蒺藜皂苷诱导SD新生大鼠海马神经干细胞分化的实验研究

目的 探讨蒺藜皂苷对于诱导SD新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells, NSCs)分化的影响作用以及蒺藜皂苷培养液浓度变化对其的影响.方法 采用无血清和单克隆培养方法,将蒺藜皂苷加入离体的海马NSCs的培养液中,应用Nestin、BrdU、NF200、GFAP免疫荧光染色观察NSCs的形态及分化而来的神经元、神经胶质细胞形态,并检测由海马NSCs分化而来的细胞的数量.结果 海马NSCs在无血清培养下,可形成Nestin阳性细胞球.在诱导分化后,免疫荧光染色可见NF阳性细胞、GFAP阳性细胞,而其中20 mg/kg 蒺藜皂苷干预组海马NSCs向神经元的分化比例最高.结论 在蒺藜皂苷的作用下,海马NSCs向神经元分化的数量增多.     

胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法新生1日龄大鼠禁食24 h后腹腔注射胰岛素50 u.kg-1,血糖值<1.0 mmol.L-1后取脑海马组织在含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和B27的无血清培养基中进行原代和传代培养,并分别对原代和传3代的细胞进行单克隆培养及诱导分化:单克隆培养细胞行巢蛋白(Nestin)免疫细胞荧光染色;诱导分化后的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞荧光染色,计数NSE阳性细胞比例。结果原代组培养细胞与传代组和对照组原代细胞相比生长较快;单克隆培养的细胞均Nestin阳性表达,诱导分化后的细胞分别呈NSE或GFAP阳性表达;原代组的细胞诱导分化为神经元的比例明显高于传代组和对照组(P<0.05);传代组的细胞诱导分化为神经元的比例与对照组传代细胞比较无统计学意义(P>0.05)。结论低血糖能够短暂地促进新生大鼠海马神经干细胞增殖及提高向神经元分化比例。     

丙泊酚对大鼠胚胎神经干细胞增殖及分化的影响

目的探讨丙泊酚对体外培养大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)增殖及分化的影响。方法采用孕14～16 d Wistar大鼠,进行NSCs原代培养并用Nestin鉴定,按以下给药分成六组:空白对照组(control)、脂肪乳对照组(introlipid)、丙泊酚不同浓度组[5、25、50、100μmol/l],用5-溴脱氧尿(Brdu)掺入法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞增殖的影响。胚胎神经干细胞诱导分化过程中加入50μmol/l丙泊酚,采用NeuN、GFAP免疫组化法观察丙泊酚对胚胎神经干细胞分化的影响。结果分离培养的神经干细胞95%以上呈Nestin阳性,不同浓度丙泊酚组Brdu阳性细胞百分数没有差异,丙泊酚NeuN阳性细胞百分数(23.1±0.9%)明显高于对照组(13.4±0.8%)(P<0.05),而GFAP细胞阳性细胞数与对照组相比没有明显差异。结论临床相关剂量丙泊酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖没有影响,但能诱导神经干细胞向神经元细胞分化。     

APP5肽模拟物P165对体外培养大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的 研究一种小分子多肽─APP5肽的模拟物P165对体外培养的大鼠胚胎海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的影响,以期能找到一种可代替神经营养因子的小分子物质,能够促进NSCs的增殖或分化,为将来的临床应用提供理论依据.方法 (1)原代培养SD大鼠胚胎脑海马NSCs; (2)利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞的特异性标记物微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、2,3-环核苷酸-3磷酸二酯酶(CNPase)对培养的NSCs进行鉴定;(3)将培养的NSCs分为对照组、血清组、APP5肽反序列组和P165组, 观察各组细胞形态的变化;(4)将培养的NSCs分为对照组、APP5肽反序列组和P165组,利用细胞计数,测定干细胞克隆形成率、干细胞克隆形成大小的方法分析P165对海马NSCs增殖的影响.结果 (1)海马神经干细胞呈神经球聚集生长,BrdU染色阳性;加入血清后神经球周围有细胞呈放射状向四周生长,并带有突起.染色呈MAP2、GFAP或CNPase阳性; (2)海马NSCs加入P165及其反序列后细胞形态上与对照组相比没有明显改变;(3)与对照组相比,加P165后海马NSCs数量明显增加,克隆形成率和克隆形成的直径均有明显的增加, 并有统计学差异.结论 P165能够促进海马NSCs的增殖,但并不促进其分化.     

