舍格伦综合征A抗原（SSA60）在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达及胶体金快速检测方法的建立

目的 在巴斯德毕赤酵母中表达舍格伦综舍征A抗原(SSA60)并建立肢体金快速检测方法.方法 表达质粒pPIC9k-SSA60用电穿孔法转化酵母菌SMDI168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和斑点免疫金渗滤法(DIGFA)鉴定.结果 表达产物SSA60的分子量约60 000,高拷贝巴斯德毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的,表达量占分泌总蛋白60%以上,产物浓度为600～950 mg/L.DIGFA检测85份舍格伦综合征(SS)患者血清和30份正常人血清,抗SSA检测阳性率为95.3%(81/85),特异度为100%(30/30).与德国欧蒙ENA酶斑点法对比检测的符合率为96.5%(111/115),差异无统计学意义(P>0.05).结论 SSA60在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达,DIGFA简便、快速、准确,可用于临床自身免疫病的诊断.     

乙型肝炎病毒合成e基因在毕赤酵母中的表达及产物免疫学特性

目的 合成适合酵母表达的乙型肝炎病毒（HBV）e抗原基因，在毕赤酵母中表达出高免疫反应性和特异性的重组乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）。方法 采取基因搭桥法及Taq酶聚合反应，选用酵母菌偏爱的同义密码子替换野生型e基因的部分密码子，制备合成e基因，插入pPICZαA酵母菌表达载体。携带有合成e基因的pPICZαA转化毕赤酵母菌株GS115，经甲醇诱导表达HBeAg。结果 酶切电泳及DNA测序证实合成的e基因已正确克隆到表达载体中；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）、immunoblt及ELISA显示HBeAg在毕赤酵母中高效分泌表达，表达量约为63mg／L，培养上清液ELISA测定效价1：81920，最大吸光度值达2．8；重组HBeAg与乙型肝炎病毒核心抗体间无交叉反应。结论 毕赤酵母表达系统高效分泌表达出与乙型肝炎病毒核心抗原间无交叉抗原性、具有良好免疫反应性的HBeAg。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统可使用强效的醇氧化酶1(AOX1)启动子，在甲醇诱导下实现外源基因的高效表达。外源基因整合入酵母的染色体基因组后，通过营养缺陷型基因或抗性基因进行阳性转化子的筛选。将外源基因阅读框架与信号肽相融合即可得到被修饰的分泌型外源目的蛋白。现已有多种方法可进一步提高外源目的蛋白的表达量。     

人CyclinD1在毕赤酵母中的表达

目的 克隆人肝癌组织中的Cyclin D1基因,并在毕赤酵母中表达Cyclin D1蛋白。方法 从人肝癌组织中提取RNA,逆转录PCR扩增获得Cyclin D1 cDNA,将PCR产物进行TA克隆和DNA序列分析; 阳性TA克隆Cyclin D1片段再亚克隆入毕赤酵母表达载体Ppic9k,甲醇诱导表达。结果 逆转录PCR扩增得到约483 bp的DNA片段,TA克隆和DNA序列分析结果显示重组片段为人的CyclinD1基因,Cyclin D1 cDNA亚克隆入Ppic9k载体的NotI和EcoRI位点之间; 甲醇诱导得到分子量约36KD的蛋白。结论 成功克隆人肝癌组织中的Cyclin D1基因,并且在毕赤酵母中成功表达。     

人干燥综合征抗原A毕赤酵母分泌型表达载体的构建

目的:构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的毕赤酵母分泌型表达载体.方法:以人白血病淋巴细胞HL-60株cDNA为模板,RCR扩增目的基因SSA,纯化,双酶切,DNA浓缩回收,插入酵母分泌型表达载体pPIC9k,热冲击法转化感受态大肠杆菌JM109,阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序.结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确.结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为下一步取代从动物胸腺中人工提取低纯度、低产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒打下基础.     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测

