苯并芘激活ERK1/2信号通路促进气道平滑肌细胞外基质蛋白沉积对气道重塑的影响

目的 探讨苯并芘对人气道平滑肌细胞(HASMC)细胞外基质(ECM)蛋白沉积的影响及相关通路机制.方法 原代培养HASMC,将2～6代细胞用于实验.用实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测ECM的基因及蛋白的表达量;用Western Blot法分析ERK1/2的磷酸化水平.结果 苯并芘可以诱导HASMC胶原蛋白Ⅰα1(P＜0.01)及ECM蛋白(包括胶原蛋白Ⅰ α1、多功能蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白α2)mRNA表达增加(P＜0.05).苯并芘可引起ERK1/2磷酸化水平快速增高(P＜0.01);ERK通路抑制剂PD98059能显著抑制苯并芘诱导的胶原蛋白Ⅰ α1(P＜0.01)及ECM蛋白(包括胶原蛋白Ⅰ α1、纤连蛋白、多功能蛋白聚糖、层粘连蛋白α2) mRNA表达增加(P＜0.01).结论 苯并芘通过激活ERK1/2通路诱导HASMC中ECM蛋白沉积,阻断ERK1/2信号通路可以抑制苯并芘诱导的气道重塑.     

PD98059联合顺铂对卵巢癌细胞增殖的影响

目的   观察MEK1/2特异性抑制剂PD98059联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响。 方法   按不同处理因素对卵巢癌SKOV3细胞分组：空白对照组、单纯PD98059组、单纯顺铂组、联合用药组。CCK-8法检测各组细胞的增殖抑制率。实时定量PCR检测各组细胞含有WW结构域的氧化还原酶(WWOX)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)在基因水平的表达。Western-blot检测各组细胞磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白的表达。光镜下观察各组细胞的生长状态及形态学改变。流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。结果   联合用药组细胞增殖抑制率明显高于其他各组（P＜0.05）;单纯顺铂组及联合用药组WWOX mRNA表达量较空白对照组明显增加（P＜0.05）,单纯PD98059组WWOX表达量无明显改变（P＞0.05）;ERK mRNA在各组间的表达无明显变化（P＞0.05）;与空白对照组相比,p-ERK1/2表达量在单纯PD98059组及联合用药组中明显降低(P＜0.05),在单纯顺铂组的表达无明显变化。光镜下可观察到空白对照组及单纯PD98059组细胞生长状态好,细胞密集,无明显形态学改变;单纯顺铂组及联合用药组贴壁细胞少,细胞稀疏,联合用药组部分细胞出现胞浆溶解样改变。结论   PD98059联合顺铂可能通过调控WWOX基因表达及ERK通路,对卵巢癌细胞增殖产生较强的抑制作用。     

PD98059对肝癌HepG2细胞Tec信号转导作用的初步研究

目的探讨MEK1抑制剂PD98059对肝癌细胞株HepG2细胞中Tec(tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma)及ERK2作用.方法免疫细胞化学方法检测Tec、ERK2在HepG2细胞中的表达;用RT-PCR和Westernblot方法检测,不同浓度PD98059处理细胞后,HepG2细胞中的Tec、ERK2 mRNA及蛋白表达.结果Tec、ERK2在HepG2细胞中呈高表达,PD98059明显影响HepG2细胞Tec、ERK2 mRNA以及蛋白表达,呈剂量依赖性,40 μmol/LPD98059细胞抑制最明显.结论Tec可能是肝癌细胞内Ras/Raf/ERK信号转导途径上游的信号蛋白,与Ras/Raf/ERK信号转导通路存在着某种信号联系.     