不同临床有效浓度异丙酚对新生大鼠海马区来源神经干细胞增殖分化和凋亡的影响

目的:探讨不同临床有效浓度异丙酚对新生大鼠海马区来源神经干细胞增殖分化及凋亡的影响。方法:采用已建立的新生SD大鼠海马区来源神经干细胞单细胞克隆系细胞株,将其均匀地接种到24或48孔培养板中(含血清培养基培养孔用于分化和凋亡检测,无血清培养基培养孔用于增殖周期和凋亡检测)。将细胞随机分为五组(每组5个培养孔):⑴低异丙酚浓度组(P1组):终浓度2.5μg/mL;⑵中异丙酚浓度组(P2组):终浓度5.0μg/mL;⑶高异丙酚浓度组(P3组):终浓度10.0μg/mL;⑷C组:正常(control)对照组;⑸L组:脂肪乳(introlipid)对照组。培养8 h后,5-溴脱氧尿(Brdu)检测细胞增殖周期,培养48 h后,流式细胞仪检测各组神经干细胞增殖分化过程中的增殖和凋亡情况;72 h免疫荧光技术检测神经元特异性微管蛋白抗体(β-tubulin)和星形胶质细胞特异性胶质酸性蛋白(GFAP),观察神经干细胞分化的各类神经细胞形态学变化、分化比率及分化细胞的凋亡情况。结果:与C组比较,L组细胞增殖周期和分化比率无明显差异(P>0.05),分化细胞无明显凋亡且细胞形态正常;P2和P3组细胞增殖周期显著抑制,增殖和分化过程中凋亡比率明显升高(其中P2组P<0.05;P3组P<0.01),分化细胞的突触或轴突发育差且发生大量凋亡,未凋亡的星形胶质细胞增生肥大;P1组神经元分化比率高(P<0.05)。结论:中高浓度异丙酚均明显抑制新生大鼠海马区来源神经干细胞的增殖和分化,并诱发神经细胞的大量凋亡,影响到分化细胞的神经突起分支、树突棘的生长发育;低浓度异丙酚能诱导神经干细胞向神经元细胞分化。     

切割海马伞海马对神经干细胞的存活、迁移和分化的影响

目的 :观察成鼠神经干细胞 (NSCs)移植入切割海马伞侧和正常侧海马后存活、迁移和分化的情况 ,以及切割海马伞提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用。方法 :用无血清培养和单细胞克隆技术获得成年SD大鼠前脑室下区NSCs ,BrdU标记扩增。切割SD大鼠右侧海马伞 ,术后 2周将标有BrdU的NSCs植入双侧海马齿状回。术后不同时期行Nissl染色、BrdU免疫荧光、β -tubulin -Ⅲ /BrdU免疫组化双重染色和AChE组化染色。同时在体外将NSCs种植于 2 4孔培养板中 ,分成三组 :切割组和正常组分别加入切割海马伞侧和正常侧海马提取液。结果 :各时期移植区中均有大量BrdU阳性细胞 ;BrdU阳性细胞沿海马齿状回颗粒下层迁移 ,并在颗粒下层内形成迁移条带 ;各时期切割侧齿状回中BrdU阳性细胞密度大于正常侧 ;切割侧齿状回中较正常侧有较多Nissl深染大胞体神经元样细胞 ,而正常侧多为小胞体胶质样细胞 ;切割侧海马齿状回见数个 β -tubulin -Ⅲ /BrdU双标神经元和AChE阳性神经元。与正常组相比 ,切割组MAP -2和AChE阳性神经元数量多、分化好。结论 :移植到海马中的NSCs能存活、迁移并分化为神经元 ,切割海马伞侧海马中某些物质表达增强可促进NSCs向神经元或AChE阳性神经元分化     

