LAMP技术检测单纯疱疹病毒-2型的初步应用

目的建立一种对单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)进行快速、高效、简便的LAMP检测方法。方法用病毒DNA提取试剂盒提取HSV-2基因组DNA,设计4条扩增HSV-2糖蛋白gG基因的LAMP引物,以灭菌水为阴性对照,进行LAMP,LAMP产物经电泳、酶切鉴定。将HSV-2 DNA作10倍系列稀释后进行LAMP,检测其敏感性。结果HSV-2 LAMP产物电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组无扩增条带。LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实。LAMP检测HSV-2的敏感性为0.01 ng/μL。结论检测HSV-2的LAMP方法特异、敏感、简便。     

宿主因子NF90调节流感病毒复制的研究

【目的】 研究流感病毒的宿主因子NF90对流感病毒复制的影响。 【方法】 从 293T细胞中提取总RNA,以Oligo(dT)反转录cDNA。根据Gen Bank 中NF90的基因序列,设计上下游引物。以转录出的cDNA为模板扩增出NF90基因。用EcoR I 和Not I两种核酸内切酶对NF90 PCR扩增产物和PCDNA3.1-V5-HIS载体进行双酶切,酶切产物用高效DNA连接酶连接,然后鉴定选取正确的重组质粒,并命名为PCDNA3.1-NF90-V5-HIS。把PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至293T细胞,转染36 h后感染流感病毒A/WSN/1933 Moi 0.01,感染16 h后提取293T细胞的总蛋白,用蛋白质印迹法检测PCDNA-NF90-V5-HIS 重组质粒和流感病毒NP蛋白的表达。 【结果】 PCDNA3.1-NF90-V5-HIS重组质粒转染至细胞后,NP蛋白表达下降,流感病毒复制减弱。 【结论】 宿主因子NF90可以抑制流感病毒的复制。     

三叶木通MSAP反应体系的优化及引物筛选

目的 研究三叶木通表观遗传多样性,建立并优化三叶木通甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）反应体系。方法 以三叶木通叶片为材料,利用正交试验建立三叶木通MSAP的预扩增和选择性扩增的最佳反应体系。结果 建立的MSAP最佳反应体系为酶切反应：HpaII/MspI 10 U,EcoR I 10 U;预扩增反应：总体积20 μL,连接产物2 μL,E00、HM00各125 ng,dNTPs 0.312 5 mmol/L,Mg^2＋ 1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶2 U;选择性扩增反应：总体积20 μL,稀释200倍的预扩增产物5 μL,引物E-ACT、HM-CAT各50 ng,dNTPs 0.250 mmol/L,Mg^2＋ 1.250 mmol/L,Taq DNA酶1 U。利用优化的体系,最终从MSAP的80对引物中筛选出有效引物6对。结论 建立的MSAP反应体系可用于后续三叶木通DNA甲基化的相关研究。     

棕背鼠平性别的快速鉴定

目的 野生棕背鼠平因其活动敏捷?性情凶猛?不易抓取,很难从外表对其性别做出准确判断,影响分笼及后期的实验室繁育,拟建立一种快速?准确?简便的性别鉴定方法?方法 以棕背鼠平的新鲜被毛为材料,Chelex?100 提取毛囊DNA,利用PCR 技术分别扩增锌指结构基因(ZFY/ZFY)片段和Y 染色体性别决定区基因(SRY)片段,并建立双重PCR 扩增方法?结果 雄性棕背鼠平扩增出ZFY/ZFY和SRY 两个基因片段,而雌性棕背鼠平只扩增出ZFY/ZFY基因片段?利用这种方法对23 只棕背鼠平?10 只Wistar 大鼠和8 只BALB/ c 小鼠进行性别鉴定,扩增结果与表型判断和解剖结果一致?结论 以被毛为实验材料,减少了对棕背鼠平的惊吓和损伤;建立的双重PCR 扩增方法准确?快速,可应用于鼠的性别鉴定?     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系，并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列，并构建Cas9-MAD2L1载体，将该载体转染到NIH/3T3细胞中，通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后，提取细胞转染后的基因组DNA，利用PCR方法，结合T7E1分析和桑格尔测序，鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况，并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞，PCR结合T7E1结果显示，以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，测序结果显示，成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑，脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系，设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

