得全长人cdx2基因的cDNA,测序证实序列正确后亚克隆入pcDNA3.1来构建重组真核表达载体pcDNA3.1/cdx2。使用脂质体将该重组质粒转染入人胃上皮细胞GES-1中,RT-PCR证明该细胞中出现人cdx2基因的表达。结果：酶切鉴定和测序显示靶基因cdx2克隆到pcDNA3.1质粒中,RT-PCR证实转染的人胃上皮细胞中有人cdx2基因的表达。结论：成功构建含有人cdx2基因的真核表达质粒。并在人胃上皮细胞中表达。     

最小努力(惰性)原则与慢性病预防行为选择

目的:探讨长链非编码RNA MEG3在胃癌组织及细胞系中的表达水平,以及过表达MEG3对胃癌细胞增殖能力的影响,并探索其可能的作用机制?方法:用定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测胃癌组织及细胞系中MEG3的表达水平;通过转染pcDNA-MEG3上调MEG3的表达水平,并通过qRT-PCR检测转染效率?用MTT和克隆形成试验检测上调MEG3的水平对BGC-823细胞和MGC-803细胞的增殖能力的影响,Western blot检测这两种细胞中上调MEG3的水平对p53蛋白的表达水平的影响?结果:相比正常胃组织及细胞,在胃癌组织和细胞中MEG3的表达出现显著下调,SGC7901?MGC-803和BGC-823细胞中MEG3的表达水平分别是正常胃上皮细胞GES-1中的73.6%?42.0%和27.1%(P < 0.05)?BGC-823细胞和MGC-803细胞中转染pcDNA-MEG3能显著上调MEG3的表达,MEG3的表达水平分别为对照组的252倍和311倍(P < 0.05);MTT和克隆形成试验显示,上调MEG3的表达能降低BGC-823细胞和MGC-803细胞的增殖能力?Western blot实验显示,转染了pcDNA-MEG3的MGC-803和BGC-823细胞中p53的表达相较对照组中显著增加?结论:胃癌组织及细胞中MEG3的表达下调,且这可能通过抑制p53蛋白的激活从而促进胃癌细胞增殖,影响胃癌的发生和发展?