维甲酸和联合应用神经营养因子对新生大鼠神经干细胞分化的影响

目的研究全反式维甲酸（ATRA）及联合应用神经营养因子（BDNF，GDNF）对体外培养的神经干细胞（NSCs）分化的影响。方法取新生SD大鼠的前脑室下带（SVZ）区，按NSCs的常规培养方法分离、培养。用免疫细胞化学法鉴定巢蛋白（nestin）、微管相关蛋白-2（MAP-2）、胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，以此来观察ATRA、BDNF、GDNF单独或联合应用对次代神经球细胞分化的作用。结果原代及次代神经球均显示nestin阳性，并可分化为MAP-2阳性神经元样细胞及GFAP阳性胶质细胞样细胞。1μmol／LATRA可促进NSCs分化为MAP-2阳性细胞的比例达（29．14&#177;5．00）％，显著高于对照组的（7．19&#177;1．21）％，差异有高度统计学意义（P〈0．001）。ATRA联合应用10ng／ml的BDNF或GDNF，与单独使用ATRA比较，并不显著提高NSCs分化为MAP-2阳性细胞的比例。结论ATRA可促进神经干细胞向神经元方向分化，ATRA联合应用BDNF或GDNF无明显的协同作用。     

腺病毒介导转录因子X盒结合蛋白1转染对神经干细胞增殖及在缺氧环境下凋亡的影响

目的:以重组腺病毒为载体,将X盒结合蛋白1基因转染胚鼠海马神经干细胞,观察其是否可以促进干细胞增殖以及在缺氧环境下的抗凋亡能力。方法:取孕16dSD大鼠胚鼠的海马组织进行神经干细胞的分离、克隆、nestin免疫荧光检测,以及传代和扩增;将重组腺病毒Ad-XBP1-EGFP质粒转染胚鼠海马神经干细胞,得到基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞,选取普通神经干细胞标记为对照组,转染后的神经干细胞标记为转染组。通过细胞计数和MTT比色法检测对照组和转染组的增殖情况,连续检测7d,绘制生长曲线;取两组神经干细胞用CoCl2诱导缺氧,流式细胞术检测对照组和转染组的凋亡情况。结果:转染组的胚鼠海马神经干细胞增殖能力明显增强(P<0.05);在缺氧条件下,转染组神经干细胞凋亡程度较缺氧对照组减轻(P<0.05)。结论:利用重组腺病毒作为载体成功可以将X盒结合蛋白1基因导入胚鼠海马神经干细胞中;转染后的神经干细胞增殖能力和在缺血、缺氧条件下抗凋亡能力较普通神经干细胞明显增加。     

皮质酮大鼠神经干细胞增殖分化的变化

目的观察皮质酮(corticosterone,CORT)大鼠神经干细胞增殖分化的变化,探讨肾阳虚证与CORT大鼠神经干细胞增殖分化的联系.方法成年雄性SD大鼠连续14 d皮下注射CORT(10mg·kg-1·d-1),采用免疫单标和双标方法检测成体大鼠神经干细胞及分化的功能细胞.给予CORT大鼠右归饮水煎剂灌胃,观察CORT大鼠神经干细胞增殖分化的变化.结果与正常对照组相比,CORT大鼠大脑皮层、海马及下丘脑区BrdU阳性细胞数明显减少,BrdU NF200,BrdU NeuroD,BrdU GFAP免疫荧光双标细胞数也显著减少(P＜0.01).给予右归饮后CORT大鼠BrdU阳性细胞以及免疫荧光双标细胞数明显增加(P＜0.01).结论CORT大鼠神经干细胞增殖分化能力显著下降,右归饮可显著增加CORT大鼠神经干细胞增殖分化能力.     

