膀胱肿瘤抗原致敏的树突状细胞诱导 T 淋巴细胞抗肿瘤效应的研究

目的：研究经膀胱肿瘤抗原致敏后的树突状细胞（Dc）对T淋巴细胞的激活、增殖作用及对T24膀胱肿瘤细胞的抑癌效应。方法：分离健康供血者外周血单个核细胞及T淋巴细胞，联合应用粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）及白介素-4（IL-4）从单个核细胞中培养出Dc，以人膀胱癌细胞系T24肿瘤细胞裂解物刺激Dc，检测经膀胱肿瘤抗原致敏后的DC对T淋巴细胞的细胞增殖动力学影响并用M1rr显色法测定致敏Dc诱导的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞体外的抗肿瘤效应。结果：膀胱癌细胞裂解物致敏的Dc可诱导T淋巴细胞强烈的增殖反应，与对照组比较具有显著性差异（P〈0．01）；增殖后的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。结论：经膀胱肿瘤抗原致敏的Dc能诱导产生显著的T淋巴细胞增殖，在体外有明显的抑癌效应。     

膀胱肿瘤抗原致敏的树突状细胞诱导T淋巴细胞抗肿瘤效应的研究

目的：研究经膀胱肿瘤抗原致敏后的树突状细胞（Dc）对T淋巴细胞的激活、增殖作用及对T24膀胱肿瘤细胞的抑癌效应。方法：分离健康供血者外周血单个核细胞及T淋巴细胞，联合应用粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM—CSF）及白介素-4（IL-4）从单个核细胞中培养出Dc，以人膀胱癌细胞系T24肿瘤细胞裂解物刺激Dc，检测经膀胱肿瘤抗原致敏后的DC对T淋巴细胞的细胞增殖动力学影响并用M1rr显色法测定致敏Dc诱导的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞体外的抗肿瘤效应。结果：膀胱癌细胞裂解物致敏的Dc可诱导T淋巴细胞强烈的增殖反应，与对照组比较具有显著性差异（P〈0．01）；增殖后的T淋巴细胞对T24膀胱肿瘤细胞有明显的细胞毒作用。结论：经膀胱肿瘤抗原致敏的Dc能诱导产生显著的T淋巴细胞增殖，在体外有明显的抑癌效应。     

负载肝癌抗原的树突状细胞瘤苗诱导的抗肿瘤作用

目的 探讨原发性肝癌患者外周血树突状细胞（DC）体外经自体肝癌细胞抗原致敏后诱导的抗肿瘤作用。方法肝癌患者外周血经梯度密度离心法分离，获得DC前体细胞，用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSP）和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）联合培养，诱导扩增DC。制备自体肝癌细胞抗原，体外脉冲DC，检测DC诱导自体T细胞增殖能力及细胞毒性T细胞（CTL）在体外对自体肝癌细胞的杀伤活性，并检测肿瘤抗原致敏DC分泌的IL-12水平。结果经自体肝癌细胞抗原致敏的DC能分泌IL-12和诱导较强的自体T细胞增殖，且能诱导特异性CTL，该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性，杀伤率明显高于DC、未经肝癌细胞抗原致敏的DC激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率，而对3LLLEWIS肺癌细胞、H22肝癌细胞则无明显的．杀伤作用。结论肝癌患者外周血DC经自体肝癌细胞抗原致敏后能诱导高效而特异的抗肝癌免疫，其机制可能与增强T细胞应答和诱导机体产生肿瘤特异CTL而发挥特异性的抗肿瘤作用有关。     

树突状细胞体外诱导抗肿瘤免疫

目的以树突状细胞（DC）在体外诱导抗肝癌免疫。方法自肝癌患者外周血中分离DC;以粒／巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）及白介素-4（IL－4）联合刺激DC;以人肝癌细胞系HepG2细胞的肿瘤相关抗原（TAA）激活DC;DC诱导自体T淋巴细胞增殖、分化为细胞毒性T细胞（CTL）;检测CTL及其上清液对HepG2细胞、BEL－7402细胞、LOVO细胞及HOS－8603细胞的细胞毒作用。结果经人肝癌细胞系HePG2细胞的TAA激活并经GM－CSF及IL－4联合刺激后,肝癌患者外周血DC能够诱导自体T淋巴细胞增殖分化为CTL,该CTL及其上清液对HePG2细胞均有高效杀伤作用（杀伤率分别为92％±10％和41％±8％）,对BEL－7402细胞亦有较强的杀伤力（杀伤率分别为56％±10％和31％±9％）,对SGC－7901细胞、LOVO细胞及HOS－8603细胞则无明显的细胞毒作用。结论肝癌患者外周血DC体外能够诱导高效而特异抗肝癌免疫。提示DC可能在肿瘤治疗及预防其复发和转移中发挥重要作用。     

