重组腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质干细胞的实验研究

目的 体外研究重组腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠间充质于细胞(MSCs)的方法.方法 用密度梯度离心及贴壁法相结合的方法分离纯化大鼠MSCs并进行鉴定,重组绿色荧光蛋白的腺病毒载体Ad-GFP转染,荧光显微镜检测其转染效率,CCK-8法检测转染细胞的增殖能力.结果 Ad-GFP对大鼠MSCs的感染率高达90.0%,感染1月后仍有稳定表达;转染细胞的增殖能力与未转染细胞相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 重组腺病毒载体Ad-GFP可高效感染MSCs,基因转染后细胞的增殖能力不受影响,可作为一种高效的大鼠MSCs的标记方法.     

增强型绿色荧光蛋白基因转染兔间充质干细胞的实验研究

目的建立增强型绿色荧光蛋白标记间充质干细胞（MSCs）的方法,并观察标记方法对MSCs的分化功能影响。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养兔外周阻MSCs,以携带EGFP的腺病毒（Ad-CMV-EGFP）转染MSCs,荧光倒置显微镜下观察其瞬时表达及转染效率,并对转染后的MSCs进行诱导分化为内皮细胞以观察其部分分化功能。结果①MSCs于体外培养14～20d可达到80％～90％融合,细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞,增殖活跃;②MSCs经携带EGFP腺病毒转染后24h即可表达EGFP,4～5d时表达最强,此后逐渐减弱,2wk时明显减弱,到4wk时无EGFP表达;③测定腺病毒转染MSCs效率约为60％;④经诱导后分化的内皮细胞呈铺路石样排列,CD31呈阳性表达。结论Ad．CMVoEGFP转染后的MSCs可有效表达EGFP,且本法转染效率较高,基本不影响细胞分化功能,是一种较好的MSCs标记方法。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

[摘要] 目的：研究腺病毒载体绿色荧光蛋白基因（Ad-GFP）在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCc)转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰BMSCc的可行性。方法：在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad-GFP(1×103-1×1010 PFU/ml)转染BMSCc,细胞计数法分析转染率,倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β- 巯基乙醇诱导感染Ad-GFP的BMSCc向神经样细胞定向分化。结果：3-6代BMSCc表面标志CD34、CD45阴性而CD29、CD44阳性,当病毒滴度为1×107PFU/ml时感染率为55%,为1×109及1×1010PFU/ml感染率均为85%,但1×1010PFU/ml时出现细胞病理现象,7d荧光表达最强,28d 仍可见荧光表达,感染Ad-GFP的BMSCc经β- 巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性。结论：合适滴度的Ad-GFP可以高效感染BMSCc,对细胞的生物学特性影响较小不影响诱导分化功能,BMSCc可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗的种子细胞。     

慢病毒介导的增强型绿色荧光蛋白报告基因对间充质干细胞的标记

目的 探讨慢病毒介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记间充质干细胞(MSC)是否影响其细胞生物学特性,以及EGFP基因能否持久稳定表达.方法 以不同病毒感染复数(MOI)实行EGFP慢病毒对MSC的感染,通过流式细胞分析法(FACS)检测EGFP的阳性率,并在荧光显微镜下观察EGFP在MSC的表达情况;通过锥虫蓝染色、MTT比色法、Hoechst染色和FACS检测细胞活力、增殖、凋亡和周期;EGFP慢病毒感染MSC体外持续培养2、4、8、16周时通过FACS检测EGFP的阳性率和荧光强度,以评价EGFP基因在MSC表达的稳定性.结果 EGFP慢病毒以MOI=20感染MSC 96 h,EGFP阳性率达97.39%±0.68%;与对照MsC相比,EGFP慢病毒感染MSC时,对细胞活力、增殖、凋亡和周期均没有影响(P＞0.05);EGFP-MSC在体外持续培养2,4、8、16周,EGFP阳性率分别为97.50%±0.54%、97.32%±0.51%、97.39%±0.11%、97.48%±0.13%,荧光强度(A值)分别为440 ±13、445±12、458±13、456±16,均能够保持稳定水平.结论 EGFP慢病毒能够高效标记MSC,并且不影响其生物学特性,EGFP基因在MSC能够持久稳定表达,可以用于下一步的细胞示踪研究.     

逆转录病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染标记间充质干细胞

目的:为使间充质干细胞(MSCs)被绿色荧光蛋白(GFP)稳定标记,探讨通过逆转录病毒载体介导的GFP基因高效转染MSCs的方法,以便为研究在体干细胞分化奠定基础。方法:全骨髓法分离培养纯化大鼠MSCs,利用携带GFP基因的复制缺陷性逆转录病毒(R t-GFP)转染MSCs,荧光显微镜观察GFP阳性的MSCs。结果:R t-GFP转染后,80%~90%MSCs可激发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。结论:R t-GFP可以使MSCs获得长效稳定标记。     