EDS对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的作用

目的观察在不同剂量蜕皮甾酮（ecdysterone,EDS）作用下,体外培养的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖、分化情况。方法原代培养新生SD大鼠海马NSCs,经EDS处理后,传代细胞克隆形成率、四甲基偶氮唑盐比色法观察神经干细胞增殖能力的变化,免疫荧光细胞染色技术、流式细胞术检测神经干细胞分化情况。结果与对照组相比,中低剂量组（50、100、200mg／L）,对大鼠海马NSCs增殖能力无显著影响,而高剂量的EDS（400mg／L及800mg／L）干预组则明显抑制了NSCs的增殖。在分化条件下,EDS200mg／L干预组显著提高NSCs向神经元分化的比例,其余各组无统计学差异。结论EDS能够调节体外培养的大鼠海马NSCs的增殖和分化水平,在合适的剂量下明显提高了神经元的分化比例。     

NGF诱导大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的作用

目的:探讨大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞在NGF的诱导下分化为神经元和AChE阳性神经元的情况。方法:应用无血清培养技术,分别从SD大鼠胚脑皮层和隔区分离克隆神经干细胞,然后在含或不含NGF的培养液中分化14d。用MAP-2免疫荧光和AChE组化技术检测神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的情况。并对MAP-2阳性神经元的分化率、AChE阳性神经元数及其它们的细胞面积和周长进行图像处理;用STATA7.0统计软件进行方差分析和两两比较。结果:隔区和皮层NGF组MAP-2阳性神经元分化率高于隔区和皮层对照组;其细胞面积除隔区NGF组与皮层NGF组之外,其它各组间差异均有统计学意义;而其周长各组之间差异均有统计学意义。AChE阳性神经元的数量及细胞面积和周长,隔区NGF组最佳,皮层NGF组次之,隔区对照组再次之,皮层对照组较差。三项指标各组间差异有统计学意义。结论:NGF可诱导大鼠胚脑皮层和隔区神经干细胞向神经元分化;隔区神经干细胞较皮层神经干细胞更易于向AChE阳性神经元分化;这种区域特异性可在NGF诱导下发生改变。     

不同生长因子对神经干细胞定向分化的影响

目的 研究神经干细胞（NSCs）分化为神经元和胶质细胞的影响因素,探讨各种生长因子对小鼠NSCs定向分化的影响。方法 以无血清培养法从E13-14d的昆明小鼠大脑皮质分离培养获得NSCs后,分别加入50 mg/L EGF、bFGF、IGF-1、NGF和PDGF处理,分析不同生长因子对NSCs定向分化的影响。结果 分离得到的细胞表现出NSCs的特性,能无限增殖,神经元微管相关蛋白和胶原纤维酸性蛋白均呈阳性表达。与空白对照组相比,各生长因子均可显著诱导NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,其中NGF的诱导NSCs分化为神经元的作用最强;IGF-1、NGF、PDGF均能明显诱导NSCs分化为星形胶质细胞。结论 几种生长因子均能促进NSCs分化,其中NGF诱导NSCs向神经元方向作用最强;而IGF-1、NGF和PDGF促进NSCs向星形胶质细胞分化的作用均较强。     

Wnt3a影响大鼠海马神经干细胞增殖的体外研究

目的:探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)体外增殖的影响。方法:采用机械分离、无血清传代培养法,从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对NSCs及其分化情况进行鉴定。将NSCs与5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)共孵育,观察Wnt3a对NSCs体外增殖情况的影响。结果:海马源胚胎NSCs具有增殖能力,可以传代培养,可分化为神经元和星形胶质细胞。与Brdu共孵育后,添加Wnt3a的实验组Brdu阳性率高于对照组(P0.01)。结论:使用机械分离、无血清培养的方法获得的NSCs具有增殖和多向分化能力,Wnt3a可以促进大鼠海马NSCs的体外增殖。     

