胃癌多药耐药细胞端粒酶活性变化及其机制探讨

目的：探讨人胃腺癌细胞系SGC7901及其多药耐药亚系SGC7901／VCR中端粒酶活性变化及其机制，为胃癌多药耐药机制研究提供新靶点。方法：采用TRAP银染方法检测SGC7901和SGC7901／VCR中端粒酶的活性；应用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测SGC7901和SGC7901／VCR中端粒酶hTERT、Madl及c—myctuRNA的表达；将hTERT启动子构建的报告基因质粒（pGL3B—TRTP），转染入SGC7901和SGC7901／VCR中，应用双荧光素酶报告基因检测系统（Dual—Luciferasereporterassaysystem）检测端粒酶hTERT启动子的活性。结果：SGC7901／VCR细胞中的端粒酶活性及端粒酶hTERTmRNA表达均显著高于SGC7901细胞，且SGC7901／VCR中hTERT启动子的活性显著高于SGC7901，在SGC7901／VCR中捡测到c—mycmRNA的表达，但未检测到MadlmRNA的表达，而在SGC7901细胞中分别检测到MadlmRNA和c—mycmRNA的表达，且SGC7901细胞中c—mycmRNA的表达也高于SGC7901／VCR。结论：端粒酶活性及端粒酶hTERT转录水平升高与胃癌细胞的多药耐药性密切相关，转录因子Madl／c—myc的表达高低是其作用机制之一。     

下调CACNA2D1对胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:探讨下调CACNA2D1对胃癌耐药性细胞系SGC7901/ADR耐药的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)的方法检测16对胃癌及癌旁组织以及胃癌细胞系SGC7901和SGC7901/ADR中的CACNA2D1 的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹技术（Western blot）检测CACNA2D1的蛋白表达情况;MTT法检测SGC7901、SGC7901/ADR及转染CACNA2D1 siRNA后SGC7901/ADR的IC50值;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:qRT-PCR结果显示:CACNA2D1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.01);CACNA2D1在耐药细胞系SGC7901/ADR中的表达明显高于其亲本细胞系SGC7901(P＜0.01)。蛋白免疫印迹技术结果显示相对于转染CACNA2D1 negative control（NC）组,转染CACNA2D1 siRNA组的胃癌细胞CACNA2D1表达降低;MTT结果显示细胞系SGC7901与SGC7901/ADR的阿霉素半数抑制浓度（IC50）分别为（1.3±0.6）μg/ml与（5.5±0.45）μg/ml;SGC7901/ADR转染CACNA2D1 siRNA后对阿霉素的IC50明显下降。流式细胞术检测凋亡结果显示,CACNA2D1的表达下调后,SGC7901/ADR细胞的凋亡比明显增加。 结论:CACNA2D1能够促进胃癌SGC7901/ADR细胞系产生多药耐药。     

Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中的克隆及表达

目的:在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中对Ro60进行克隆,对Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR和药敏胃癌细胞系SGC7901中的表达情况进行比较分析。方法:应用RT-PCR法克隆Ro60的编码基因,通过DNA序列测定对所克隆的基因进行验证。应用半定量RT-PCR法检测Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR和药敏胃癌细胞系SGC7901中的表达情况。结果:在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中,成功克隆了Ro60的编码基因,其DNA序列与Ro60的cDNA序列完全一致。半定量RT-PCR结果显示,Ro60在耐药胃癌细胞系SGC7901/ADR中的表达强度显著高于药敏胃癌细胞系SGC7901细胞中的表达强度,P<0.01。结论:Ro60在耐药胃癌细胞系中高表达,该分子可能是一种胃癌多药耐药相关分子。     