LTB4在THP-1源性巨噬细胞中通过MAPK途径上调EMMPRIN的表达

目的 探讨白三烯B4在MAPK信号通路中对细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)表达的影响.方法 将人类单核细胞系THP-1分为6组,用PMA诱导2～6组的THP-1成巨噬细胞,3～6组加入白三烯B4,第4组加入PD98059(ERK1/2抑制剂),第5组加入SB203580(P38抑制剂),第6组加入SP600125(JNK抑制剂),观察EMMPRIN和MMP-9的mR-NA以及EMMPRIN的蛋白变化.结果 LTB4使单核细胞EMMPRIN的mRNA表达增加(P＜0.05)、MMP-9的mRNA表达增加(P＜0.01),及EMMPRIN的蛋白表达明显增加(P＜0.01),加入PD98059后,EMMPRIN的mRNA表达明显下降(P＜0.01),MMP-9的mRNA表达明显下降(P＜0.01),EMMPRIN蛋白表达明显下降(P＜0.01),加入SB203580后,EMMPRIN的mRNA明显下降(P＜0.01),MMP-9的mRNA明显下降(P＜0.01),EMMPRIN蛋白表达明显下降(P＜0.01),加入SP600125后,EMMPRIN的mRNA明显下降(P＜0.05),MMP-9的mRNA明显下降(P＜0.01),EMMPRIN蛋白表达明显下降(P＜0.01).结论 白三烯B4通过激活MAPK信号通路增加THP-1源性巨噬细胞EMMPRIN的表达,可能是其增加巨噬细胞MMPs产生的机制.     

细胞外信号调解激酶对蟾蜍灵诱导白血病细胞凋亡影响的研究

目的:探讨细胞外信号调解激酶(ERK)对蟾蜍灵诱导白血病细胞凋亡的影响.方法:形态学观察和流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:0.5μmol/L蟾蜍灵作用K562细胞24h诱导典型的细胞凋亡,预先用ERK抑制剂PD98059处理细胞1 h,明显增加蟾蜍灵诱导的细胞凋亡率(P＜0.05);而用佛波酯预先处理后,明显拮抗蟾蜍灵的作用(P＜0.05).结论:ERK负向调节蟾蜍灵诱导的K562细胞凋亡过程.     

DDR2在Peroxynitrite诱导人中枢血管平滑肌细胞凋亡中的表达

目的  探究过氧亚硝酸盐(peroxynitrite, ONOO-) 诱导人中枢血管平滑肌细胞（HCVSMCs）凋亡过程中盘状结构域受体 (DDR2)基因表达的变化。方法  以不同浓度的ONOO-作用于体外培养的HCVSMCs,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,流式细胞仪测定细胞凋亡率,吖啶橙染色进行形态学观察。同时, 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot 检测DDR2 mRNA及蛋白表达。结果  与对照组相比,以ONOO-作用于HCVSMCs 24h可显著抑制该系细胞增生,诱导细胞凋亡(P<0.05),并引起DDR2 mRNA及蛋白水平总体呈现下调趋势(P<0.05)。结论  DDR2基因可能在ONOO-诱导HCVSMCs凋亡的信号转导调节通路中起关键作用。     

ERK1/2信号通路在OX-LDL诱导的血管平滑肌细胞TLR4 mRNA表达中的作用

目的探讨ERK1/2信号通路在氧化性低密度脂蛋白（OX-LDL）诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）Toll样受体-4（TLR4）mRNA表达中的作用。方法采用贴块法培养大鼠VSMCs,在氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）及PD98059（ERK1/2特异性抑制剂）作用下采用RT-PCR检测VSMCs TLR4 mRNA的表达,用Westernblotting检测ERK1/2磷酸化水平的变化。结果OX-LDL使VSMCs ERK1/2磷酸化水平升高;PD98059抑制ERK1/2的磷酸化;OX-LDL刺激VSMCs上调TLR4 mRNA的表达（P〈0.05）;PD98059预孵育后TLR4 mRNA的表达较单独OX-LDL刺激情况下降低（P〈0.05）。结论OX-LDL通过或部分通过ERK1/2信号通路介导VSMCs TLR4 mRNA的表达。     

PD98059抑制哮喘中TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞上皮间质转化进程

目的 探究PD98059对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B上皮间质转化(EMT)进程的影响及可能的分子机制。方法 本研究采用人支气管上皮细胞(BEAS-2B),使用TGF-β1诱导BEAS-2B上皮间质转化模型,使用ERK1/2抑制剂PD98059探究抑制ERK/MAPK信号转导是否影响EMT进程。通过免疫荧光检测BEAS-2B气道重塑模型α-SMA蛋白的表达及定位;CCK-8法检测各组细胞存活率;Edu实验检测各组细胞增殖能力水平;transwell实验检测各组细胞迁移能力水平;Western blot检测各组EMT标志蛋白表达及ERK/MAPK通路的激活情况。结果 与正常组相比,模型组α-SMA表达增加,α-SMA在BEAS-2B细胞胞质上表达。PD98059在40μmol/L浓度与5 ng/mL TGF-β1共处理抑制BEAS-2B细胞生长(P<0.05)。与三组Edu阳性率无显著差异(P>0.05)。与正常组相比,模型组迁移细胞数增加(P<0.05),上皮间质化标志蛋白表达增加(P<0.05),p-ERK蛋白表达增加(P...     