绿色荧光蛋白作为神经干细胞示踪标记的实验研究

目的研究携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的腺病毒感染神经干细胞(neural stem cells,NSCs)后的荧光稳定性和持久性及其对NSCs生物学特性的影响;探讨利用其作为NSCs示踪标记的可行性.方法利用GFP-腺病毒空载体感染NSCs(NSCs-GFP),经G418筛选并连续传代,在相差显微镜下观察未感染NSCs和感染NSCs的形态以及在荧光显微镜下观察感染NSCs及其诱导分化后的GFP表达情况;并检测NSCs-GFP的细胞活性和细胞周期.调整GFP标记神经干细胞浓度为1×105/μl,将其植入大鼠侧脑室内,观察其在脑内的表达.结果未感染NSCs和感染NSCs的形态学、细胞活性和细胞周期等无明显差异(P＞0.05).GFP在诱导分化后的NSCs-GFP子代细胞中有高表达,并且第1代和第20代NSCs-GFP的绿色荧光无明显差别.在植入侧侧脑室周围可见绿色荧光的强表达,且持续时间较长.结论 GFP荧光稳定持久,对转染细胞的生物学特征无明显影响,并且移植后的荧光呈长时间强表达,因此可以将其作为神经干细胞的示踪标记,这将有利于神经干细胞移植后的可塑性研究.     

增强型绿色荧光蛋白-C1转染示踪骨髓间充质干细胞

目的：应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhanced green fluorescent protein,pEGFP-C1）标记骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MMSCs）,以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法：在体外分离培养大鼠MMSCs,流式细胞仪检测细胞表型,以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因,荧光显微镜观察基因表达。结果：pEGFP-C1在基因转染24 h后开始表达,48-72 h达高峰,12-14 d后有较多的表达。结论：由脂质体介导的质粒pEGFP-C1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。     

BrdU,CFSE和GFP标记大鼠间充质干细胞的比较

目的:研究BrdU, CFSE和GFP作为大鼠间充质干细胞标记物的可行性. 方法: 分别用上述三种标记物标记大鼠间充质干细胞,检测即时、15和30 d的标记率,通过检测细胞周期、凋亡率和描绘生长曲线,来明确标记物对体外培养大鼠间充质干细胞生长特性的影响;通过流式细胞仪检测标记物对细胞表面标志(CD29, CD34, CD44, CD45)表达的影响. 结果: BrdU, CFSE, GFP的即时标记率为77.0%, 99.4%, 89.7%,1 mo后分别下降至51.9%, 77.5%, 82.9%. 三者对体外培养的大鼠间充质干细胞的生长特性和表面标志的表达均无明显影响. 结论: GFP, BrdU和CFSE均可以作为大鼠间充质干细胞的标记物.     

荧光染料CFSE标记大鼠间充质干细胞的体外研究

目的 探究荧光染料CFSE对大鼠间充质干细胞细胞(MSCs)标记的理想条件及跟踪时限.方法 采用终浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L的CFSE在1、5、10 min三个不同的时间点标记MSCs,用流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞的转染率和荧光强度.以此来筛选CFSE标记MSCs的理想条件;采用MTT方法检测在此理想条件下CFSE对MSCs的增殖是否有影响:用流式细胞仪和荧光显微镜检测在此理想条件下CFSE跟踪MSCs的最大时限.结果 终浓度为20.0 μmol/LCFSE作用5 min为CFSE标记MSCs细胞的理想条件,在此理想条件下MSCs细胞的荧光强度能跟踪到第21天时与未标记细胞的荧光强度相接近,并且此理想条件下的CFSE对MSCs细胞的增殖无影响(P0.05).结论 在体外正常的培养条件下终浓度为20.0 μmol/L CFSE作用5 min为其标记MSCs细胞的理想条件,在此理想条件下的CFSE能够跟踪MSCs细胞的最大时限为21d.     

绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞培养及其示踪的可行性

目的观察并比较两种小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及选取GFP-BMSCs作为移植实验示踪的种子细胞可行性。方法通过骨片培养法(A法)和全骨髓贴壁法(B法)培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞,并参照不同的培养方法优化其换液方式;观察两种培养方法原代及传代GFP小鼠骨髓MSCs形态变化;取第3代细胞进行生长曲线测定及多向分化功能检测;观察GFP小鼠骨髓MSC经多次传代及诱导分化后绿色荧光的稳定性。结果 1)A法原代培养可见贴壁细胞增殖形成大小不等的克隆集落,并向周围进一步扩展、融合,而B法在原代培养时由于混杂较多血液系统细胞,传代至3、4代即可获得较纯的BMSCs;2)观察其生长曲线,A法细胞扩增速度快,纯度高,B法细胞由于受杂细胞的影响,扩增难度大;3)BMSCs可被诱导成脂肪细胞,油红O染色可见红色脂肪颗粒;在成骨分化过程中可见骨结节结构形成;4)GFP-BMSCs传代后生物学特性稳定,传代至5代及诱导分化后其GFP表达仍为强阳性。结论与传统全骨髓贴壁法相比,骨片培养法可在原代或1代就获得高浓度的足量干细胞,GFP-BMSCs经多次传代后荧光不减退,可作为体内细胞示踪。     

