红藻氨酸致痫后大鼠海马神经元和星形胶质细胞的反应性变化

目的研究红藻氨酸(Kainic acid, KA)诱导大鼠癫痫发作后海马内神经元和星形胶质细胞的反应变化情况。方法立体定向大鼠侧脑室内注射KA引起大鼠癫痫发作,用抗即早反应基因Fos蛋白和抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学方法,分别观察痫性发作后在各时间点反应性神经元和星形胶质细胞在海马各区的分布情况。结果KA诱导大鼠癫痫发作后,海马内Fos阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞明显增多。癫痫发作30 min后GFAP开始增多,1 h达高峰;1 h 后Fos阳性产物开始增多,2 h达高峰。结论海马内反应性的神经元和星形胶质细胞在癫痫发作后增加,反应性星形胶质细胞可能参与癫痫的发生及其调节。     

雷公藤甲素对KA损伤大鼠星形胶质细胞的影响

目的:观察海人藻酸(Kainic acid,KA)海马内注射后星形胶质细胞的变化及雷公藤甲素(TRP)对其的影响。方法:90只SD大鼠(200～220g)随机分为3组:右侧海马注射生理盐水后生理盐水灌胃作为对照组(NS NS),右侧海马注射海人藻酸后生理盐水灌胃干预组(KA NS),右侧海马注射海人藻酸后雷公藤甲素灌胃干预组(KA TRP)。动物存活1天,3天,5天,7天,14天后免疫组织化学结合图像分析技术观察海马内星形胶质细胞形态和数目的变化。结果:(KA NS)组海马内星形胶质细胞数目明显增多,胞体明显增大,突起变短,变粗,与(NS NS)组相比差别具有显著性(p<0.05)(;KA TRP)组星形胶质细胞数量明显减少,胞体变小,突起变细长,与(KA NS)组相比差别具有显著性(P<0.05)。结论:KA注射后可导致大鼠海马内星形胶质细胞的激活,雷公藤甲素对KA诱导的星形胶质细胞的活化有抑制作用。     

迷走神经刺激对海人酸致痫大鼠海马胶质细胞胶原纤维酸性蛋白的影响

目的观察迷走神经刺激（VNS）对海人酸（KA）致痫大鼠海马星形胶质细胞（AS）的胶原纤维酸性蛋白（GFAP）的影响,探讨AS与癫痫的关系及在VNS治疗癫痫中的作用。方法 36只SD大鼠随机分为对照组、KA组和VNS＋KA组,每组12只。侧脑室注射0.05%KA溶液3μL制作大鼠癫痫模型;采用免疫组织化学和western blot方法检测VNS后KA致痫大鼠海马星形胶质细胞GFAP的变化。结果大鼠侧脑室注入KA后3～5min内癫痫发作,发作级别按国际公认Racine标准均达到Ⅳ～Ⅴ级;KA组大鼠海马GFAP阳性细胞数,western blot值显著高于对照组（P〈0.01）,VNS＋KA组大鼠海马GFAP阳性细胞数和western blot值显著低于KA组（P〈0.01）。结论 VNS可抑制KA致痫大鼠海马星形胶质细胞GFAP的表达,提示抑制星形胶质细胞激活可能是VNS抑制癫痫的作用机制之一。     

红藻氨酸致病后大鼠海马神经元和星形胶质细胞的反应性变化

目的 研究红藻氨酸(Kainieacid，KA)诱导大鼠癫痫发作后海马内神经元和星形胶质细胞的反应变化情况。方法 立体定向大鼠侧脑室内注射KA引起大鼠癫痫发作。用抗即早反应基因Fos蛋白和抗神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的免疫组织化学方法，分别观察痫性发作后在各时间点反应性神经元和星形胶质细胞在海马各区的分布情况。结果 KA诱导大鼠癫痫发作后，海马内Fos阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞明显增多。癫痫发作30min后GFAP开始增多，1h达高峰；1h后Fos阳性产物开始增多，2h达高峰。结论 海马内反应性的神经元和星形胶质细胞在癫痫发作后增加，反应性星形胶质细胞可能参与癫痫的发生及其调节。     

