重组腺相关病毒-阳离子脂质体载体的构建及评价

目的探讨重组腺病毒相关病毒（rAAV）-阳离子脂质体（LyoVec）复合载体的构建方法及其转染率评价。方法构建rAAv～GFP，rAAv—LyoVec复合载体及rAAV—GFP—LyoVec。倒置荧光显微镜观察，测定rAAV—GFP，LyoVec—GFP及rAAV—GFP-LyroVec对定量C6细胞的转染率，筛选出高转染率载体。结果rAAV—GFP组24、48、72和96h转染率分别为16％、23％、21％和9％；LyoVec-GFP组为28．5％、33％、32％和11％；rAAV—GFP—Lyovec组为49％、59％、64％和20％。rAAV-GFP—LyoVec纽分别在24、48、72和96h的转染率显著高于rAAV—GFP组（P〈0．01）及LyoVec—GFP组（P〈0．01）。结论新构建rAAV—LyoVec复合载体基因的转染效率远远高于rAAV或LyoVec独立转染。     

rAAV2载体介导G卯基因转染树突状细胞

目的：在诱导人骨髓CD34^＋细胞分化成树突状细胞（dendritic cells，DCs）的基础上，探讨2型重组腺相关病毒（Type 2 recombinant adeno-associated virus，rAAV2）载体介导绿色荧光蛋白（green fluo-rescent protein，GFP）基因转染DCs的条件。方法：采用免疫磁珠法分离纯化人骨髓来源的CD34^＋细胞。在含有IL-4和GM-CSF的培养体系中体外诱导CD34^＋细胞生成DCs，于第5天加入TNF-α诱导DCs成熟，在不同时间用rAAV2载体介导GFP基因转染未成熟和成熟的DCs。通过电子显微镜和流式细胞仪鉴定树突状细胞，荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达。结果：人骨髓CD34^＋细胞经诱导分化后，在光镜及透射电镜下均可观察到DCs的形态特征，流式细胞仪检测到DCs表型；荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞培养第3天、第5天和加入TNF-α后的rAAV2-GFP转染率分别为0．45％，13．54％和0．25％。结论：本实验中所采用的培养体系可成功将人骨髓CD34^＋细胞诱导分化成DCs，rAAV2／GFP转染DCs效率随细胞诱导分化时间的延长而增高，且转染未成熟DCs的效率高于转染成熟DCs。     

两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的 比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性.方法 采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI) 1×10~3、1×10~4、1×10~5、5×10~5分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性.结果 分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×10~5时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%.细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小.结论 两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体.     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭及转移中的作用

目的探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在乳腺癌细胞（231）侵袭、转移过程所起的作用。方法构建GRP78真核反义表达载体，转染入231细胞，利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况；并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞；反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论GRP78是乳腺癌的一个促癌基因，下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究

目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90％(MOI=5×103),58.56％(MOI=5×104),68.31％(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.     

腺病毒介导的eNOS基因转移时血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因转染血管平滑肌细胞（VSMC）的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC，应用聚合酶（PCR），逆转录PCR（RT－PCR）技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率；应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果：外源性eNOS基因成功导入了VSMC；VSMC中有eNOS基因mRNA的表达；外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后，可显著抑制VSMC的生长，DNA合成减少。结论：腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC，并可有抑制细胞生长。     