华细辛 AFLP 反应体系的建立和优化

目的 建立优化的华细辛 Asarum sieboldii AFLP 反应体系,为华细辛遗传多样性的研究提供技术支持。方法 以华细辛叶片为材料,对基因组 DNA 提取、酶切连接、PCR 扩增等操作过程中各关键因素进行分析,筛选最适条件,建立完善的 AFLP 反应体系。结果 建立了优化的华细辛 AFLP 分析体系：在基因组 DNA 提取时,提取液中添加巯基乙醇、样品温浴时间为 30 min;Tru1Ⅰ和PstⅠ的酶切时间分别为 3 h;在扩增反应中,Mg²⁺终浓度为 1.5 mmol/L、Taq DNA 聚合酶用量为 0.2 μL。结论 本反应体系可获得良好的 AFLP 分析结果,可用于华细辛遗传多样性研究。     

薏苡SRAP反应体系的优化

目的 建立稳定可靠的SRAP分子标记反应体系,为进一步研究薏苡种质资源的分子鉴定提供依据。方法 采用改进的SDS法提取薏苡种子胚基因组DNA,并采用单因素试验分析Mg²⁺浓度、dNTP浓度、BSA浓度、模板DNA用量、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量等6个因素对薏苡相关序列扩增多态性(SRAP)扩增结果的影响。结果 建立了薏苡最适的SRAP反应体系：10 μL PCR反应体系中,含1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris·HCl,pH9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),1.5 mmol/L Mg²⁺,0.15 mmol/L dNTP,10 ng模板DNA,10 pmol引物,0.5 U Taq酶。结论 所建立的薏苡SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定等特点,为薏苡种质资源的分子鉴定提供了良好的基础。     

利用线性指数PCR-焦磷酸测序技术快速检测3种海洋弧菌

目的： 建立一种基于线性指数聚合酶链式反应(linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)焦磷酸测序技术快速检测致病性海洋弧菌的方法。方法： 首先根据海洋弧菌的16S rRNA基因和外膜蛋白K(OmpK)基因的目的片段设计引物并优化反应条件进行LATE-PCR扩增,其次利用酶促反应处理PCR产物中干扰焦磷酸测序反应的副产物,最后加入退火引物后直接进行焦磷酸测序。结果： 成功进行了LATE-PCR扩增,制备出足量单链DNA模板供焦磷酸测序反应;取1~2 μL的PCR产物即可获得理想的焦磷酸测序信号。测序结果与Sanger法的结果一致,测得序列与GenBank所报道的相符合。通过对16S rRNA基因片段的检测,可以确认样品是否为海洋弧菌;通过对OmpK基因目的片段的检测可以初步区分弧菌种类,对3种常见弧菌：副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌成功地进行了检测。结论： 本方法结果准确,灵敏度高,操作简便且成本低,可快速检测大量样品,在弧菌快速检测和诊断中具有很好的应用前景。     

利用环介导恒温扩增法快速检测空肠弯曲菌

目的 利用环介导恒温扩增技术,以空肠弯曲菌的VS1基因设计引物,建立快速检测空肠弯曲菌的方法,以期能应用于急性腹泻和肠炎等疾病的快速检验.方法 ①通过基因比对与引物设计,设计针对空肠弯曲菌的环介导恒温扩增检测(LAMP)方法;②用钙黄绿素、亚甲基蓝、结晶紫、溴化乙锭4种DNA染料对扩增产物进行染色,评价各染料染色效果;③检测该LAMP方法对空肠弯曲菌及其他干扰菌的扩增情况,评价其特异性;④将该LAMP方法与培养法比较,进行统计学分析.结果 ①设计出针对空肠弯曲菌的LAMP检测方法;②钙黄绿素与扩增产物结合后颜色变化明显,是该LAMP方法中较好的DNA染料物质;③本LAMP检测方法只针对空肠弯曲菌有扩增,对其他干扰菌不扩增,显示出良好的特异性;④试验共检测了60株临床和标准菌株,对于菌株的培养物,LAMP检测结果与培养鉴定法比较差异无统计学意义(x2 =0.3333,P＞0.05).结论 本试验设计出了针对空肠弯曲菌LAMP检测方法,该LAMP法较好的DNA染料物质是钙黄绿素,该方法具有良好的特异性,与培养鉴定法比较具有较高的阳性、阴性及总体符合率,能够用于空肠弯曲菌的快速检验.     