脑室内注射脂多糖大鼠海马部位星形胶质细胞的变化

目的研究侧脑室注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引发大鼠脑内炎性反应时,海马部位星形胶质细胞的变化。方法健康雄性SD大鼠64只,采用数字表法随机分为0.9%氯化钠注射液(normal saline,NS)对照组和LPS实验组。LPS实验组大鼠右侧脑室一次性注射LPS 20μL(1.25 g/L),NS对照组大鼠脑室内注射同等体积的NS。于注射后2、4、12及24周应用免疫组织化学染色方法观察大鼠海马部位星形胶质细胞特异性标志物-胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性细胞的变化,并应用Western blotting方法检测大鼠海马部位GFAP蛋白表达的变化。结果 GFAP免疫组织化学染色结果显示,NS对照组大鼠不同时间点海马部位星形胶质细胞均未见明显激活。LPS实验组大鼠海马部位星形胶质细胞在LPS注射后2周明显激活,而LPS注射后4周和12周时海马部位星形胶质细胞激活不明显。LPS注射后24周时,LPS实验组大鼠海马部位星形胶质细胞又出现轻度激活。Western blotting结果显示,NS对照组大鼠不同时间点海马部位GFAP蛋白表达量无明显变化。LPS实验组大鼠海马部位GFAP蛋白表达量在LPS注射后2周时明显高于相应NS对照组,为相应NS对照组的2.39倍,差异有统计学意义(P<0.01)。而注射后4周及12周时,LPS实验组大鼠海马部位GFAP蛋白表达量与相应NS对照组相比变化不明显。到注射后24周时,LPS实验组大鼠海马部位GFAP蛋白表达量为相应NS对照组的1.19倍,差异无统计学意义(P>0.05)。结论侧脑室注射LPS可在早期(注射后2周)显著引起大鼠海马部位星形胶质细胞的急性激活。     

脂多糖联合海人藻酸诱导的热性惊厥导致幼鼠海马神经元凋亡

目的观察热性惊厥(FS)幼鼠海马神经细胞凋亡数变化,为探讨幼鼠FS脑损伤机制及寻求有效的防治措施提供理论依据。方法按析因设计,64只14日龄SD幼鼠随机均分为4组(n=16),即对照组:生理盐水(NS)组;试验组:脂多糖(LPS)+海人藻酸(KA)组;KA组;LPS组。采用LPS联合低剂量KA腹腔注射的方法诱导幼鼠FS。H-E染色观察幼鼠海马神经元显微结构的改变,TUNEL法检测海马神经细胞凋亡数的变化。结果 LPS+KA组16只幼鼠均出现FS,发作时肛温为(39.3±0.4)℃;其他组幼鼠均未出现FS。LPS+KA组、LPS组、KA组及NS组幼鼠末次腹腔注射后24h,海马CA1区神经细胞凋亡数分别为(20.63±3.78),(11.63±3.58),(4.06±2.86)及(3.06±2.01),48h分别为(20.63±1.69),(12.25±3.62),(5.50±3.06)及(3.19±1.98)。FS持续时间与海马细胞凋亡程度呈正相关(r=0.866,P<0.01)。结论 LPS联合低剂量KA腹腔注射诱导FS可导致幼鼠海马神经细胞损伤。     

肿瘤坏死因子致惊厥大鼠海马胶质原纤维酸性蛋白的变化

目的 观测肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α,TNFα)致惊厥大鼠海马星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达的变化。方法 正常SD大鼠侧脑室注射TNFα(500ng),观察大鼠行为学表现及海马脑电图的变化,应用免疫组织化学ABC法观察大鼠海马胶质细胞的形态学改变及GrrAP的表达情况。结果 ①TNFα注射后10～30min大鼠出现Ⅱ～Ⅲ级癫痫样发作,可持续达2h;②大鼠海马脑电图呈现阵发性痫样放电;③侧脑室注射TNFα2h,注射侧海马槽星形胶质细胞首先呈现激活反应,随后整个海马结构呈现胶质细胞功能活跃的形态学表现;GF、AP-IR阳性细胞胞体增大,分枝突起增粗、增多,GFAP的表达水平显著上调,1周后与生理盐水对照组比较无显著性差异。结论 侧脑室注射外源性TNFα可引起大鼠癫痫样发作,此条件下海马星形胶质细胞GFAP表达上调。     