下调PHLDB3对胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR药物敏感性的影响

目的:探讨下调PHLDB3对胃癌耐药细胞系 SGC7901/ADR 药物敏感性的影响。方法:采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹技术（Western blot）的方法检测胃癌及癌旁正常组织中PHLDB3的表达（分别是20对和10对）;qRT-PCR和Western blot检测PHLDB3在胃癌细胞系 SGC7901以及胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达;MTT法检测SGC7901、SGC7901/ADR及转染PHLDB3 siRNA后 SGC7901/ADR的半数抑制浓度（IC50）值;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:qRT-PCR和Western blot结果显示:PHLDB3在胃癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织（P<0.000 1）;PHLDB3在耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达明显高于其亲本细胞系SGC7901（P<0.000 1和P<0.05）。Western blot结果显示:相对于转染 PHLDB3 negative control（NC）组,转染 PHLDB3 siRNA组的SGC7901/ADR细胞中PHLDB3的表达降低（P<0.005）。MTT结果显示:SGC7901与 SGC7901/ADR的IC50值分别为（1.5±0.1） μg/ml与（5.5±0.2） μg/ml（P<0.000 1）;SGC7901/ADR 转染 PHLDB3 siRNA 后对顺铂的IC50值明显下降（P<0.05）。流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测凋亡,结果显示:下调PHLDB3的表达后,SGC7901/ADR细胞的凋亡率明显增加（P<0.05）。结论:PHLDB3能够促进胃癌细胞系 SGC7901/ADR产生多药耐药。     

RPL6/Taxreb107在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR中的差异表达及其与MDR相关性的初步研究

目的 探讨BPL6／Taxreb107在胃癌耐药细胞系SGC7901／ADR与胃癌细胞系SGC7901的差异表达,以及与胃癌多药耐药(MDR)的相关性。方法 提取SGC7901和SGC7901/ADR细胞系总RNA;采用内对照RT-PCR检测RPL6基因和Northem杂交、基因克隆与表达、真核表达载体的构建;以电穿孔法基因转染;以流式细胞仪检测瞬时转染细胞的阿霉素蓄积和潴留。结果 内对照RT-PCR和Northern杂交证实RPL6/Taxreb 107在SGC7901/ADR中高表达。将PCR产物克隆人pUCm-T载体并经测序证实。构建正义和反义真核表达载体(pcDNA3．1)并经酶切鉴定证实后,以电穿孔法将正义真核表达载体转入SGC7901,反义真核表达载体转入SGC7901／ADR。转染48h后检测转染细胞的阿霉素蓄积和潴留,结果提示RPI6／Taxreb107转入细胞后对细胞的耐药性有影响。结论 BPI6／Taxreb107在耐药胃癌细胞中高表达,对胃癌的MDR有影响。     

P-糖蛋白、谷胱甘肽-s转移酶的表达与胃癌细胞耐药的关系研究

目的初步探索胃癌多药耐药细胞系SGC7901／VCR的耐药机制。方法间歇诱导法,胃癌细胞系SGC7901经长春新碱（VCR）短时间诱导后,对长春新碱产生耐药。MTT法检测对VCR、5-氟尿嘧啶、表阿霉索的耐药性。Western blot检测P-糖蛋白（P—glucoprotein,P—gp）、谷胱甘肽-s转移酶（ghtathione—s transferring enzyme,GST—s）的表达。结果耐药细胞SGC7901／VCR对长春新碱耐药提高16．56倍,此耐药株同时对5-氟尿嘧啶、表阿霉素呈交叉耐药,耐药指数分别达6．9、13．05。SGC7901／VCR的P—gP、GST—s出现表达增强。结论长春新碱短时间诱导后,SGC7901产生多药耐药性（multi—drug resistance,MDR）,且P—gp、GST—s表达增强。反之,抑制P—gP、GsT—s蛋白的表达,则有可能降低细胞耐药从而逆转胃癌MDR。     

胃癌耐药细胞EXOs的提取鉴定及可能存在的耐药信息传递作用的初步探讨

目的:探讨胃癌耐药细胞（SGC7901/Adr）分泌的外泌体（exosomes,EXOs）在细胞间可能存在的耐药信息传递作用。方法:选用胃癌亲本细胞SGC7901及其阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr为模型,用PEG方法提取EXOs;透射电子显微镜观察鉴定细胞EXOs形态;Western Blot检测CD9、CD63、TSG101、Calreticulin以及P-糖蛋白（P-gp）的表达;运用激光共聚焦显微镜观察胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞及加入阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr外泌体处理后的敏感细胞内阿霉素药物浓度变化。结果:透射电子显微镜下观察到,胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞来源的EXOs为直径在30~100 nm之间的囊性小泡,呈圆形或椭圆形,大小均匀一致。Western Blot检测胃癌SGC7901和SGC7901/Adr细胞来源的EXOs,携带有外泌体生物标记分子CD9（四次跨膜分子）、CD63（四次跨膜分子）以及TSG101表达,Calreticulin为阴性表达。进一步检测发现在SGC7901/Adr细胞来源的EXOs中存在P-gp蛋白表达。经过阿霉素耐药细胞SGC7901/Adr外泌体处理后的敏感细胞,胞内可见阿霉素聚集减少,核区分布减少,荧光强度减弱。结论:胃癌耐药细胞分泌的EXOs可能通过传递P-gp蛋白的形式,具有传递耐药信息的作用。     

KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药中的作用

目的:探讨KLF8（Kruppel-like factor 8）在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用。方法:利用Western blot和实时定量PCR的方法检测三株胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901在常氧及缺氧条件下KLF8的表达水平。Western blot和实时定量PCR检测胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR、SGC7901/ADR和亲本细胞系SGC7901中KLF8的表达水平。构建KLF8正义表达载体及KLF8小干扰RNA的慢病毒载体,将其转染入实验细胞中,用Western blot和实时定量PCR的方法检测KLF8表达量的变化。MTT、Annexin V/PI染色法及阿霉素蓄积量与潴留实验检测KLF8在缺氧诱导胃癌细胞多药耐药表型中的作用。结果:缺氧可诱导胃癌细胞系MKN28、MKN45、SGC7901中KLF8的表达升高。与胃癌亲本细胞系相比,KLF8在胃癌耐药细胞系中的表达升高,并且在SGC7901/VCR细胞中表达升高的更为明显。外源性转染KLF8后可显著增加胃癌细胞中KLF8的表达量,KLF8小干扰RNA可有效降低常氧及缺氧条件下胃癌细胞中KLF8的表达。常氧条件下,外源性转染KLF8的正义表达载体可增加胃癌细胞对不同化疗药物的耐受性,降低化疗药物诱导的胃癌细胞凋亡指数,同时可增加细胞内阿霉素的泵出率。缺氧条件下,KLF8小干扰RNA能够逆转胃癌细胞中上述现象的发生。结论:初步实验结果发现了一个新的缺氧反应分子-KLF8。表型试验证实该分子在缺氧诱导胃癌多药耐药中发挥作用。     

MDR 逆转因子筛选技术P-gp 细胞系的建立及其生物学特性评价

 目的 通过基因转导和药物诱导，建立稳定表达P—gp的细胞系，用于筛选特异性逆转P-gp的药物。方法 经RT-PCR反应得到小鼠肿瘤细胞P-gp DNA，转化大肠杆茵，构建并将质粒DNA转导逆转录病毒载体中，进而感染B-MD-C1细胞。采用Northern印迹法和流式细胞技术检测细胞P-gp mRNA和P-gp分子的表达；以MTT法分析细胞的增殖活性；应用药物聚集和排放实验检测其生物学活性。结果 成功构建了稳定表达特异性P-gp基因和P-gP分子的B-MD-C1(ADR+／+)细胞系。经阿霉素诱导，B-MD-C1(ADR+／+)细胞P-gp的表达明显增高，在阿霉素增加至12000ng／mL时，仍有80％的细胞保持良好增殖状态，而B-MD-C1(wt)细胞在1000ng／mL时100％细胞死亡。B-MD-C1(ADR+／+)较(wt)细胞对MI>123有较低的聚集量和较高的排放量，加入P—gP逆转剂Verapamil后，B-MD-C1(ADR+／+)细胞MD-123聚集量增加，药物外排作用消失。结论 B-MD-C1(ADR+／+)细胞系具有较强的药物耐受性，可用于筛选特异性逆转P-gp的药物，Verapamil可逆转P—gP耐药性，具有Verapamil特性者可视为具有逆转P—gp耐药性。     