目的用PCR技术特异扩增人溶菌酶基因hLYz cDNA序列,克隆至质粒pMD18一T中,获得重组质粒pMD18-T-hLYZ。方法采用EcoRⅠ／NotⅠ双酶切及PCR确认正确后,将人溶菌酶基因cDNA目的片段亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k中,通过电穿孔法转化毕赤酵母菌GS115,获得重组质粒pPIC9k-hLYZ,采用EcoRⅠ／NotⅠ双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确,在毕赤酵母菌中诱导表达产物经SDS-PAGE电泳分析,结果表明表达产物与预期大小的hLYZ蛋白分子量一致,采用微球菌溶解法进行抑菌活性测定。结论证实具有明显的抑菌作用。     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种优秀的重组蛋白表达系统,近年来被广泛应用于重组蛋白的表达。现就巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及其用于外源蛋白表达的基本策略作一综述。     

重组人α1-微球蛋白在毕赤酵母中的高效分泌性表达

目的 获得可溶、稳定、高纯度的α1-微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG),为临床检测标准品、质控品制备奠定基础.方法 制备构建重组人毕赤酵母真核分泌表达质粒,并对重组α1-MG进行诱导表达、纯化和鉴定.应用PCR方法扩增重组人α1-MG pET-15b质粒,得到N端带有6个组氨酸"标签"(6 × His-tag)的α1-MG融合基因,将该基因插入到真核酵母分泌表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组分泌表达质粒pPIC9-MG、并转化毕赤酵母菌菌株GS115(Pichia pastoris GS115);用甲醇进行重组人α1-MG的诱导表达,摇瓶发酵,上清α1-MG含量测定;目的蛋白采用硫酸铵沉淀、一步亲和层析纯化并通过免疫学含量测定、PAGE电泳、Western blot以及生物质谱进行鉴定;初步进行稳定性观察.结果 成功构建了重组人α1-MG真核酵母表达载体,核酸测序与预测一致,并在毕赤酵母中实现了重组人α1-MG的分泌性表达,表达量可达73 mg/L,约占总蛋白的30%.经纯化及鉴定,得到了可溶性的、具有天然蛋白生物学活性的PAGE纯目的蛋白.结论 首次在毕赤酵母中实现重组人α1-MG的高效分泌性表达,表达目的蛋白具有良好的生物学活性、稳定性好、易纯化等优点.     

重组人α_1-微球蛋白在毕赤酵母中的高效分泌性表达

目的获得可溶、稳定、高纯度的α1-微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG),为临床检测标准品、质控品制备奠定基础。方法制备构建重组人毕赤酵母真核分泌表达质粒,并对重组α1-MG进行诱导表达、纯化和鉴定。应用PCR方法扩增重组人α1-MG pET-15b质粒,得到N端带有6个组氨酸“标签”(6×His-tag)的α1-MG融合基因,将该基因插入到真核酵母分泌表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组分泌表达质粒pPIC9-MG、并转化毕赤酵母菌菌株GS115(Pichia pastoris GS115);用甲醇进行重组人α1-MG的诱导表达,摇瓶发酵,上清α1-MG含量测定;目的蛋白采用硫酸铵沉淀、一步亲和层析纯化并通过免疫学含量测定、PAGE电泳、Western blot以及生物质谱进行鉴定;初步进行稳定性观察。结果成功构建了重组人α1-MG真核酵母表达载体,核酸测序与预测一致,并在毕赤酵母中实现了重组人α1-MG的分泌性表达,表达量可达73 mg／L,约占总蛋白的30％。经纯化及鉴定,得到了可溶性的、具有天然蛋白生物学活性的PAGE纯目的蛋白。结论首次在毕赤酵母中实现重组人α1-MG的高效分泌性表达,表达目的蛋白具有良好的生物学活性、稳定性好、易纯化等优点。     