TSA对发育期大鼠癫痫后脑损伤的保护作用及其机制

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑素A(TSA)在癫痫后脑损伤发病中的作用及其机制。方法将32只雄性SD大鼠随机分为4组:对照组、海人酸(KA)组、小剂量TSA干预组(0.03 mg/kg)及大剂量TSA干预组(0.1 mg/kg)组,通过腹腔注射海人酸(KA)制作发育期大鼠癫痫模型,TSA于KA诱导癫痫前2 h腹腔注射给药,评估惊厥发作的等级及记录惊厥的潜伏期。癫痫后24 h处死大鼠,HE染色观察脑组织病理变化;TUNEL染色检测大鼠海马神经元细胞凋亡;CD68染色检测活化的小胶质细胞;Western blot检测IL-1β和TNF-α蛋白的表达。结果KA组均达到Ⅳ~V级惊厥发作,而TSA干预组能减轻惊厥发作的等级和延长惊厥的潜伏期。HE染色可见KA组明显的神经元凋亡及细胞水肿,伴有较多的炎症细胞浸润,而TSA干预组能减轻神经元凋亡及细胞水肿,同时减少炎症细胞浸润。与对照组比较,KA组神经元凋亡数、小胶质细胞活化数及炎症因子的表达均显著增加(P<0.05),而TSA能抑制KA诱导的改变。相对于0.03 mg/kg TSA干预组,0.1 mg/kg TSA干预组治疗作用更明显(P<0.05)。结论TSA能抑制癫痫后海马神经元凋亡、小胶质细胞活化及炎症因子的表达,同时能减轻惊厥发作的等级和延长惊厥的潜伏期,从而对癫痫后脑损伤起到保护作用。     

戊四氮点燃大鼠海马星形胶质细胞巢蛋白的表达

目的：观察戊四氮点燃大鼠海马各区巢蛋白(nestin)的表达,以探讨其与癫痫发病机制的关系。方法：将20只成年雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组,实验组采用戊四氮点燃大鼠模型,观察大鼠痫性发作行为和脑电图表现,用免疫组织化学方法观察海马各区星形细胞活化标志巢蛋白表达的变化。结果：实验组大鼠于4周后均达到点燃状态,而对照组行为正常。2组脑电图背境电活动以a节律为主,实验组Ⅳ或Ⅴ级痫性发作时脑电图均出现典型的高波幅棘慢波、尖慢波。实验组海马各区nestin阳性星形细胞较对照组明显增多。结论：戊四氮点燃引起海马内nestin阳性星性细胞明显增加,提示癫痫脑组织内存在星形细胞增生和活化,这可能是癫痫脑组织胶质化及点燃维持的病理基础。     

星形胶质细胞参与脑内炎症致大鼠多巴胺能神经元变性

目的 观察脑室内注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的脑内炎症对大鼠黑质多巴胺能神经元的慢性毒性作用,探讨星形胶质细胞是否参与脑内炎症致大鼠多巴胺能神经元变性.方法 60只SD大鼠分为LPS实验组和生理盐水(NS)对照组(n=30).大鼠右侧脑室一次性注射LPS 20μl(1.25μg/μl)或同体积的NS.于给药后不同时间检测大鼠行为,免疫组织化学染色法观察黑质内酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元,并用Western blot检测大鼠黑质纹状内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果 1)LPS给药后大鼠平均运动速度呈进行性下降,与相应NS对照组相比,在16周[(2.12±0.43) cm/s,(1.67±0.36)cm/s,t=2.537,P<0.05]、20周[(2.03±0.31)cm/s,(1.46±0.33) cm/s,t=3.981,P<0.01]和24周[(2.00±0.36)cm/s,(1.46±0.32)cm/s,t=3.545,P<0.01]均差异有显著性.LPS给药后大鼠黑质TH阳性神经元数量减少,在24周时是相应NS对照组的75.4% (P<0.01).2) LPS实验组大鼠给药后2周时,黑质纹状体部位GFAP蛋白表达量比相应NS对照组明显增高,为NS对照组的258%(P<0.01).到给药后24周时,LPS实验组大鼠黑质纹状体内GFAP蛋白表达量又比NS对照组明显增高,为NS对照组的168%(P<0.05).结论 侧脑室注射LPS引发大鼠黑质部位星形胶质细胞激活,参与了黑质多巴胺能神经元的变性过程.     