当归肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对当归肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以当归根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Actin基因片段并连接到pMD19-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段598 bp的序列,序列分析表明,该片段编码198个氨基酸,与高等植物Actin基因核苷酸序列同源性在83%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达94%以上。结论 首次从当归中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

蝙蝠蛾拟青霉和中国弯颈霉蛋白质氨基酸分析及质量评价

目的 对蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)和中国弯颈霉(Tol ypocladium sinenis)2种虫生真菌菌丝的蛋白质氨基酸进行含量分析及质量评价,为2种真菌的其他相关研究和应用提供依据.方法 采用盐酸水解法水解菌丝粉,用Agilent 1200高效液相色谱仪C18反相柱梯度进行分离,上柱前加入邻苯二甲醛-氯甲酸芴甲酯(OPA-FMOC)自动衍生化.参照标准品氨基酸,计算待测样品的氨基酸含量.结果 测定了17种蛋白水解氨基酸的含量,其中蝙蝠蛾拟青霉中有4种氨基酸(天冬氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)的含量高于中国弯颈霉,中国弯颈霉中有11种氨基酸(谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、脯氨酸)的含量高于蝙蝠蛾拟青霉.中国弯颈霉氨基酸总量、必需氨基酸总量、非必需氨基酸总量高于蝙蝠蛾拟青霉,蝙蝠蛾拟青霉支链氨基酸含量高于中国弯颈霉.两者必需氨基酸的模式均符合世界卫生组织和联合国粮农组织(WHO/FAO)提出的必需氨基酸模式谱和参考标准.结论 蝙蝠蛾拟青霉与中国弯颈霉均具有较高的营养价值,但两者的蛋白质氨基酸含量并不等同.     

长春花毛状根再生植株的获得及抗癌生物碱的产生

目的 建立长春花转基因毛状根再生植株快速繁育体系,获得生物碱量提高的长春花再生植株。方法 研究外源植物生长调节剂对长春花毛状根愈伤组织诱导、不定芽分化、不定根分化和再生植株移栽的影响,采用HPLC法测定长春花再生植株生物碱量,并采用定量PCR技术分析目的基因的表达情况。结果 转基因长春花毛状根愈伤组织诱导和不定芽诱导的最佳培养基均是MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.3 mg/L,不定根分化的最适培养基是1/2 MS＋NAA 0.3 mg/L。采用炼苗的改进方法可使长春花再生植株的移栽成活率达90%。HPLC分析结果表明,长春花再生植株中长春碱、长春新碱和阿吗碱量分别比对照提高4.0、5.8、1.8倍,其中,优良单株OG30-3的长春新碱和长春碱量比对照提高7倍和10倍。定量PCR分析结果表明,转基因植株orca3基因和g10h基因的表达量比非转基因植株的高。结论 转基因长春花毛状根再生植株可促进抗癌生物碱的产生。     

党参质量评价体系的建立及不同产地党参质量差异性分析

目的 多点采样研究并建立党参质量评价体系,采用其对不同来源的党参进行质量差异性分析。方法 对党参的总灰分、酸不溶灰分、醇溶性浸出物进行测定,采用HPLC-DAD对党参炔苷进行测定并建立HPLC指纹图谱;将指标与指纹图谱结合起来建立党参质量评价体系;用建立的质量评价体系对不同来源的党参样品进行质量评价。结果 不同产地灰分和酸不溶灰分检测结果显示,符合《中国药典》2010年版标准;而不同来源党参炔苷量具有显著性差异;不同产地的党参指纹图谱具有9个共有峰,相关系数均在0.8以上,建立的指纹图谱可用于党参质量评价。结论 本研究用多指标检测结合指纹图谱建立的党参质量评价体系可用于不同来源党参的质量评价及质量控制。     