NY-ESO-1致敏树突状细胞诱导的CTL对肝癌细胞株的特异性杀伤作用

目的:探讨肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1(New York-esophageal-1)致敏树突状细胞体外诱导特异性CTL对肝癌细胞株的杀伤作用.方法:重组质粒pGEX-ESO1经原核诱导表达并纯化GST-ESO1融合蛋白肽.重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和白细胞介素4(rhIL-4)诱导培养人外周血来源的树突状细胞(dendritic cells, DCs),经GST-ESO1融合蛋白肽致敏后诱导特异性CTL增殖.以此CTL为效应细胞,分别以NY-ESO-1阳性表达的肝癌细胞株HepG2和不表达NY-ESO-1的肝癌细胞株H2P为靶细胞,MTT法检测CTL对肝癌细胞株的杀伤作用.结果:重组质粒pGEX-ESO1经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达相对分子质量约36 000的GST-ESO1融合蛋白肽,纯化后的质量浓度为50 μg/ml;经rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导成功培养人外周血DCs,其表型分子HLA-DR为91.4%、CD86为70.5%、CD83为71.2%、CD80为55.3%.NY-ESO-1致敏的DCs能明显诱导CTL增殖,此CTL对肝癌细胞株HepG2的杀伤率显著高于GST刺激组、未致敏DC组和无DC刺激组(均P<0.05),效靶比为50 ∶1时杀伤效应达到最高峰[(53.23±3.78)%,P<0.01];相同条件下CTL对H2P细胞无特异性杀伤作用.结论: NY-ESO-1抗原致敏的DCs在体外可诱导同种CTL产生和增殖,后者对NY-ESO-1阳性肝癌细胞株具有特异性杀伤效应,该方法为肝癌免疫治疗提供了一条新思路.     

树突状细胞体外高效诱导白血病特异性细胞毒性T淋巴细胞生成

[目的]研究体外诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)及其抗白血病反应.[方法]应用mGM-CSF及mIL-4细胞因子从小鼠骨髓细胞扩增出成熟树突状细胞(DC),使其负载冻融法制备的白血病细胞相关抗原(TAA),通过观察DC诱导的白血病特异性CTL的免疫表型,MTT分析其对于L7212细胞的抑制率,利用ELISA评价IL-2和IL-4水平.[结果]骨髓单个核细胞经mGM-CSF、mIL-4的联合作用7天后光镜及扫描电镜下观察到大量成熟DC生成.经负载TAA的DC活化后T细胞中CD3 、CD8 、CD25 细胞明显增多.FCM显示CD3 、CD8 、CD25 T细胞显著增多,CD8 细胞多于CD4 细胞.活化后T细胞对L7212细胞有特异性杀伤活性,在效靶比为50:1培养72 h后杀伤率达90.1%±2.7%.DC与T细胞共培养上清中IL-2的分泌水平为4.656±0.62pg/ml,明显高于普通T细胞培养组的1.436±0.11pg/ml(P=0.011),IL-4水平则无明显变化(P＞0.05).[结论] mGM-CSF及mIL-4配伍诱导生成的DCs经L7212冻融抗原负载后可在体外高效诱导白血病特异性CTL生成.     

肝癌细胞抗原负载树突状细胞激活CTL的抗肿瘤作用

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一 ,世界范围内每年约有 10 0～ 12 5万人死于肝癌 ,我国是肝癌高发国家。导致肝癌发生的主要危险因素有HBV ,HCV感染及各种肝硬化等。肝癌化疗、放疗疗效差 ,虽尚有另外多种治疗方法 ,包括手术切除、化疗栓塞、瘤体内注射药物和肝移植等 ,但预后均不理想。研究表明肝癌患者机体免疫功能存在严重障碍。本课题对肝癌患者外周血树突状细胞介导的抗肿瘤功能状态进行了研究 ,现报道如下。1　材料与方法1.1　临床资料6例肝癌患者分别为我院及省肿瘤医院住院病人。年龄范围 36～ 5 6岁 ,平均年龄 4 6 .2岁 ,均经B超、…     