神经肽Y基因转染对大鼠癫痫发作及海马磷酸化Tau蛋白的影响

目的 探讨神经肽Y基因（rAAV2/1-hNPY-EGFP）转染对大鼠癫痫发作行为、脑电图（electroencephalogram,EEG）及其海马磷酸化Tau蛋白的影响.方法 将实验组动物分为3组：对照组、KA组及NPY组,每组24只.NPY组向侧脑室注射10μl的rAAV2/1-NPY-EGFP（滴度为5×1011v.g./ml）,KA组向侧脑室注射等量生理盐水.对照组在海马CA3区及侧脑室注射等量生理盐水.利用视频监视系统观察注射后2周和4周各组大鼠癫痫发作情况、发作潜伏期以及EEG,同时应用Western blotting方法检测大鼠海马中磷酸化Tau蛋白的表达.结果 （1）2周时NPY组大鼠行为学发作级别[（12.13±8.06）分]与KA组相比[（12.10±8.07）分]无明显差异（P＞0.05）,4周时NPY组大鼠行为学发作级别降低[（6.06±3.78）分]、发作潜伏期延长[（79.06± 8.83） min]、脑电图癫痫波放电频率减少、波幅降低（P＜0.05）,对照组无发作;（2）与对照组相比,KA组和NPY组大鼠在2周和4周时磷酸化Tau蛋白表达水平均明显增加（P＜0.05）;与KA组相比（1.87±0.23 RQ value）,4周时NPY组大鼠海马组织中磷酸化Tau蛋白表达水平（1.15±0.16 RQ value）显著降低（P＜0.05）.结论 磷酸化Tau蛋白在癫痫大鼠海马组织中的表达变化与癫痫发作密切相关;rAAV2/1-hNPY-EGFP基因转染可以明显减轻大鼠癫痫发作级别,并可延长发作潜伏期.rAAV2/1-hNPY-EGFP基因转染可能通过抑制KA诱导的大鼠癫痫发作时磷酸化Tau蛋白的表达而发挥抗癫痫作用.     

愈痫灵方对难治性癫痫大鼠多药耐药相关蛋白MRP1、P-gp、LAP、MCP-1表达的作用

目的：探讨“愈痫灵”方对红藻氨酸（KA）致痫难治性癫痫模型大鼠海马及颞叶皮质区多药耐药相关蛋白1（MRP1）、P糖蛋白（P-gp）、层黏连蛋白（LAP）以及单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)表达的影响。方法（1）造模：在脑立体定位仪引导下,海马区微量进样器注入KA1.0μL（即1.0μg）点燃发作,选取发作行为级别在Racines标准Ⅳ级以上者,以丙戊酸钠及卡马西平灌胃干预14 d后,再次以亚惊厥剂量KA0.5μL复燃,筛选再次发作级别在Ⅳ级以上或持续状态大鼠,且脑电图检测有癫痫样波放电者为造模成功的耐药难治性癫痫模型鼠。（2）分组与处理：造模成功鼠随机分为愈痫灵方干预组、拉莫三嗪对照组、模型组,另设假手术对照组、空白对照组共5组,分别给予“愈痫灵”汤剂、拉莫三嗪及同等体积的蒸馏水(2 mL/d)灌胃30 d。（3）标本处置与检测：采用免疫组织化学技术,检测多药耐药相关蛋白MRP1、P-gp、LAP、MCP-1在海马与颞叶皮层的表达。结果与假手术对照组、空白对照组间比较,造模成功组海马区及颞叶皮质区MRP1、P-gp、LAP、MCP-1的表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,愈痫灵、拉莫三嗪干预处理后能显著降低模型鼠海马区MRP1、P-gp表达水平（P<0.05）,海马区及颞叶皮质区LAP、MCP-1的表达差异均无统计学意义(P>0.05);愈痫灵方组与拉莫三嗪组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);各组间颞叶皮质区LAP、MCP-1表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论耐药性癫痫大鼠模型海马及颞叶皮质区多药耐药相关蛋白MRP1、P-gp、LAP、MCP-1表达均明显升高,逆转与降低海马区MRP1、P-gp的表达可能是“愈痫灵”方抗耐药性癫痫作用机制之一。     

海人酸杏仁核点燃癫痫大鼠海马和顶叶皮层脑电图改变

目的：记录和比较海人酸（KA）杏仁核点燃癫痫大鼠海马和顶叶皮层脑电图。方法：选用雄性Wistar大鼠,以右侧杏仁核外侧基底核为给药靶点,在立体定位仪下,微量注射KA建立点燃癫痫模型,在对大鼠行为学观察的同时,连续记录大鼠点燃后6 h左侧海马 和顶叶皮层脑电图。结果：大鼠点燃后脑电图依次出现多种形式的癫痫放电,以多发性棘波为主。海马和顶叶癫痫放电潜伏期,每小时放电持续时间、6 h总放电时间和波幅差异均无显著性。结论：KA杏仁核点燃大鼠脑电图改变符合颞叶癫痫特征,大鼠点燃急性早期癫痫放电在皮层间传播迅速,点燃灶对侧海马和顶叶皮层脑电图具有高度一致性,监测顶叶皮层脑电图可能更适用于对该模型的电生理学观察。     