2型重组腺相关病毒介导的β-地中海贫血基因治疗实验

目的 探讨2型重组腺相关病毒（rAAV2）能否有效转染重型β-地中海贫血患者造血细胞,通过体外途径基因治疗地中海贫血。方法 6只BALB/c裸小鼠分为转染组（n=4）和未转染组（n=2）,经X射线照射后,分别移植入经rAAV2 β-珠蛋白病毒转染（MOI=50）或未转染的β41-42/β654杂合子型重型β-地中海贫血流产胎儿造血细胞,转染后第28天和第70天分别处死rAAV2转染小鼠（n=2）和未转染受体小鼠（n=1）。采用 RT-PCR、等位基因特异性PCR（ASPCR）法检测rAAV2介导的人β-珠蛋白基因在小鼠骨髓中的表达,并以高压液相色谱法量化分析受体小鼠外周血中人β-珠蛋白肽链的水平。结果 ①RT-PCR于所有受体小鼠样本中均可检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达。②ASPCR检测中,β41-42突变基因稳定表达于所有受体小鼠,β654突变基因仅在移植后第70天受体小鼠样本中被检测到;移植后第28天,rAAV2转染及未转染小鼠体内均可检测到主要来自于β654突变基因的正常β-珠蛋白基因表达;但至移植后第70天,仅rAAV2转染小鼠骨髓样本中仍可检测到rAAV2-β-globin载体介导的正常β-珠蛋白基因表达。③移植后第70天处死的转染小鼠外周血中人β链/α链分别为0.328和0.325,相对未转染组0.135的比值,两者的增加百分比高达144.78%和142.54%。结论 经rAAV2介导基因修饰后的重型β-地中海贫血患者造血细胞在体内可长期稳定表达正常人β-珠蛋白基因,而其分化产生的外周血人红系细胞内β-珠蛋白肽链的合成增加。     

重组腺相关病毒载体在心血管疾病基因治疗中的应用

腺相关病毒体是一种有DNA缺陷的非致病性细小病毒,重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,具有安全性好、宿主范围广等优点.rAAV已成为基因治疗研究的热点,特别是在心血管疾病机制探讨和治疗研究中应用广泛.在过去几十年里,rAAV在高血压、心力衰竭、动脉硬化和心肌梗死等心血管疾病基因治疗中成果显著.     

人端粒酶逆转录酶单位启动子和存活因子启动子在肿瘤靶向性基因治疗中的作用

目的 通过体内外研究人端粒酶逆转录酶单位(hTERT)启动子和存活因子启动子在实现肿瘤基因治疗靶向性中的作用并探讨其应用前景.方法 PCR方法扩增hTERT启动子片段和存活因子启动子片段,并构建包含重组可溶性肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)的重组腺相关病毒载体.体外转染四株肝细胞癌细胞株及人原代正常肝细胞(PHH),通过EGFP表达及MTT检测启动子活性.体内建立SMMC-7721皮下移植瘤模型,观察瘤内注射rAAV病毒对肿瘤生长的影响.结果 两启动子驱动的外源基因表达具有肿瘤细胞特异性,且它们驱动的TRAIL表达能降低HCC的存活率,而不能降低PHH存活率.以rAAV为载体,hTERT启动子驱动的TRAIL能显著抑制皮下肿瘤生长.结论 肿瘤特异启动子是实现以rAAV为载体的肿瘤靶向基因治疗的潜在手段.     

氧相关HRE启动子控制下表达hVEGF165基因重组2型腺相关病毒的获得及鉴定

目的包装及鉴定低氧反应元件（HRE）启动子控制下缺氧诱导目的基因hVEGF165基因表达的2型重组腺相关病毒。方法磷酸钙三质粒共转染方法将pAAV—HRE9-VEGF165、pAAV—Rep／cap、pHelper质粒转染HEK293T细胞，制备2型重组腺病毒相关病毒（rAAV2）。分离培养S—D大鼠心肌细胞，转染rAAV，细胞固定后做免疫细胞荧光染色，检测细胞内血管内皮细胞生长因子（VEGF165）蛋白的表达。结果pAAV—HRE9-VEGF165质粒经测序鉴定，结果与NCBIGenBank公布的人VEGF165 eDNA核苷酸序列（AB021221）完全一致，含HRE启动子及目的基因hVEGF165的2型重组非复制型腺相关病毒包装成功，可感染原代培养的大鼠心肌细胞，缺氧可诱导VEGF165蛋白表达。结论成功包装并鉴定了rAAV—HRE9-hVEGF165载体，可有效转染心肌细胞，VEGF165基因的适时表达，为缺血性心肌疾病的“分子搭桥”治疗提供了更可能的安全性。     