CB6F1小鼠树突状细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞的杀伤作用

[目的]探讨CB6F1小鼠脾树突状细胞(DC)的培养及其诱导针对小鼠路易斯肺癌(LLC)的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤的杀伤效应.[方法]应用CB6F1小鼠脾细胞在GM-CSF、IL-4等细胞因子作用下培养出DC,反复冻融法制备LLC抗原致敏DC,与淋巴细胞及IL-2混合培养诱导出肿瘤特异性CTL,利用乳酸脱氢酶法检测CTL的杀伤活性.[结果]用GM-CSF、IL4联合培养小鼠脾细胞第4d,可见细胞形态发生改变,培养第8d,可见典型的刺突样DC,通过流式细胞术检测了DC表型高表达CD80占76.5％,CD86占60.0％,MHCⅡ占67.4％,CD11C占80.6％.[结论]应用GM-CSF、IL-4、LPS等细胞因子培养CB6F1小鼠脾细胞经过肿瘤抗原冲击,可以培养出成熟DC,并且DC可以诱导出具有杀伤活性的肿瘤特异性CTL.     

次级淋巴组织趋化因子和甲胎蛋白共修饰的树突状细胞诱导特异性抗肝癌免疫作用的研究

背景与目的：树突状细胞（dendritic cell,DC）是迄今发现的抗原呈递功能最强的专职抗原呈递细胞,近年来以DC为基础的肿瘤基因免疫治疗研究倍受瞩目。病毒载体介导的基因转移以其高效和良好的靶向性已被广泛应用于肿瘤基因治疗。本实验拟制备携带人AFP和SLC基因的慢病毒表达载体,并于体外感染CD34^＋造血干细胞来源的DC,诱导DC产生特异性抗肝癌细胞免疫作用,观察其对肝癌细胞株的杀伤作用。方法：采用化疗和集落刺激因子动员的肝癌患者外周血造血干细胞,血细胞分离机采集CD34＋造血干细胞,IL-4、GM-CSF联合TNF-α刺激CD34^＋细胞分化为DC。并检测经Lenti-AFP/Lenti-SLC转染致敏后的DC对CTL增殖的影响,并检测其对人肝癌细胞HepG2的作用。结果：经细胞因子刺激诱导培养的DC具有典型的分枝状突起,高表达CD1a、CD11c、CD80和CD86。MTT法检测Lenti-AFP/Lenti-SLC抗原冲击的DC能明显诱导CTL增殖。此CTL对表达AFP的肝癌细胞株HepG2的杀伤率显著性高于未转染DC组和无DC组（P〈0.05和P〈0.01）,效靶比为50：1时杀伤效应达到最高峰（P〈0.01）。结论：Lenti-AFP/Lenti-SLC抗原转染的DC在体外可诱导同种CTL产生和增殖,后者对AFP阳性肝癌细胞株具有特异性杀伤效应,该方法为肝癌免疫治疗奠定了基础。     

树突状细胞在食管癌T细胞抗肿瘤免疫中的作用

目的：研究食管癌组织中树突状细胞（ＤＣｓ）在肿瘤浸润性Ｔ淋巴细胞激活中的作用,方法：用免疫组化和ＲＴ－ＰＣＲ的方法,检测４６例食管癌手术标本中ＤＣｓ（ＣＤ１ａ）、Ｔ细胞亚群（ＣＤ３、ＣＤ４、Ｃ人刺激因子Ｂ７。结果：癌组织中的ＤＣｓ与ＣＤ３（＋）、ＣＤ４（＋）Ｔ细胞有相关性,与ＣＤ８（＋）、ＣＤ２５（＋）Ｔ细胞无明显关系,且Ｂ７ｍＲＮＡ表达均为阴性,结论：食管癌中ＤＣｓ不一定能有效地激活Ｔ细胞,其中Ｂ７基因表达受抑制,可能是不能有效激活Ｔ淋巴细胞产生免疫耐受的重要原因之一。     

造血干细胞诱导树突状细胞的临床应用

目的:探讨回输自动员人外周造血干细胞(PBSC)体外诱导树突状细胞(DCs)治疗乳腺癌患者的可行性.方法:采用CS-3000血细胞分离系统分离9例粒细胞集落刺激因子(G-CSF)预动员乳腺癌患者PBSC,在体外经rhGM-CSF、rhIL-4诱导和自体肿瘤细胞提取物刺激后成为成熟DCs,收集并自体回输.用MTT法测定DCs在体内外激活细胞毒性T细胞(CTL)的体外杀伤活性.结果:9例患者平均采集1.02×109PBSC,培养后平均收获2.3×108DCs,CD83表达率平均为68.7%.收获DCs的数量是等量未动员全血的57.5倍.在体外自体肿瘤抗原致敏的DCs激活CTL对自体原代培养的肿瘤细胞具有显著的杀伤活性.DC瘤苗自体回输除轻微发烧外,无任何其它不良反应,回输后患者PBMC对自体肿瘤细胞的杀伤活性提高20倍.结论:用血细胞分离机分离G-CSF动员肿瘤患者PBSC,在体外诱导制备自体DC瘤苗,回输治疗可提高对自体肿瘤细胞的杀伤活性,而且安全可靠,无明显不良反应.     

