腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子（VEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体，利用贴壁法分离培养MSCs后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率，用免疫组化、Western—Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率，转染效率与病毒感染复制数（multipcyties of infection，MOI）具有量效关系。MOI为150倍时，转染效率〉95％，转染VEGF后，MSCs可有效表达VEGF，9d时达到表达高峰（1125pg／mL），13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs，MSCs是一种理想的基因载体细胞，其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗疾病研究进展

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）是存在于骨髓基质中,具有干细胞特性,能够进行自我更新,有多向分化潜能的一类细胞。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是目前发现的促血管生成作用最强的因子,其具有促进血管生成,改善细胞的生存环境,从而提高细胞的存活率。目前,采用BMSC移植治疗各种疾病,已经取得了很大的疗效,但为了追求进一步的完善,许多学者利用BMSC具有独特的细胞增殖分裂模式,容易导入和表达外源基因,将VEGF基因转染入BMSC来治疗缺血性疾病,     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染骨髓间充质干细胞

 【目的】探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后目的基因表达情况及对MSCs增殖分化的影响。【方法】构建含VEGF基因的腺病毒表达载体,利用贴壁法分离培养MSCs后,用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效果和转染率,用免疫组化、Western-Blot和ELISA方法分别检测VEGF基因转染MSCs后VEGF的表达情况。【结果】腺病毒介导的VEGF基因对于MSCs具有很高的转染效率,转染效率与病毒感染复制数(multiplicyties of infection,MOI)具有量效关系。MOI为150倍时,转染效率>95%,转染VEGF后,MSCs可有效表达VEGF,9d时达到表达高峰(1125pg/mL),13d后仍可检测到VEGF的表达。转染VEGF对MSCs的增殖分化没有明显影响。【结论】腺病毒介导的VEGF基因可以有效的转染MSCs,MSCs是一种理想的基因载体细胞,其携带的VEGF基因可获得较高的表达水平。     

转染hVEGF165基因的骨髓间充质干细胞移植治疗兔心肌梗死

1 材料和方法 1.1 材料 健康纯种新西兰大白兔48只,雌雄不拘,体质量2.0～2.5 kg,兔龄4～5 mo,由岭南科研动物中心提供.低糖DMEM(Gibco产品);Percoll分离液(Pharmacia产品);VIII因子多克隆抗体及免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);BrdU mAb BrdU检测试剂盒(Roche产品);AdTrackCMV-VEGF165真核表达质粒(由广东省人民医院中心实验室惠赠);LipofectamineTM 2000 reagent(GIBCOL).     

骨髓间充质干细胞联合血管内皮生长因子移植治疗糖尿病兔下肢缺血的实验研究

目的 用包裹血管内皮生长因子(VEGF)的纳米球与骨髓间充质干细胞(BMSCs)共同多点肌内注射到糖尿病兔下肢缺血部位,以期使糖尿病兔下肢缺血症状改善,缺血部位形成新的血管。方法 通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化BMSCs。采用超声乳化-溶剂挥发法制备包载VEGF的PLGA纳米球,并检测其各指标。按100mg/kg耳缘静脉注射四氧嘧啶制备糖尿病兔模型,14天后空腹血糖>16mmol/L确定为糖尿病模型。成模的糖尿病兔双侧下肢股动脉结扎制作下肢缺血模型,并分4组在股动脉结扎离断区进行多点注射治疗。PBS组、BMSCs组、VEGF组和BMSCs+VEGF组,同时设正常对照组。主要观察指标:治疗后各组兔子活动情况、大体解剖情况及下肢缺血区血管形成情况。结果 制备的PLGA纳米粒基本呈球形,分散较好,平均粒径为438.97±15.60nm。载VEGF的PLGA纳米粒包封率为87.4%,载药量为43.7μg/g。24h释放率55.48%。共选用28只雌兔制作糖尿病模型,死亡14只,成模12只,2只血糖没达到糖尿病模型标准。死亡率为50%,模型成功率为42.86%,不敏感率7.14%。移植后1个月发现注射PBS组的1只兔子胫骨有一1.0cm×1.5cm的溃疡,行走时呈拖行,另2只呈跛行。注射VEGF组3只兔子均呈跛行。注射MSC组有2只跛行,1只行走正常。注射BMSCs+VEGF组2只行走正常,活动自如,仅1只略呈跛行。从大体解剖结果及切片结果都可以看出移植BMSCs组、VEGF组及BMSCs+VEGF组在结扎股动脉后,可形成侧支循环,使股动脉远端保持充盈,血供良好,尤其是移植BMSCs+VEGF组形成的侧支较多。而PBS治疗组股动脉远端未见充盈,只有回流的股静脉增粗。结论 用包裹VEGF的PLGA纳米球与BMSCs共同多点肌内注射到糖尿病兔下肢缺血部位,对糖尿病兔下肢缺血区血管有促进生成作用,能改善动物模型下肢缺血的症状。     