海拔对当归中阿魏酸量的影响及关键因子分析

目的 在不同海拔进行当归Angelica sinensis生态适应性实验,探索影响当归阿魏酸积累的关键因子。方法 通过田间实验测定当归阿魏酸量的变化和生理生化指标、光合参数、生态因子。结果 当归根中阿魏酸量随海拔升高而增加,且海拔2 780 m处理比海拔2 360 m处理高14.5%,差异显著（P＜0.05）。分析影响当归阿魏酸积累的关键因子表明,降雨量（r＝0.898 8）和温度（r＝?0.799 1）是关键生态因子,可溶性糖（r＝?0.974 9）和超氧化物歧化酶（SOD）（r＝?0.840 8）是关键生理生化因子,湿度（r＝0.969 9）和光合活性辐射(r＝0.946 7)是关键光合参数因子。结论 适当升高种植海拔,增加降雨量和湿度,降低温度和可溶性糖量均有利于当归中阿魏酸的转化积累。     

基于ITS2序列的羌活及其混伪品的DNA条形码鉴定

目的 对羌活及其混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效。方法 利用PCR测序法,对样品进行核基因ITS2片段扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA 4.0进行相关数据分析,并构建邻接（NJ）树。利用已建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。结果 羌活与宽叶羌活ITS2序列长度均为228 bp,二者种内平均K2P（Kimura-2-parameter）遗传距离均远远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离;由所构建的系统聚类树图可以看出,羌活与宽叶羌活均表现出了单系性,而同时又与其他混伪品明显分开;比较ITS2二级结构发现,羌活基原植物与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别羌活及其混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。     

桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序。结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87%以上。结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

基于抗病毒活性检测的板蓝根质量生物评价方法及优化研究

目的 建立基于抗病毒活性检测的板蓝根质量生物评价方法并进行优化研究。方法 分别采用红细胞凝集活性检测法和流感病毒神经氨酸酶（NA）活性检测法,建立板蓝根抗病毒活性生物测定方法,并对所建立的两种方法进行对比分析与优选。结果 两种方法可用于对不同样品进行活性检测和区分,结果重复性较好（RSD＝7.0%、5.78%）;Pearson相关性分析表明板蓝根凝集活性与NA抑制活性之间具有显著相关性（P＜0.01,r＝?0.81）,进一步印证了凝集活性测定法与抗病毒药理作用的关联性;在安全性、经济性、简便性和实用性等方面凝集活性检测法优势明显,可作为板蓝根质量生物测定的优选方法。结论 本研究优选凝集活性检测法用于板蓝根质量的生物测定,与抗流感病毒药效相关,提高了其现行质量控制水平,并为中药质量生物测定方法的研究提供参考。     

基于DNA条形码区域的中药地鳖隐存物种多样性发现研究

[目的]基于DNA条形码COI数据,发现地鳖(土鳖虫主要基原)内部可能的隐存多样性。[方法]对8批33个地鳖个体的线粒体COI片段进行PCR扩增及序列测定。分析COI序列单倍型,分析变异位点,运用邻接法、最大简约法分别构建分子系统发育树,结合种群(批次)内及临时种间的遗传距离发现隐存多样性。[结果]根据系统发育结果区分临时种EsPS1及EsPS2。分析得到COI基因的物种间阈值SST为5.33%。临时种EsPS1与EsPS2间的最小遗传距离为12.00%,显著大于物种间阈值SST。[结论]地鳖内部存在隐存物种多样性。     

濒危南药白木香萜类合成酶的逆境表达模式分析

目的 通过分析各萜类合成酶的表达,预测各种环境因素和逆境处理对白木香萜类合成的影响。方法 对二年生白木香植株和愈伤组织分别进行多种逆境处理,采用荧光定量PCR分析组织中萜类合成酶基因的表达模式。结果 伤害和火烙均可诱导茎干萜类合成酶转录水平的表达,火烙法诱导效果更明显;低温抑制各类萜类合成酶的转录;愈伤组织的处理中,茉莉酸甲酯（MeJA）对萜类合成酶转录的诱导效果最显著。结论 伤害和火烙均可诱导茎干中萜类的合成,但火烙效果更好,低温不利于白木香结香,多种处理均可诱导愈伤组织萜类合成,其中MeJA诱导效果最佳。