白血病细胞可溶性蛋白抗原诱导抗白血病作用

目的探讨白血病细胞可溶性蛋白抗原诱导的抗急性白血病的特异性CTL作用。方法采用急性粒细胞白血病细胞可溶性蛋白抗原致敏体外培养的DC,并通过MTT法测定CTL活性。结果利用反复冻融法可获取可溶性蛋白抗原;在效应细胞:靶细胞为20∶1时,可溶性蛋白抗原组CTL活性达(38.83%±5.42%),不同效靶比对CTL活性无明显影响。结论可溶性蛋白抗原可诱导产生一定程度的抗白血病特异性CTL,为急性白血病微小残留病免疫治疗提供了1种有临床应用前景的方法。     

树突状细胞与肿瘤细胞融合后对肿瘤发生和生长的抑制作用

目的研究树突状细胞（ＤＣ）与肿瘤细胞（ＳＰ２／０）融合后在体内的抗肿瘤效应。方法体外分离诱导扩增ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠骨髓ＤＣ,然后与ＳＰ２／０细胞进行融合,将融合细胞接种于同基因小鼠皮下,观察肿瘤的生长及组织病理学特征。结果ＤＣ与ＳＰ２／０细胞融融后接种于小鼠能抑制肿瘤的生长,肿瘤的发生、生长速度及病理组织学改变的显示出ＤＣ－ＳＰ２／０融合细胞的抑制效应。结论ＤＣ与肿瘤细胞融合后在体内可产生抗肿瘤免疫     

树突状细胞与肿瘤细胞融合后诱导T细胞介导的抗肿瘤效应

目的：研究树突状细胞（DC）与肿瘤细胞（SP2／0）融合作为肿瘤疫苗免疫小鼠后抑制肿瘤生长的作用及其机理。方法：BALB／C小鼠DC与SP2／0细胞体外融合,形成的杂交瘤分2次免疫接种同基因小鼠皮下,然后用SP2／0细胞攻击免疫的小鼠,观察肿瘤的生长情况及免疫小鼠脾细胞特异性CTL功能。结果：DC－SP2／0杂交瘤接种小鼠能产生明显的抗肿瘤效应,其拮抗SP2／0细胞攻击的能力明显强于用灭活的死SP2／0细胞与DC混合,和单用死SP2／0细胞免疫的小鼠及用生理盐水的对照组小鼠。DC－SP2／0杂交瘤免疫接种小鼠的脾细胞特异性CTL杀伤活性强于其它各组小鼠。结论：DC与肿瘤细胞融合后作为肿瘤疫苗接种可在体内产生明显的抗肿瘤免疫,其机理主要是特异性CTL的作用。     

胃癌干细胞抗原负载的DC -CIK对胃癌细胞的杀伤活性

 目的 探讨胃癌干细胞抗原负载树突细胞（DC）联合细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)对胃癌细 胞的影响。方法 分离人胃癌干细胞,冻融法制备抗原,将胃癌干细胞负载DC-CIK细胞,用流式细胞仪检测胃癌干细胞和DC、CIK细胞表型;将胃癌细胞与DC组、DC-CIK组、胃癌细胞抗原组、负载胃癌干细胞抗原组联合培养,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同组别对胃癌细胞的杀伤作用。结果 经胃癌干细胞抗原刺激的DC细胞,DC表面成熟标志CD83和CD86 表达明显增加,CD83 和CD86表达率为80.4%,高于DC组、DC-CIK组和胃癌细胞抗原组,差异有统计学意义（P<0.01）; MTT检测结果显示：负载胃癌干细胞抗原组、胃癌细胞抗原组、DC-CIK组、DC组对胃癌细胞杀伤率分别为（80.6±0.8）%、（72.3.±0.6）%、（58.4±0.2）%和（49.7±0.8）%,组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论   胃癌干细胞作为抗原刺激DC细胞,可增强树突状细胞免疫表达,促进细胞增埴,提高对胃癌细胞的杀伤作用。     