Differentiation of rat neural stem cells and its relationship with environment

Objective To explore the differentiation fates of rat neural stem cells (NSCs) in different environmental conditions. Methods NSCs derived from 16-day-old rat embryo were proliferated in vitro and implanted into the brain of rats with intra-cerebral hemorrhage. At the same time some NSCs were co-cultured in vitro with Schwann cells derived from newborn rats. MAP-2, GFAP and GalC (which are the specific markers of neural cells, astrocytes and oligodendrocytes respectively),BrdU and β-tubulin were detected by immunohistochemical and immunofluorescent methods.Results BrdU positive cells that were implanted into the brain distributed around the hemorrhagic area.The majority of them were GFAP positive astrocytes while a few of them were β-tubulin positive neural cells or GalC positive oligodendrocytes. After being co-cultured with Schwann cells in vitro,NSCs are predominately shown β-tubulin and MAP-2 positive,and only a minority of them were GFAP or GalC positive.Condusions The hemorrhagic environment in vivo induces NSCs to differentiate mainly into astrocytes while co-culture with Schwann cells in vitro induce the majority of NSCs to differentiate into neural cells.     

条件培养基对神经干细胞增殖与分化作用的影响

目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）条件培养基对体外培养神经干细胞（NSCs）增殖与分化作用的影响。方法用 BMSCs 条件培养基分别在增殖与分化条件下培养 NSCs,观察 NSCs 形态变化。用 MTT 法及 NSCs 球数目和直径的统计分析了解 NSCs 增殖情况,同时行免疫荧光及 Western blot 法鉴定其分化情况。结果原代培养获得大量未分化且悬浮生长的 NSCs 球,并能分化为神经元细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞。BMSCs 条件培养基组能够促进 NSCs 球的吸附贴壁,但与对照组相比光密度（OD）值差异无统计学意义,NSCs 球数目和直径差异亦无统计学意义。另外,BMSCs 条件培养基组少突胶质细胞特异性蛋白MBP 表达量高于对照组（P <0.05）,星形胶质细胞特异性蛋白 GFAP 表达量低于对照组（P <0.05）,而神经元特异性蛋白 MAP-2表达量未见明显异常。结论大鼠 BMSCs 条件培养基促进 NSCs 向少突胶质细胞方向分化,但不抑制其增殖作用。     

新生大鼠大脑皮质神经干细胞的分离培养与胆碱能神经元的鉴定

目的:体外分离和培养新生大鼠大脑皮质神经干细胞并进行鉴定,为用于脑梗死动物模型梗死区移植细胞作准备.方法:分离新生大鼠皮质神经干细胞,进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的特性进行鉴定,并对细胞的胆碱能特征进行鉴定.结果:获得了Nestin阳性的神经干细胞,其分化后可获得MAP-2、GFAP和 CNPase阳性的神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞;通过胆碱能鉴定发现大脑皮质干细胞可分化为胆碱能神经元. 结论:体外分离和培养的大脑皮质神经干细胞具有增殖分化的能力,并可以分化为胆碱能神经元,有望应用于皮质损伤后认知障碍及运动障碍的细胞移植治疗.     

缺氧对体外培养的鼠胚神经干细胞分化的影响

目的分离大鼠胚胎皮质神经干细胞（NSCs）进行体外培养,探讨缺氧对体外培养的鼠胚大脑皮质神经干细胞分化的影响。方法对孕14d（E14d）大鼠取鼠胚脑皮质用无血清培养技术分离培养神经干细胞,血清：培养基贴壁诱导分化。通过免疫细胞化学染色检测细胞分化情况;NSCs采用三气培养箱予以不同缺氧干预,缺氧培养后再用10％胎牛血清培养基进行贴壁分化,用MAP2免疫荧光染色检测缺氧对NSCs向神经元方向分化的影响。结果①大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;②缺氧干预实验中,5％O2组尤以72h组可诱导NSCs向神经元方向分化。结论从大鼠胚胎皮质可成功分离NSCs,缺氧可影响NSCs的分化,适度缺氧可诱导离体培养的大鼠脑皮质NSCs向神经元方向分化。     