血管内皮生长因子转染骨髓间充质干细胞心肌移植对心肌梗死后大鼠心功能及血管新生的作用

目的建立重组人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的方法,探讨该细胞心肌移植对缺血性心脏病心功能及血管新生的影响,并比较联合治疗与单独基因或细胞治疗的疗效差异。方法采用密度梯度离心-贴壁培养法获取Wistar近交系大鼠MSC,用脂质体将pcDNA3.1-hVEGF165转入该细胞,通过ELISA、RT—PCR和Western印迹检测后者VEGF的表达情况;以Wistar近交系大鼠建立心肌缺血模型,随机分成4组(每组12只),心肌梗死模型建立2周后,联合组在心肌梗死区移植转染VEGF165基因的MSC,细胞组移植等量的MSC,基因组注射脂质体-pcDNA3.1-VEGF165DNA复合物,对照组注射等容积培养液;另取12只未结扎冠脉的大鼠为假手术组。细胞移植4周后,用Buxco系统检测心功能;然后处死动物,取心肌标本,测量心肌梗死面积;用5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)、肌钙蛋白T免疫组化双染法确定移植细胞的存活与分化;用Ⅷ因子染色法检测血管新生,RT-PCR法检测VEGF165基因的体内表达情况。结果(1)pcDNA3.1-hVEGF165基因通过脂质体转染大鼠MSC后获稳定表达;(2)移植4周后,联合组心肌梗死面积(27．8％±3．0％)明显低于细胞组(37．0％±10．1％)与基因组(37．1％±5．2％,均P<0．05),心功能改善优于细胞组与基因组;(3)联合组心肌梗死区毛细血管密度(每视野40．2个±5．5个)高于细胞组(27．2个±6．3个,P<0．01)和对照组(18．5个±5．8个,P<0．01),较基因组(35．8个±7．7个)亦有增加的趋势(P=0．189);(4)Brdu、肌钙蛋白T双染示各治疗组心肌梗死区心肌细胞数量不同程度的多于对照组;(5)联合组VEGF基因的体内表达(hVEGFmRNA相对含量0．18±0．04)高于基因组(0．10±0．03,P<0．01)。结论转染VEGF基因的MSC移植可使鼠冠脉结扎造成的心肌梗死面积缩小、心功能明显改善,其疗效优于单独应用基因或细胞治疗,为缺血性心脏病的细胞基因联合治疗提供了理论依据。     

重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达及其影响

目的观察重组腺病毒介导血管内皮生长因子基因(AdVEGF165)转染后大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中血管内皮生长因子的表达情况以及腺病毒载体对大鼠骨髓间充质干细胞的生长影响情况。方法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,用腺病毒载体转染BMSCs。采用ELISA法检测血管内皮生长子因子(VEGF)的表达和分泌。转染后用胰酶消化传代培养,MTT法绘制细胞生长曲线。结果AdVEGF165转染组上清液中VEGF蛋白表达量极显著高于空白对照组(P<0.01)。且AdVEGF165转染BMSCs后,生长曲线与正常培养细胞无显著差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体能够在BMSCs中介导VEGF的表达,且对BMSCs生长无影响。     

血管内皮生长因子与转化生长因子的协同作用诱导兔骨髓间充质干细胞分化

目的 研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的协同作用对兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及其可能机制.方法 将细胞分为4组:对照组、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)-VEGF组、AAV-TGF-β1组和VEGF+ TGF-β1组.穿刺法抽取兔骨髓液,分离培养原代BMSCs,分别构建AAV-VEGF和AAV-TGF-β1腺病毒载体转染BMSCs,Western blot检测各组细胞中VEGF、TGF-β1的蛋白表达.流式细胞术检测细胞凋亡情况,CCK8法检测细胞增殖能力,Western blot检测髓核细胞标志SOX-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达,以及P38MAPK信号通路相关蛋白P38、MAPKAPK2和HSP27的表达.加入P38MAPK的特异阻滞剂SB203580预处理BMSCs,检测VEGF和TGF-β1对BMSCs增殖、凋亡、分化及相关蛋白表达的影响.结果 VEGF和TGF-β1可通过调节P38MAPK信号通路抑制BMSCs凋亡,促进BMSCs增殖,并向类髓核细胞分化,且在其协同作用下效果显著.抑制P38MAPK信号通路可反转VEGF和TGF-β1对BMSCs增殖分化能力的促进作用.结论 VEGF和TGF-β1的协同作用能增强BMSCs增殖和分化的能力,提高胶原蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质的表达,从而促进退变椎间盘的修复和再生.     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对慢性肾衰竭大鼠血管新生的影响