树突状细胞疫苗在人源化裸鼠体内的抗肿瘤免疫保护作用

 目的 探讨树突状细胞（DCs）疫苗在人源化裸鼠体内的抗胃癌免疫保护作用。方法 制备DCRNA疫苗;建立人源化裸鼠模型;15只人源化裸鼠随机分为DCRNA组、DCs组和PBS组,每组5只,分别用DCRNA、DCs和PBS皮下免疫注射2次,间隔1周,末次免疫后3天皮下接种胃癌细胞。各组裸鼠外周血人源性CD4（T细胞和CD8（T细胞的检测和观察GVHD反应。观察裸鼠瘤体积和瘤重。检测细胞因子IL-12和IFN-γ水平。结果 各组HuPBTL-裸鼠外周血中均检测到人源性CD4（T细胞和CD8（T细胞,无GVHD反应。DCRNA组瘤体积明显小于DCs组和PBS组（P〈0.05）;DCRNA组瘤重明显小于DCs组和PBS组（P=0.0452、P=0.0004）,但DCs组和PBS组差异无统计学意义（P=0.0618）;DCRNA组抑瘤率（53.7%）显著高于DCs组（25.1%）（P〈0.05）。DCRNA组IL-12和IFN-γ水平明显高于DCs组和PBS组（P〈0.05、P〈0.01）。结论 HuPBTL腹腔注射,可成功构建裸鼠人细胞免疫功能;DC疫苗在人源化裸鼠体内能诱导产生较强的抗胃癌免疫保护作用。     

抗原致敏树突状细胞诱导CIK对肺癌细胞杀伤作用的研究

[目的]研究肿瘤抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）和细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对肺癌细胞株A549和肺腺癌原代细胞的杀伤作用。[方法]取健康人外周血单个核细胞,常规诱导出DC、CIK、LAK细胞。用肺癌A549细胞提取的肿瘤抗原冲击DC,倒置显微镜下观察DC形态。流式细胞仪检测DC经抗原冲击和未经抗原冲击后其表型变化。LDH释放法测定杀伤活性。[结果]DC经肿瘤抗原冲击后在镜下呈典型成熟形态,其表面分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表达明显较未经肿瘤抗原冲击的DC高。DC＋CIK细胞对A549和肺腺癌原代细胞的杀伤活性高于CIK细胞、LAK细胞和DC＋LAK细胞（P〈0.05）,随着效靶比的升高,其杀伤效应随之增强（P〈0.05）。[结论]肿瘤抗原致敏的DC可诱导特异性CIK细胞,DC＋CIK细胞对A549和肺腺癌原代细胞的杀伤作用明显高于DC＋LAK、CIK、LAK细胞。     

负载肺癌抗原DC疫苗抗肿瘤免疫实验

 目的探讨负载人肺癌细胞株A549冻融抗原DC疫苗体外抗肿瘤免疫效应。方法自脐血分离单核细胞，经rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α诱导树突状细胞（DC），负载人肺癌细胞株A549冻融抗原、LPS诱导成熟，利用免疫磁珠分选获得功能性肺癌DC疫苗（UbDC／AgL），ELISA测定UbDC／AgL培养上清中细胞因子浓度、LDH法测定特异性细胞杀伤（CTL）活性及MTT法检测自身混合淋巴细胞反应（AMLR）。结果UbDC／AgL细胞组IL-1、IL-12、IL-6和IFN-β含量明显高于UbDC／Ag和UbDC组（P〈0．01）；UbDC／AgL疫苗细胞能有效诱导肿瘤特异性CTL活性，对A549细胞有特异性杀伤作用（P〈0．01），并能有效促进淋巴细胞增殖。结论负载肿瘤冻融抗原DC疫苗，能有效激活T淋巴细胞进而诱导肿瘤特异性杀伤效应。     

DC肿瘤融合瘤苗抗肿瘤效应的实验研究

目的:观察DC与肿瘤细胞融合后的瘤苗体内诱导的抗肿瘤免疫应答以及对荷瘤小鼠的治疗作用.方法:应用免疫磁珠分选和贴壁培养方法收集融合细胞,应用3H-TdR掺入法、4h51Cr释放法观察T细胞增殖反应的能力和CTL活性,并观察瘤苗对荷瘤小鼠保护性免疫反应和免疫治疗作用.结果:DC肿瘤融合瘤苗具有强烈的激活T细胞增殖和抗原提呈的能力,在体外、体内诱导出更强的特异CTL细胞毒活性,使免疫小鼠产生一定的免疫保护作用,抵抗Hepa1-6肝癌细胞的再次攻击,使治疗的小鼠肿瘤的生长明显缓慢,具有更明显的治疗作用.结论:DC与肿瘤细胞融合后进行体内免疫和治疗,能诱导出显著的抗肿瘤免疫反应,为DC介导的肿瘤免疫治疗开辟了新的途径.