戊四氮致癫痫大鼠脑内nNOS表达的实验研究

目的探讨一氧化氮合酶(NOS)的nNOS(神经元型)亚型在戊四氮致癫痫大鼠模型中海马部位的变化情况。方法 PTZ点燃癫痫大鼠,随机分为对照组、PTZ组观察大鼠癫痫发作后的行为学变化,脑电图描记,采用免疫组化,免疫印迹(Western blot)方法检测大鼠海马组织中nNOS表达的影响。结果注射PTZ后大鼠出现癫痫发作。EEG表现为尖、棘波节律。nNOS在癫痫大鼠大脑海马区阳性细胞表达升高。结论 PTZ诱导癫痫发作大鼠海马区内nNOS阳性细胞表达升高,起到致癫痫的作用。     

穴位埋药线对难治性癫痫大鼠癫痫样波的发放及大脑海马和颞叶皮质多药耐药相关蛋白MRP1、P-gp表达的影响

目的：探讨穴位埋药线对难治性癫痫大鼠癫痫样波的发放及大脑海马和皮质中多药耐药相关蛋白 MRP1、P-gp表达的影响。方法（1）造模：大鼠海马区注射红藻氨酸（KA）,经过点燃和再次亚惊厥剂量点燃造模,且脑电图检测有癫痫样波发放者筛选为造模成功耐药难治性癫痫模型鼠。（2）分组与处理：普通线组（PTX组）与药线组（YX组）,先埋一侧穴位,间隔15 d后埋对侧穴位。拉莫三嗪组（LTG组）按照人用拉莫三嗪剂量换算灌胃大鼠,每日2次;空白对照组（Normal组）和模型组（Model组）给予灌胃同等体积的蒸馏水,均灌胃30 d。（3）采用VEEG-1518K型数字化视频脑电监测分析系统检测脑波基本节律的波幅与频率变化。（4）标本处理与检测：采用免疫组织化学技术,检测多药耐药相关蛋白MRP1、P-gp在海马与颞叶皮层不同部位的表达。结果各组治疗前比较差异无统计学意义（P＞0.05）;各组治疗后,YX组、LTG 组分别与Model 组、PTX组比较差异有统计学意义（P＜0.05）,YX组与LTG组比较差异无统计学意义（P＞0.05）;与Model组相比,LTG组和YX组干预后能降低致痫鼠EEG 痫波放电持续时间与发放频率以及海马区和颞叶皮质区多药耐药蛋白 MRP1、P-gp 的表达水平（P<0.05或P<0.01）;YX组与PTG组比较差异无统计学意义(P<0.05)。结论（1）埋药线使KA致痫鼠EEG痫波放电持续时间缩短,发放频率减少。（2）KA点燃难治性癫痫模型大鼠大脑海马区存在多药耐药蛋白MRP1、P-gp的表达较皮质区明显升高。（3）埋药线逆转与降低致痫鼠海马区多药耐药蛋白MRP1、P-gp的表达水平,可能是其抗癫痫生物学作用机制之一。     

红藻氨酸致癫痫大鼠脑内一氧化氮合酶的动态表达研究

目的探讨一氧化氮合酶（NOS）的三种不同亚型nNOS、iNOS、eNOS在红藻氨酸（KA）了致癫痫SD大鼠模型中不同部位和不同时间的变化情况。方法KA点燃癫痫SD大鼠,随机分为对照组、KA组,在致痫1、7、14、21和28d各个时间点,观察大鼠癫痫发作后的行为学变化,脑电图描记,采用免疫组化的方法研究三种不同NOS（nNOS、iNOS和eNOS）的表达。结果注射KA后大鼠出现癫痫发作,7～28d可见癫痫慢性自发发作。EEG表现为尖、棘波节律,7～28d仍可见痫性活动。KA致痫后1d,nNOS在CA1、CA2、CA3区表达较对照组明显增多,7d时开始出现下降,在cA2、CA3区14d后又出现增多,在颞叶从1d开始就持续高水平的表达,而在齿状回和丘脑不同时间点nNOS阳性细胞表达都很低。iNOS在1d时各区表达均较对照组增高,之后在CA1、CA2、CA3区及颞叶阳性细胞出现减少,而在齿状回及丘脑7、14d有所下降,之后又出现高表达。eNOS在KA致痫后1d在CA1、CA2及齿状回区表达较对照组增高,7d时出现下降,之后叉出现增多,但eNOS阳性细胞在CA3区却表现为癫痫发作后1、7d时出现少,在14d以后才大量出现,并逐渐增加,在颞叶及丘脑,1d时与对照组无明显差异,7d时才开始表达增高,并持续高表达至28d。结论KA诱导癫痫发作大鼠脑内不同类型NOS在不同的时间和部位表达不同。