重组人源甲胎蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化

目的：从毕赤酵母GS115蛋白表达体系入手,实现人源甲胎蛋白（AFP）的重组克隆、异源高效表达、蛋白纯化并得到具有临床免疫原性的高纯度AFP。方法通过聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pReceiver‐AFP扩增到目的基因片段,构建酵母重组表达质pPICZαA‐AFP,经测序比对与GenBank公开的AFP序列一致。将重组质粒pPICZαA‐AFP转入毕赤酵母GS115,通过甲醇诱导表达目的蛋白AFP。收集蛋白后用硫酸铵分级沉淀法对AFP进行纯化,高效液相色谱法（HPLC）检测纯度,在临床医院通过电化学发光法对其蛋白含量定值。结果研究发现AFP在酵母GS115中经甲醇诱导表达主要分泌到胞外培养基上清,免疫印迹试验能够检测到AFP蛋白条带,经硫酸铵分级沉淀,87％AFP目的蛋白存在于55％硫酸铵沉淀集份,HPLC检测其纯度为98．844％,电化学发光法检测其水平为3473ng／mL。最后与临床肝癌患者血清标本比对,蛋白的相对分子质量大小一致,表明其糖基化水平与临床标本相当。结论通过毕赤酵母甲醇诱导表达系统可以制备高纯度的、具有生物活性的、可用于肿瘤临床检测的AFP标准物质及其可以溯源的校准品、质控品和相关诊断试剂。     

人LYVE-1的基因克隆及其在毕赤甲醇酵母细胞中的表达鉴定

目的获得可溶、稳定、与人淋巴管内皮特异性透明质酸受体(LYVE-1)具备相同抗原性的重组人LYVE-1,为进一步研究LYVE-1在淋巴管形成中的作用及临床肿瘤免疫学诊断打下基础、提供材料。方法采用逆转录-酶链聚合反应(RT-PCR)自人淋巴结获得LYVE-1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPICZα,构建含人LYVE-1的重组质粒(pPICZα-LYVE-1);经全自动序列分析仪测序确证后,将此重组质粒转化入毕赤甲醇酵母细胞(GS115)中进行诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析及免疫印迹试验(Western blot)鉴定。结果经甲醇诱导的含pPICZα-LYVE-1的酵母细胞表达出重组人LYVE-1的融合蛋白,此蛋白在凝胶上表现为一约70 000的区带,在Western blot实验中可被LYVE-1的特异多克隆抗体识别。结论人LYVE-1融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达,并具有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

人LYVE-1的基因克隆及其在毕赤甲醇酵母细胞中的表达鉴定

目的获得可溶、稳定、与人淋巴管内皮特异性透明质酸受体（LYVE-1）具备相同抗原性的重组人LYVE-1,为进一步研究LYVE-1在淋巴管形成中的作用及临床肿瘤免疫学诊断打下基础、提供材料。方法采用逆转录-酶链聚合反应（RT-PCR）自人淋巴结获得LYVE-1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPICZα,构建含人LYVE-1的重组质粒（pPICZα-LYVE-1）;经全自动序列分析仪测序确证后,将此重组质粒转化入毕赤甲醇酵母细胞（GS115）中进行诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析及免疫印迹试验（Western blot）鉴定。结果经甲醇诱导的含pPICZα-LYVE-1的酵母细胞表达出重组人LYVE-1的融合蛋白,此蛋白在凝胶上表现为一约70000的区带,在Western blot实验中可被LYVE-1的特异多克隆抗体识别。结论人LYVE-1融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达,并具有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶的基因克隆和原核表达研究

目的研究建立用克隆、表达和鉴定人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶（HARS，亦称Jo-1抗原）检测多发性肌炎／皮肌炎（PM／DM）自身免疫抗体的方法。方法用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）从HL-60细胞株中克隆人自身抗原Jo-1全长基因，将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序，再定向克隆至pGEX-5T载体中，并转入大肠杆菌BL-21；阳性克隆鉴定后在异丙基．β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达，然后对其产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（IBT）检测。结果PCR产物约1500bp，与预期1526bp接近，测序结果与基因库核酸完全一致。pGEX-5T-Jo-1重组阳性克隆酶切鉴定正确，SDS-PAGE和IBT结果显示，融合蛋白分子量75000，具有天然人自身抗原Jo-1的免疫原性。结论成功克隆表达人自身抗原Jo-1，为建立PM／DM自身免疫抗体检测方法奠定了基础。     