腺病毒载体介导EGFP转染大鼠骨髓间质干细胞研究

目的：探讨腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的生物学特性。方法：骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓MSCs并采用流式细胞术进行鉴定。利用脂质体法通过腺病毒转染获得EGFP修饰的大鼠骨髓MSCs。结果：成功分离得到大鼠MSCs,腺病毒转染后大鼠骨髓MSCs过表达绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因,且转染后MSCs具有成骨分化潜能。结论：通过腺病毒转染能获得EGFP标记的大鼠MSCs,为MSCs组织工程和基因治疗研究提供了依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞的实验研究

目的 采用5-氮杂胞苷(5-aza)诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞。方法 分离培养骨髓间充质干细胞,采用密度为1．073的percoll分离液分离大鼠骨髓间充质干细胞并进行体外培养和连续传代,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫组化的方法鉴定心肌特异性肌钙蛋白I的表达。结果 诱导前,骨髓间充质干细胞形态均一,呈多突起扁平形态,诱导后细胞形态发生变化,细胞之间形成连接,排列方向渐趋一致,免疫组化显示表达阳性。结论 5-aza可诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞。     

重组腺相关病毒载体介导的绿色荧光蛋白在急性髓性白血病患者骨髓间充质干细胞中的表达

目的 探讨重组腺相关病毒载体(rAAV-2-eGFP)是否可高效转导入骨髓间充质干细胞(BMSCs)。方法 从初发的急性髓性白血病(AML)患者骨髓中分离培养出BMSCs,在不同的感染复数(MOI =102, 103, 104, 105, 106,107)下用包含增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的rAAV-2-eGFP感染BMSCs,寻找最佳的感染条件,并在转染后的不同时间点用倒置荧光显微镜以及流式细胞仪观察其表达情况。结果 转染后10~14 d, eGFP在BMSCs中表达,转染效率为0.3%~2%,增加MOI亦不能明显增加转染效率。在MOI=105的条件下转染后观察了61 d, eGFP保持低水平长期稳定表达,在转染后的12~ 33 d,eGFP阳性的BMSCs从起始时的1.16%下降到(0.5~0.6)%,33~61 d一直维持在这一水平。结论 rAAV-2-eGFP和BMSCs可用于体外基因治疗,但极低的转染效率可能是其进一步应用的障碍。     

骨髓间充质干细胞经慢病毒转染绿色荧光蛋白后的体内观察

目的:观察经慢病毒转染绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)移植注入兔椎间盘后的荧光时效性.方法:体外培养并纯化BMSCs,并用含有GFP标记的重组慢病毒载体(Lentivirus-GFP)转染后移植入兔椎间盘,在移植后2、4、6、8、10、12周用激光共聚焦显微镜观察BMSCs荧光强度及细胞增殖情况,考察慢病毒转染GFP体内荧光维持时间.结果:经慢病毒转染GFP后的BMSCs,荧光显微镜下48 h开始显现绿色荧光,72 h荧光亮度达到最高.植入体内后8周内均能用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光,8周后荧光强度开始逐渐减弱,第2、4、6、8、10、12周6个时间点GFP-BMSCs的阳性率分别是(21.75±1.32)%、(33.07±3.53)%、(33.20±3.60)%、(29.90±4.23)%、(19.64±2.93)%和(10.91±3.43)%.结论:BMSCs在椎间盘微环境中能够稳定增殖,用慢病毒转染GFP的方法能在至少8周内可靠示踪其在椎间盘内的存活状态,8周后荧光强度开始逐渐减弱.     

支架荷载的骨髓间充质干细胞的分化实验研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架上向表皮干细胞分化的可行性。方法体外诱导改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠骨髓间充质干细胞向表皮干细胞分化,免疫组织化学法检测表皮干细胞标志物CK19和整合素β1的表达。结果诱导液作用2周后,免疫组织化学法检测到改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠BMSCs中大量阳性双表达CK19和整合素β1。结论改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠BMSCs仍具有向表皮干细胞分化的潜能,此支架具备作为组织工程皮肤支架材料的条件。     

胎儿骨髓间充质干细胞生物学特征及荧光标记

目的:探讨分离、培养、扩增和荧光标记胎儿骨髓间充质干细胞(Bore mesenchymal stem cell,BMSCs)的方法及其生物学特征.方法:取4～5个月胎儿四肢骨骨髓,Ficoll离心、贴壁筛选法分离BMSCs,体外扩增,传至第12代.检测BMSCs的生长曲线,细胞周期和细胞表型,酶活性及糖原含量,以及DAPI标记BMSCs的标记率.结果:(1)BMSCs主要呈长梭形,漩涡状排列.传代细胞生长快于原代细胞,12代后的细胞出现衰老征象;(2)流式细胞术检测第3、8代细胞表达CD29、CD71,不表达CD34、HLA-DR;C0和G1期细胞约为93.73%,S、M和G2期为6.27%;(3)第5代细胞的非特异性酯酶及糖原均为阳性,碱性磷酸酶为弱阳性;(4)DAPI标记后的BMSCs生长正常,标记率为100%,后逐渐减弱,3周时标记率仅15%.结论:分离获得的胎儿BMSCs具有MSCs的特征.DAPI标记是短期示踪BMSCs的有效方法.