二烯丙基二硫通过细胞外信号调节激酶途径调节HepG2细胞Survivin表达

目的探讨二烯丙基二硫（DADS）对HepG2细胞增殖的影响及其机制。方法W estern b lot法检测survivin、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）和p-ERK1/2的表达;AO/EB染色观察细胞形态学变化。结果ERK1/2抑制剂PD98059抑制DADS诱导survivin表达的作用。PD98059与DADS联合应用可以促进HepG2细胞凋亡。结论DADS诱导HepG2细胞survivin的表达与ERK1/2信号通路有关。     

水飞蓟宾对宫颈癌HeLa细胞增殖和侵袭能力的影响及机制研究

目的 研究水飞蓟宾(silibinin, SB)对宫颈癌HeLa细胞增殖和侵袭能力的影响,并探究其作用机制。方法 CCK-8检测不同浓度SB对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响,筛选SB作用浓度。将细胞分为9组：对照组、SB-L(水飞蓟宾低剂量)组、SB-M(水飞蓟宾中剂量)组、SB-H(水飞蓟宾高剂量)组、PD98059(ERK1/2信号抑制剂)组、SB202190(p38 MAPK抑制剂)组、PD98059+SB组、SB202190+SB组和顺铂组;CCK-8检测细胞增殖能力,Transwell观察各组细胞侵袭情况,实时PCR检测基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK 1/2)和p38 mRNA表达水平,Western blot检测MMP-2、MMP-9、ERK1/2、p38、p-ERK1/2和p-p38蛋白表达水平。结果 与对照组比较,其余各组细胞的增殖率和侵袭细胞数均显著降低(均P<0.05),MMP-...     

新藤黄酸与细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059联合应用对肺腺癌A549细胞生长的影响

目的研究新藤黄酸(Gambogenic acid,GNA)与细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulatedkinase,ERK)特异性抑制剂PD98059联合应用对肺腺癌A549细胞生长的影响。方法新藤黄酸与ERK特异性抑制剂PD98059处理肺腺癌A549细胞,倒置显微镜观察细胞形态变化;甲基噻唑基四唑(methyl th-iazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞存活率;流式细胞仪检测细胞内活性氧的变化;蛋白印迹法(Westernblot)检测ERK、p-ERK蛋白的表达。结果 MTT法结果表明GNA在2.5μmol/L对肺腺癌A549细胞的增殖有抑制作用;与PD98059合用24h,GNA的抑制作用更加明显。倒置显微镜观察显示GNA作用肺腺癌A549细胞24h后,细胞固缩变圆,体积变小,部分细胞呈半贴壁状态;GNA和抑制剂PD98059合用后,多数细胞固缩变圆,脱落,并悬浮于培养液中;少数细胞体积增大、肿胀、破裂呈坏死状。流式细胞仪检测结果表明,20μmol/L PD98059+2.5μmol/L GNA共同作用于A549细胞24h后,与GNA 2.5μmol/L组比较细胞内活性氧生成增加。Western blot法检测表明,PD98059和GNA联合作用A549细胞24h后,p-ERK蛋白表达与GNA组比较显著降低。结论 GNA能诱导肺腺癌A549细胞凋亡,联合应用ERK抑制剂PD98059后可减少ERK蛋白的活化,增加肺腺癌A549细胞的凋亡;结果初步表明GNA诱导肺腺癌A549细胞的凋亡可能与调节ERK信号通路有关。     