重组人胱蛋白酶抑制剂C在毕氏酵母菌中的高效表达

目的：构建人胱蛋白酶抑制剂C（Cystatin C)的表达载体并进行蛋白的初步纯化。方法：用逆转录聚合酶链反应从人胎盘组织中扩增含有380bp的Cystatin C cDNA基因片段，并将其插入到pPIC9质粒中，携带有Cystatin C片段的pPIC9质粒转化毕氏酵母菌菌株GS115，醇氧化脱氢酶1（AOX1）启动子被甲醇诱导而产生可溶性Cystatin C.重组Cystatin C采用Hitrap-SP阳离子交换柱进行初步纯化。结果：核酸序列测定与预期一致。Cystatin C 表达水平达到16mg/L，约占菌体总可溶性蛋白的60％，蛋白纯化回收率为40．5％，Cystatin C在表达体系中至少可稳定3d，结论：Cystatin C在毕氏酵母力胞外有较高水平的分泌，既可作为抗原免疫动物获取抗体，也可作为测定的标准品，为今后进行国产Cystatin C免疫学测定剂研制奠定了基础。     

细胞核抗原Sm B'的基因克隆和原核表达

目的 为建立抗Sm自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定细胞核抗原Sm B’。方法 应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从HL-60细胞株中克隆Sm B’全长基因,将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达,产物行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（western blot）鉴定。结果PCR产物约为700 bp,与预期657 bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-ST-Sm B’重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS—PAGE和western blot结果显示融合蛋白分子量为51 000,具有与抗Sm B’抗体的反应性。结论成功克隆表达核抗原Sm B’,为建立抗Sm自身抗体检测方法奠定了基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因克隆表达及临床应用

目的 获得重组表达的人幽门螺杆菌（Hp)尿素酶B亚单位蛋白（UreB),并将其运用于Hp感染的临床检测。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术从临床分离的Hp菌株基因组中扩增出编码UreB的基因（ureB),将其克隆于质粒PinPoint^TMXa-Ⅲ上进行序列分析和蛋白表达,通过亲和层析得到纯化的重组UreB蛋白并用于113例消化性溃疡患者Hp感染的酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测。结果 克隆的ureB基因核苷酸序列与GenBank公布的序列相比较,同源性为96.44%,推定氨基酸序列同源性为99.65%。纯化的重组UreB蛋白相对分子量约为66000,纯度为90%以上,并保持较好的免疫原性。应用纯化的重组UreB蛋白联合ELISA法检测113例消化性溃疡患者Hp感染的灵敏度和特异性分别为92.0%、98.5%。结论 重组UreB蛋白作为抗原用于ELISA法检测Hp感染,保持了较高的灵敏度和特异性,可用于Hp感染的临床检测与诊断、疗效判定及流行病学研究。     

Stathmin基因毕赤酵母表达体系的构建及鉴定

目的构建Stathmin基因毕赤酵母表达体系,并对表达产物进行纯化和鉴定,为Stathmin相互作用蛋白的进一步研究提供实验基础。方法通过PCR方法从SKBR3乳腺癌细胞中扩增出人Stathmin基因片段,克隆入毕赤酵母表达载体pPIC3.5K,构建重组载体pPIC3.5K-Stathmin,转化GS115工程菌,经含基因素(G418)的酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基筛选出阳性克隆。用0.5%甲醇诱导表达,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western Blotting鉴定表达产物。结果 DNA测序结果表明,所获基因片段与Stathmin基因序列一致。在含有G418 600μg/mL的YPD培养基上筛选出的pPIC3.5K-Stathmin转化子,经PCR鉴定为阳性克隆。SDS-PAGE可见约37×103处有目的条带表达,经Western Blotting鉴定,此条带为Stathmin蛋白。结论成功构建了Stathmin酵母表达载体,并在毕赤酵母中表达成功,为Stathmin相互作用蛋白研究以及生物治疗药物的制备奠定了基础。