miR-103与胃癌多药耐药作用机制探讨

目的 既往研究肿瘤耐药均集中在DNA水平,而DNA又影响mRNA及蛋白质表达.但是mRNA与编码蛋白质的表达并不成比例,而非编码RNA恰好能解释两者之间的不平衡.非编码RNA即微小RNA(microRNA,miRNA),是一类内源性短链非编码小分子核糖核苷酸,长度约18~25个核糖核苷酸,是转录后基因表达调节的关键分子,参与胃癌的发生发展.本研究旨在探讨miR-103在胃癌多药耐药中作用及其分子机制.方法 miRNA芯片筛选SGC7901/ADR及SGC7901细胞差异表达miRNA,应用qRT-PCR验证miR-103表达;将miR-103的拟似物及抑制物分别转染SGC7901/ADR及SGC7901细胞,MTT法检测转染前后对多柔比星敏感性变化;蛋白质印迹法检测miR-103对caveolin-1表达的影响.结果 miR-103在SGC7901/ADR细胞中表达(0.32±0.04)显著低于SGC7901细胞.miR-103拟似物转染SGC7901/ADR细胞后对多柔比星的敏感性较对照组显著提高,IC50由(18.83±0.32) μg/mL下降到(4.54±0.29) μg/mL,t=1.04,P<0.05;而miR-103抑制物转染SGC7901细胞后对多柔比星的敏感性显著降低,IC50由(1.65±0.03) μg/mL上升到(15.27±0.26) μg/mL,t=1.25,P<0.05.miR-103靶向作用于caveolin-1的3'-UTR,并在转录后水平负向调控caveolin-1表达.结论 miR-103通过靶向负调控caveolin-1表达,增加SGC7901/ADR细胞对多柔比星敏感性,从而逆转胃癌多药耐药.     

IGF-1对胃癌血红素氧合酶-1表达的影响

目的:研究胃癌患者血清中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和血红素氧合酶-1(HO-1)的表达相关性,并探讨IGF-1对胃癌细胞中HO-1表达的调控作用.方法:收集胃癌患者血清标本,ELISA检测血清中IGF-1和HO-1的含量;胃癌细胞株SGC7901作为体外实验载体,不同浓度IGF-1干预胃癌细胞,Real time PCR和Western blot检测胃癌细胞中HO-1 mRNA和蛋白的表达量;随后在胃癌细胞培养基中加入IGF-1阻断剂,观察应用阻断剂前后胃癌细胞HO-1表达的变化.结果:胃癌患者血清中IGF-1和HO-1的表达较正常人群明显升高,且两者的表达呈正相关性.体外培养胃癌细胞SGC7901,IGF-1可显著促进胃癌细胞HO-1的表达,且该效应呈浓度依赖性.培养基中应用IGF-1阻断剂后,胃癌细胞HO-1的表达量明显受到抑制.结论:本实验探讨胃癌中IGF-1和HO-1表达的相关性,初步阐述IGF-1对胃癌HO-1表达的正向调控作用,为HO-1参与IGF-1促进胃癌发生及发展提供了理论依据.     

PD1/PD-L1抑制剂治疗肿瘤

近年来,程序死亡分子(programmed death-1,PDl)/PD1配体(PD1 ligand,PD-L1)抑制剂在黑色素瘤的治疗中取得了突破性进展,并迅速应用到其他类型肿瘤,其中包括肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、消化道肿瘤、妇科肿瘤、泌尿系统肿瘤以及骨髓瘤和淋巴瘤等多种恶性肿瘤,许多临床试验证明了抗PD1/PD-L1治疗可显著改善癌症患者生存期,并且治疗相关不良反应耐受性尚可.目前关于其抗肿瘤活性及安全性的研究仍在继续,并进一步探索其诊断、疗效评估的理想生物标记物,以及用于长期监测的方法,期待这些问题的解决,使抗PD1/PD-L1治疗更加系统、完善,为更多的癌症患者带来生存获益.     

Update on the role of C1GALT1 in cancer

Cancer remains one of the most difficult diseases to treat. In the quest for early diagnoses to improve patient survival and prognosis, targeted therapies have become a hot research topic in recent years. Glycosylation is the most common posttranslational modification in mammalian cells. Core 1β1,3-galactosyltransferase (C1GALT1) is a key glycosyltransferase in the glycosylation process and is the key enzyme in the formation of the core 1 structure on which most complex and branched O-glycans are formed. A recent study reported that C1GALT1 was aberrantly expressed in tumors. In cancer cells, C1GALT1 is regulated by different factors. In the present review, the expression of C1GALT1 in different tumors and its possible molecular mechanisms of action are described and the role of C1GALT1 in cancer development is discussed.     