肝纤维化中丹参素对TGFβ1/Smads/ERK信号通路的影响及其相互关系

目的探讨肝纤维化过程中转化生长因子β1(transforming growth factorβ,TGFβ1)/Smads/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路的相互作用。方法体外分离培养大鼠肝星状细胞(hepatic stellatecell,HSC),MTT法筛选丹参素最适浓度;以最适浓度丹参素及ERK阻断剂(PD98059)作用于经TGFβ1处理的HSC,CCK-8法检测各组HSC增殖;免疫细胞化学染色法检测各组HSC内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle sctin,α-SMA)及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达;RT-PCR检测各组HSC的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达量;Western blot法检测各组Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化及Smad7蛋白水平。结果 0.062 5～0.25 mmol/L的丹参素可有效抑制HSC增殖,作为最适处理浓度;PD98059(100μmol/L)可抑制TGFβ1诱导的HSC增殖,丹参素剂量依赖性抑制TGFβ1诱导的HSC增殖(P<0.01);TGFβ1促进细胞内α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达,PD98059及丹参素降低TGFβ1诱导的α-SMA及Ⅰ、Ⅲ型胶原水平;PD98059可拮抗TGFβ1诱导的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA的表达(P<0.05,P<0.01),丹参素下调Smad2、Smad3 mRNA水平,但上调Smad7 mRNA水平(P<0.01);PD98059及丹参素抑制TGFβ1诱导的Smad2/3、ERK1/2蛋白磷酸化(P<0.01),但对TGFβ1诱导的Smad7蛋白表达上调有不同效应(P<0.01)。结论 TGFβ1上调Smad2、Smad3 mRNA表达及蛋白磷酸化,进而诱导HSC增殖、活化及胶原合成,ERK通路可能参与HSC中TGFβ1诱导Smad基因表达及蛋白磷酸化过程。丹参素对TGFβ1/Smad/ERK信号通路具有抑制效应。     

PD98059通过诱导PUMA表达增强肠癌LoVo细胞对奥沙利铂的敏感性

目的 体外实验探讨MEK1特异性抑制剂PD98059对奥沙利铂药物治疗作用的影响及PUMA在这一过程中的作用.方法 MTT法检测转染MEK1 active质粒后及不同药物处理后对LoVo细胞增殖率的影响;Western blot检测奥沙利铂和/或PD98059处理后PUMA蛋白的表达和ERK的活性;利用表达反义PUMA基因的细胞克隆抑制PUMA的表达后检测对PD98059和奥沙利铂诱导凋亡作用的影响.结果 在肠癌LoVo细胞中,ERK的激活增加细胞的增殖率;奥沙利铂可以抑制ERK的活性,并呈剂量依赖关系;PD98059可以协同奥沙利铂抑制细胞增殖率的作用;奥沙利铂和PD98059可以协同诱导PUMA的表达;抑制PUMA的表达可以减弱奥沙利铂和PD98059诱导的LoVo细胞的凋亡.结论 PD98059通过诱导PUMA表达增强肠癌LoVo细胞对奥沙利铂的敏感性.     

Involvement of MMP-2 in adriamycin resistance dependent on ERK1/2 signal pathway in human osteosarcoma MG-63 cells

Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) level and the ERK1/2 signal pathway are dependent factors for the growth and metastasis of cancer.However,the impact of MMP-2 in combination with ERK1/2 in tumor patients with drug resistance is unknown.To determine the relationship between MMP-2 and the ERK1/2 signal pathway,we established an adriamycin (ADM)-induced MG-63 (ADM-MG-63) cell line.With the increase of the ERK1/2 pathway blocker PD98059,we detected the expression levels of MMP-2 and p-ERK1/2 by Western blot in ADM-MG-63 cells.In ADM-MG-63 cells transfected with MMP-2-siRNA,the expression of ERK1/2 was detected for understanding the function of the ERK1/2 signal pathway.Three siRNAs for MMP-2 (MMP-2-siRNA) were designed,and the optimal one was selected and tested at different time points of 24,48 and 72 h.Under an ADM-induced condition,ADM-MG-63 cells were finally stable living in the medium of ADM (200 ng/mL).PD98059 could effectively suppress the expression levels of p-ERK1/2 and MMP-2.When the MMP-2 was silenced by using MMP-2-siRNA,the expression of p-ERK1/2 was enhanced.It is con-cluded that MMP-2 may be involved in ADM resistance dependent on ERK1/2 signal pathway,sug-gesting interference in ERK1/2 may be a new method of targeted therapy for tumor resistance.     