目的：探讨血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor , VEGF）基因转染骨髓间充质干细胞（ mesenchy-mal stem cells,MSCs）对慢性肾衰竭（chronic renal failure, CRF）大鼠肾小球内皮细胞修复和血管新生的影响。方法体外分离、培养大鼠MSCs,Ad5-hVEGF-EGFP转染MSCs并观察转染对细胞增殖,分泌VEGF的影响。50只雄性SD大鼠按数字表法随机分为假手术组、慢性肾衰竭组、MSCs移植组、Ad-VEGF注射组和VEGF基因转染的MSCs移植组,每组10只。采用分阶段5／6肾切除术制备大鼠慢性肾衰竭动物模型。假手术组与慢性肾衰竭组于切除右肾之前从该侧肾动脉注射不含血清的改良杜氏伊格尔（DMEM）培养液,其余3组分别给予MSCs,Ad-VEGF和VEGF基因转染的MSCs。8周后检测各组大鼠肾功能,并用免疫组化检测肾小球CD31表达情况。结果 Ad5-hVEGF-EGFP转染后对MSCs细胞增殖无影响,转染后分泌VEGF蛋白较空质粒转染组明显增加（P＜0.05）。 MSCs移植组和VEGF基因转染的MSCs移植组血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）均较慢性肾衰竭组降低（P＜0．05）;与MSCs移植组比较,VEGF基因转染的MSCs移植组Scr和BUN降低更显著（P＜0．05）。慢性肾衰竭组肾小球中CD31表达较假手术组显著降低（P＜0．05）,应用MSCs和VEGF165基因转染的MSCs干预后肾小球中CD31表达有所增加,VEGF基因转染的MSCs组增加更明显（P＜0．05）。结论慢性肾衰竭大鼠给予转染VEGF基因的MSCs移植后毛细血管内皮细胞数量增多,肾脏功能改善;其作用可能与基因转染增加VEGF表达及有利于肾小球毛细血管内皮修复、血管新生有关。     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：建立人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的方法。方法：采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,测定其生长曲线和表面标志CD34,CD44,CD45及SH3,检测其向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化潜能后;用脂质体介导法将pcDNA3.1-hVEGF165导入MSCs,观察转染后细胞形态和生长状况,通过RT-PCR,Western blot和ELISA鉴定VEGF在MSCs中的表达情况。结果：大鼠MSCs经检测为CD44和SH3阳性,CD45和CD34阴性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;经RT-PCR,Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF。转染至大鼠MSCs,并获得有效的表达。结论：真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165在MSCs中获有效表达。     

血管内皮生长因子基因转染的骨髓间充质干细胞移植对大鼠肺动脉高压的治疗作用

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因转染的骨髓间充质干细胞(MMSC)移植治疗肺动脉高压(PH)的疗效和机制.方法 体外分离培养SD大鼠MMSC,将含有增强型绿色荧光蛋白的VEGF质粒转进MMSC.将SD大鼠随机分为4组:正常对照组、PH模型组;MMSC移植组,转基因移植组.一次性项背部皮下注射野百合碱(50 mg/kg),复制PH模型,观察21 d后,MMSC移植组及转基因移植组分别给予浓度为5×106个细胞/ml和5×105个细胞/ml的MMSC悬液1 ml静脉注射,模型组及正常组均给予等量L-DMEM液注射.移植后30 d,观察4组大鼠一般情况、生存率、右心室收缩压(RVSP)、右心室肥大指数(RVH)、血气及肺小动脉的微观结构变化.结果 移植后30 d,MMSC移植组及转基因移植组大鼠的RVSP分别为(30.2 ±2.1)和(29.2±1.1)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),RVH分别为(37.9 ±3.2)%和(27.2±3.4)%,肺小动脉中膜厚度(MT)分别为(21.3±3.4)和(14.3±2.8)μm,肺小动脉管腔横截面积与血管总横截面积的比值(V/T)分别为(39.3 ±4.3)%和(43.0 ±1.5)%.上述指标与PH模型组相比差异均有统计学意义(P<0.01);其中MMSC移植组与转基因移植组间RVH、MT及V/T的差异有统计学意义(P<0.05).另外,MMSC移植组与转基因移植组动脉血气各指标较PH模型组均明显改善(P<0.05).同时观察到肺内损伤血管修复和血管新牛现象.结论 转染有VEGF165基因的MMSC移植可有效减轻并逆转野百合碱诱导的PH进程,此作用较单纯移植MMSC的治疗效果更加明显.其作用机制可能与血管修复及血管新生有关.     