外源性重组HMGB1对神经干细胞增殖分化的影响及其机制研究

目的研究外源性重组高迁移率组蛋白B1（HMGB1）对神经干细胞增殖及分化的影响及其作用机制。方法在无血清的神经干细胞培养基中培养SD鼠大脑皮层细胞,传代扩增及纯化神经干细胞,免疫荧光检测神经干细胞标记物巢蛋白（nestin）,分析神经干细胞纯度。CCK-8测定加入不同浓度的重组HMGB1对神经干细胞增殖活性的影响,选择重组HMGB1的最适浓度进行后续实验;细胞免疫荧光检测重组HMGB1对神经干细胞分化的影响,Real-time PCR检测晚期糖基化终末产物受体（RAGE）mRNA、Toll样受体（TLRs）mRNA、基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA、神经生长因子（NGF）mRNA的表达,Western blot检测RAGE、TLRs、MMP-9、NGF蛋白的表达。结果大鼠大脑皮层细胞在培养至第3代时,nestin鉴定神经干细胞纯度可达99%及以上。在重组HMGB1 10 ng/mL刺激下,神经干细胞增殖活性最高。实验组神经Ⅲ类β-微管蛋白（TUJ1）表达高于对照组(P<0.05),实验组RAGE、TLRs、MMP-9、NGF mRNA及蛋白表达均高于对照组(P<0.05)。结论外源性重组HMGB1或可通过RAGE、TLRs、MMP-9等信号通路促进神经干细胞增殖及其向神经元方向分化。     

神经生长因子诱导神经干细胞分化的作用机制探讨

目的探讨神经生长因子(NGF)对体外培养的小鼠神经干细胞(NSCs)分化为神经元的作用及可能机制。方法以无血清培养法从孕13～14 d的昆明小鼠大脑皮质分离培养获得NSCs,传至3代后,进行NGF处理,并对培养的细胞进行MAP-2免疫细胞化学染色,荧光显微镜下对MAP-2阳性细胞进行计数。同时运用蛋白免疫印迹法(Western blot)考察NGF对TrkA、Akt、Erk磷酸化水平的影响;在研究NGF作用的信号转导通路时,预先给予各种信号通路抑制剂处理,再进行NGF干预,通过MAP-2染色及Western blot考察NGF促进神经干细胞分化为神经元的信号通路。结果 NGF可以显著促使NSCs分化为神经元并可以促进TrkA、Akt和Erk的磷酸化,呈现剂量和时间依赖性;各种通路抑制剂结果显示PI3K/Akt抑制剂可以阻断NGF对Akt的磷酸化作用,同时阻断了NGF对NSCs的促分化作用,MAPK抑制剂处理可以阻断NGF对Erk的磷酸化作用,但未见明显阻断NGF的促分化作用。结论 NGF可以促进NSCs分化为神经元,其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。     

P38信号通路对大鼠神经干细胞增殖的影响

目的 探讨P38信号转导通路对大鼠海马神经干细胞增殖的影响.方法 体外培养大鼠海马神经干细胞,将培养细胞分为2组,对照组采用神经干细胞培养液进行培养,实验组中在神经干细胞培养液的基础上添加P38通路抑制剂SB203580,Westem blot方法检测细胞中P38及磷酸化P38的表达情况,MTT法检冽其对神经干细胞增殖的影响.结果 神经干细胞加入SB203580后P38磷酸化水平明显低于对照组,实验组可见干细胞球逐渐增大,MTT 法测定结果显示细胞增殖速度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 P38信号转导通路被抑制后,神经干细胞的增殖能力明显增强.