C1GALT1在恶性肿瘤中的相关研究进展

糖基化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式,而异常的蛋白质O-糖基化被认为是恶性肿瘤的一种潜在标志物。核心1β13-半乳糖基转移酶1（core 1 β1-3 galactosyltransferase 1,C1GALT1）为合成黏蛋白型O-聚糖的核心1（core 1）结构的必需酶,其作用是将半乳糖（Gal）转移至GalNAcαSer/Thr上形成Galβ1-3GalNAcαSer/Thr结构。C1GALT1在呼吸系统、胃肠系统和泌尿生殖系统等多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用,调控多种肿瘤相关蛋白的O-糖基化修饰,不仅参与了肿瘤的增殖、侵袭转移、放疗抵抗及耐药等恶性表型的调控,还与患者的临床病理特征及预后密切相关。本文对C1GALT1在恶性肿瘤中最新研究进展进行综述,并探讨C1GALT1作为治疗靶点的前景。      

RB1CC1 activates the promoter and expression of RB1 in human cancer

RB1‐inducible coiled‐coil 1 (RB1CC1, also known as FIP200) is a tumor suppressor implicated in the regulation of RB1 (retinoblastoma 1) expression. However, the molecular mechanism of RB1 regulation by RB1CC1 has not been elucidated. Here, we demonstrate that nuclear RB1CC1 binds to the RB1 promoter using chromatin immunoprecipitation assays with anti‐RB1CC1 antibody. Luciferase assays with RB1 promoter reporter plasmids revealed that RB1CC1 activated the RB1 promoter through the 201 bp upstream GC‐rich region (from the initiation ATG). Electrophoretic mobility shift assay and Western blot analysis supported RB1CC1 binding to the GC‐rich region of the RB1 promoter. In addition, the C‐terminus of RB1CC1 was required for nuclear localization and subsequent RB1 promoter activation. Furthermore, the expression levels of RB1CC1 and RB1 significantly correlated with in vivo breast cancer tissues as determined by immunohistochemical analysis. These data indicate that nuclear RB1CC1 directly activates the RB1 promoter to enhance RB1 expression in cancer cells. Evaluation of RB1CC1 in various types of human cancer tissues is expected to provide useful information for clinical practice and future therapeutic strategies. © 2009 UICC     

FOXM1致癌机制及其分子靶向药物

FOXM1是Fox转录因子家族中的一员,通过调节肿瘤相关基因的表达,促进肿瘤发生发展、侵袭、转移及血管生成,但关于FOXM1在肿瘤发生发展中的具体作用机制尚不完全清楚.目前,以FOXM1为靶点的抗癌药物研究处于起步阶段,积极探讨FOXM1致癌机制,研发针对FOXM1及下游信号通路相关基因的靶向药物具有广阔的临床应用前景.     

Pathogenic characterization of 1-methyl-1-nitrosourea-induced mammary carcinomas in the rat

The induction of mammary carcinogenesis in the rat by 1-methyl-1- nitrosourea (MNU) is widely used in experimental breast cancer research. In the experiments reported, the Ha-ras codon 12 (ras12) mutation (GGA-->GAA) was used as a molecular marker to address issues of the clonality of carcinomas induced, pathogenetic independence among multiple carcinomas within the same animal and topographic distribution of mutant ras12 carcinomas in different mammary gland chains. In order to determine whether the frequently observed morphologically distinguishable lobules within carcinomas originate from the coalescence of independent lesions or whether cancerous cells within a carcinoma share a common origin, 44 randomly selected MNU-induced mammary carcinomas were genotyped for two to four lobules each for the ras12 mutation. A total of 43 carcinomas out of 44 (97.7%) had concordant ras12 genotypes among the multiple sites within each tumor, which is consistent with the latter possibility. Next, it was observed that as carcinoma multiplicity increased, the discordance rate of ras12 genotypes among multiple carcinomas within the same animal increased in a manner that was in excellent agreement with the expected discordance rate based on an assumption of no pathogenetic association among carcinomas. Furthermore, a significant difference was observed in the occurrence of mutant ras12 carcinomas between the cervical-thoracic and the abdominal-inguinal mammary glands in that three times as many carcinomas were mutant in the former as in the latter glands, whereas the occurrence of wild-type carcinomas was approximately the same in both regions. Taken together, the data are consistent with (i) carcinomas induced by MNU and detected by palpation are monoclonal in origin, (ii) independently-initiated cells emerge as distinct mammary carcinomas in the same animal, and (iii) the anatomical location of the gland may affect the prevalence of mammary carcinomas that harbor a mutant ras12.