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑组织辐射损伤

目的 研究间充质干细胞(MSCs)对脑组织辐射损伤的修复作用,为治疗放射性脑损伤奠定理论基础.方法 选取24只雄性SD大鼠随机分为3组,即对照组、模型组和治疗组.模型组和治疗组大鼠均接受直线加速器产生的X线行一次性全脑照射20 Gy;正常对照组不接受照射.其中治疗组大鼠接受辐射24 h、7 d、14 d、21 d后尾静脉注射MSCs 3×106/只;模型组和正常对照组大鼠尾静脉注射同体积生理盐水1 mL.28 d后处死所有大鼠,检测血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用苏木精-伊红染色法 (HE染色法)制作大鼠的脑组织病理切片观察辐射对脑组织形态学的影响.结果 模型组大鼠精神较差,反应迟钝,少动,毛发粗糙、变黄,眼睑分泌物增多,睁眼困难;治疗组大鼠精神好,毛发微黄,眼睑有少量分泌物.治疗组大鼠血清SOD明显高于模型组,而MDA水平低于模型组.病理结果显示模型组大脑皮质变薄,神经元细胞聚集排列,数目显著减少,可见核固缩、深染;尼氏小体融解消失,呈凋亡状态;治疗组大脑皮质较模型组明显增厚,海马神经元细胞增多,仍可见凋亡状态的尼氏小体,细胞染色较淡,损伤的细胞数目明显减少,损伤程度减轻.结论 MSCs能够使神经细胞再生,修复脑组织的辐射损伤.     

VEGF基因真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的探讨经腺病毒表达载体转染血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)体内外基因表达的特点。方法构建VEGF基因腺病毒表达载体,将VEGF165基因转染到MSCs中。用RT-PCR法检测转基因MSCs中基因表达情况。结果转基因MSCs及其分化的子代细胞均有VEGF165的表达,并持续2周左右时间。结论经腺病毒表达载体转染VEGF165基因的MSCs在体内外均有良好的基因表达。     

血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

同期输注供者骨髓间充质干细胞对肝移植大鼠免疫的影响

目的 探讨肝移植同时输注供者骨髓间充质干细胞对受体肝移植免疫的影响.方法 实验分为空白对照组(A组)、移植组(B组)和输注供者骨髓间充质干细胞组(C组).A组SD大鼠5只,只行剖腹探查,B,C组Wistar和SD大鼠各10只.行Wistar-SD大鼠肝移植同时,C组提取供体骨髓间质干细胞同期输注给受者,B组给予输注生理盐水.观察术后第7天肝功能的变化、病理改变和受体生存期.结果 肝移植同时输注供者骨髓间充质干细胞,ALT,AST,TBIL,ALB较B组显著降低,生存期明显延长,病理改变仅呈急性轻度排斥反应,而单纯移植组呈急性重度排斥反应.结论 肝移植同时输注骨髓间充质干细胞促进受体对移植肝的免疫耐受.     

Autologous serum can induce mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells

Objective： To investigate whether the rabbit serum after radiofrequency ablation to liver tumor can induce mesenchymal stem cells （MSCs） differentiating into hepatocyte-like cells in order to find a new source and culture process for repairing liver injury. Methods： A tumor piece of 1 mm× 1mm×1 mm was transplanted into a tunnel at right liver of rabbits. The model of liver tumor was established after 2-3 weeks. The serum was collected from rabbits 72 h after being subjected to radiofrequency ablation of the liver tumor. Mesenchymal stem cells were isolated from rabbit bone marrow and cultured in DMEM containing autologous rabbit serum. Three kinds of media （L-DMEM） were tested respectively： ① containing 10% fetal calf serum （FCS）; ② containing 30% rabbit autologous serum after radiofrequency ablation of the liver tumor （ASRF）; ③ containing 30% rabbit autologous serum （AS）. MSCs were cultured on 12-well plates until passage 2 and examined under the light and electron microscopy at indicted intervals. The expression of albumin and CKl8 was detected using immunofluorescence to identify the characteristics of differentiated cells. Results： MSCs performed differently in the presence of fetal calf serum, rabbit autologous serum and rabbit autologous serum after radiofrequency ablation of the liver tumor. Induced by the serum after radiofrequency ablation to liver tumor for 7 d, the spindle-shaped MSCs turned into round shaped and resembled hepatocyte-like cells. The reactions were not found in MSCs cultured in FCS and AS groups. After induction for 14 d, slender microvilli, cell-cell junction structure and cholangiole emerged, and the differentiated cells expressed albumin and CKl 8. All those could not been observed in 10% FCS and 30% autologous serum groups. Conclusion： Mesenchymal stem cells differentiate into hepatocyte-like cells in the serum after radiofrequency ablation of liver tumor, providing us a potential cell source and culture process for clinical application in liver     

慢病毒载体介导hHGF基因在大鼠真皮间充质干细胞的表达

目的探讨慢病毒载体（LVs）介导人肝细胞生长因子（hHGF）基因在大鼠真皮间充质干细胞（rdMSCs）的表达,以及hHGF基因修饰对rdMSCs增殖的影响。方法体外分离培养rdMSCs,hHGF—GFP—LV以不同感染复数（MOI）转染rdMSCs,荧光显微镜和流式细胞仪检测GFP阳性细胞比例;ELISA法测定感染后细胞上清hHGF水平;采用台盼蓝拒染法对hHGF基因修饰rdMSCs和rdMSCs进行细胞计数,绘制细胞生长曲线分析细胞的活力。结果rdMSCs是贴壁细胞,表达CD44和CD90,不表达CD34和CD45表面分子,可向脂肪细胞分化;MOI为100时,rdMScs能达到80％以上的感染效率;hHGF基因修饰rdMSCs细胞上清的hHGF水平高于阴性对照组（P〈0．05）。P4、P6和P8细胞的培养上清hHGF水平的差异无统计学意义（P〉0．05）;hHGF基因修饰rdMSCs有较强的增殖能力。其细胞生长曲线与rdMSCs相似。结论LVs可以介导hHGF基因在rdMSCs稳定表达,且不影响细胞的增殖活力。     

人VEGF基因腺病毒表达载体修饰大鼠骨髓间充质干细胞

目的 探讨含人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因腺病毒表达载体Ad-VEGF转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的可行性.方法 采用贴壁培养筛选法富集大鼠BM-MSCs.将HEK293细胞中扩增并经效价分析后的Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,通过对细胞转染效率、生长和活力的观察分析,以确定理想的感染复数(MOI)值.结果 本实验经HEK293细胞扩增制备的Ad-VEGF的病毒效价达8×108 pfu/ml;当MOI值为50时,Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs效率可达最高值53％;而MOI值高于50时,Ad-VEGF转染对BM-MSCs活性抑制明显.结论 成功实现Ad-VEGF转染大鼠BM-MSCs,其最适MOI值为50.     

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

目的 体外诱导兔骨髓间充质干细胞向肌源性细胞分化,并观察血管内皮生长因子AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)后的表达。方法 将20只兔随机分为对照组和实验组,从骨髓液中分离MSCs,对照组以低糖DMEM培养,实验组加用5-氮胞苷(10 mmol/L)诱导培养,第28天进行肌钙蛋白I免疫组化染色。另构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒,通过脂质体转染对照组MSCs,用Northern blotting和Western blotting鉴定血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并用ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度。结果 成功分离培养出兔MSCs,实验组经5-氮胞苷诱导后MSCs向肌源性细胞分化,肌钙蛋白I免疫组化染色阳性。成功构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒并通过脂质体转染MSCs,Northern blotting示转染的MSCs VEGF165表达信号明显强于未转染细胞,Western blotting 示转染VEGF165基因的MSC表达VEGF,ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度在转染后第3天(1 011 pg/ml)和第5天(1 027 pg/ml)达高峰,此后逐渐下降,但至第13天(349 pg/ml)仍显著高于空白对照(116 pg/ml)和pAdTrackCMV组(125 pg/ml),P<0.01。结论 兔骨髓间充质干细胞可在体外向肌源性细胞分化,转染VEGF基因可表达VEGF,有望将干细胞移植和基因治疗结合以治疗缺血性心脏病。