ROLE OF ERK1／2 KINASE IN CISPLATIN-INDUCED APOPTOSIS IN HUMAN OVARIAN CARCINOMA CELLS

Objective To investigate the role of extracellular regulated kinase (ERK1/2) pathway in cisplatin-induced apoptosis in human ovarian carcinoma cells.Methods Cisplatin-induced apoptosis were stained with DAPI and was assessed microscopically in human epithelial adenocarcinoma ovarian cell line SKOV3 cells. ERK activation was determined by Western blotting using an anti-phosphoERK antibody to detect ERK activity. The effect of PD98059 on ERK activity induced by cisplatin was detected by MTT assay.Results Marked apoptosis of SKOV3 cells resulted from 48 hours treatment with 20 μg/mL cisplatin. Strong activation of ERK was led to by 15 μg/mL cisplatin. Dose response and time course of cisplatin induced apoptosis in SKOV3 cells.Cisplatin-induced ERK activation occurred at 12 hours and increased to highest induction at 24 hours by Western blotting.The effect of PD 98059 on ERK activity induced by cisplatin at the concentration of 100 μmol/L PD 98059. Statistically significant decreased in cell survival were observed with 100 μmol/L PD 98059 at 15 and 20 μg/mL cisplatin (P＜ 0.05).Conclusions Cisplatin activates the ERK signaling pathway in ovarian cancer cell line SKOV3. Inhibition of ERK activity enhances sensitivity to cisplatin cytotoxity in ovarian cancer cell line SKOV3. Evaluation of ERK activity could be useful in predicting which ovarian cancer will response most favorably to cisplatin therapy.     

FGF8b调控前列腺癌细胞上皮间质转化的分子机制

目的:探讨成纤维细胞生长因子8b(fibroblast growth factor 8b,FGF8b)促进前列腺癌DU145细胞上皮间质转化的分子机制。方法:先选取3组细胞,分别为空白对照组(DU145细胞)、阴性对照组[(DU145细胞转染空白质粒(简称pcDNA3.1/DU145)]和实验组[DU145细胞转染FGF8b(简称FGF8b/DU145)]。采用Western印迹检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)通路活性,然后将FGF8b/DU145细胞及DU145细胞在PD98059(ERK激酶抑制剂)作用下分为4组:A组为2%胎牛血清(FBS)处理的FGF8b/DU145细胞;B组为2%FBS+PD98059(50μmol/L)处理的FGF8b/DU145细胞;C组为2%FBS处理的DU145细胞;D组为2%FBS+PD98059(50μmol/L)处理的DU145细胞,培养观察细胞形态学的变化,最后Western印迹和Transwell小室检测各组细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志物的变化以及细胞的迁移能力改变。结果:实验组ERK1/2活性明显高于空白对照组和阴性对照组。给予PD98059后,B组与未给予PD98059组的A组相比,上皮细胞标志物上皮钙黏素蛋白表达量明显上调(P<0.05);间质标志物波形蛋白表达量明显下调(P<0.05)。细胞迁移试验结果提示:在给予PD98059后,B组FGF8b/DU145细胞的迁移能力与A组相比明显减弱。结论:FGF8b调控前列腺癌细胞DU145发生上皮-间质转化,可能由ERK激酶通路介导,MAPK激酶1作为该信号通路的关键因子之一,可能是干预前列腺侵袭转移的有效靶点。     

ERK通路在单核巨噬细胞集落刺激因子调控成纤维细胞血管内皮生长因子表达中的作用

目的 研究单核巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）对成纤维细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,初步探讨细胞外信号调节激酶（ERK）通路对此过程的调控作用。方法 在对数生长期人皮肤成纤维细胞培养液中添加GMCSF和（或）ERK通路特异性抑制剂（PD98059）进行干预,实验分为空白对照组、PD98059组、GMCSF组及PD98059+GMCSF组。收集各组细胞及培养上清液,采用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测各组人皮肤成纤维细胞内VEGF mRNA和蛋白表达;ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF蛋白分泌水平。结果 与空白对照组和PD98059组比较,GMCSF组人皮肤成纤维细胞内VEGF mRNA和蛋白相对表达量以及细胞培养上清液中VEGF蛋白质量体积浓度明显升高（P<0.05）;而在GMCSF+PD98059组中,人皮肤成纤维细胞内和细胞培养上清液中相应指标表达水平均显著低于GMCSF组（P<0.05）。结论 GMCSF可促进人皮肤成纤维细胞VEGF表达,ERK通路在此过程中发挥重要作用。