乙型肝炎病毒核心抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞作用的靶细胞的建立

目的 建立HBcAg特异性CTL作用的靶细胞系统，为进一步研究HBV基因变异对CTL细胞毒效应的影响奠定基础。方法 采用两种质粒pXT1和EBO-plpp构建HBVC基因真核细胞表达载体并转染永生化B细胞，DNA分析和流式细胞仪检测HBVC基因在宿主细胞中的复制、表达。结果 在转染重组质粒pXT1-HBVc和EBO-plpp0-HBVc的B细胞中，均能检测到目的基因；分别有89.81%和88.51%的宿主细胞能检测到HBcAg；连续培养3周后，分别有88.30%和72.19%的宿主细胞表达HBcAg。结论 重组逆转录病毒表达载体pXT1-HBVc和EB病毒表达载体EBO-plpp-HBVc转染的永生化人外周血B细胞能有效地表达靶抗原（HBcAg),可作为较为理想的HBV特异性CTL作用的靶细胞。     

含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的假型逆转录病毒的构建及包装

研究将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因应用于基因治疗。构建、包装含CD基因的假型逆转录病毒。构建含CD基因的逆转录病毒重组表达载体pLCDSN基础上，以重组表达载体pLCDSN转染包装细胞PA317，pLCDSN整合入PA317染色体中。结果：CD基因获得表达且包装出具有感染能力的假型逆转录病毒。以该假型逆转录病毒感染NIH／3T3细胞，逆转录病毒重组表达载体pLCDSN整合入NIH／3T3细胞染色体中，CD基因获得表达。5－FC对有CD基因表达的包装细胞PA317（pLCDSN）和NIH／3T3（pLCDSN）产生杀伤毒性。结论：我们已成功地构建、包装了含重组逆转录病毒载体pLCDSN且具有感染能力的假型逆转录病毒。该工作为以逆转录病毒介导的CD基因应用于肿瘤基因治疗奠定了基础。     

定点整合型基因治疗腺病毒载体的构建

目的：构建定点整合型基因治疗腺病毒载体。方法：以逐步亚克隆法将腺病毒伴随病毒的两个末端倒转重复序列与neo基因表达盒克隆至pAdE1CMV，其中HCMV启动子控制下的neo基因表达盒位于腺病毒伴随病毒两个末端倒转重复序列之间，将得到的转移载体pAdE1CMVITREXneoDNA和pJM17DNA以脂质体法共转染293细胞，G418法连续筛选重组腺病毒。以病毒核酸酶切及感染293细胞的CPE（cytopathiceffect　）观察鉴定是否获得重组腺病毒。结果：获得有腺病毒伴随病毒的两个末端倒转重复序列和位于其间的neo基因表达盒的重组腺病毒vAd－AAV。结论：重组腺病毒vAd－AAV的构建成功将为基因治疗提供定点整合型腺病毒载体。     

老年人肺癌组织中鸟氨酸脱羧酶基因表达及其临床意义

目的：从mRNA和蛋白质水平探讨ODC基因表达和老年人肺癌的关系，为肺癌基因诊断和基因治疗的研究提供理论依据。方法：分别应用RT PCR和免疫组化方法检测42例老年人肺癌组织和癌旁正常肺组织中ODC mRNA和ODC蛋白的表达，应用Western Blot检测肺癌组织中ODC表达，同时用MTT法观察不同转染组肿瘤细胞的增殖状况，探讨上述指标与肺癌临床病理学特性的关系。结果：RT PCR显示，老年人肺癌组织中ODC mRNA表达明显高于癌旁正常肺组织（P＜0.05），不同类型和分化程度肺癌组织中ODC mRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05），Ⅲ期肺癌组织中ODC mRNA表达明显高于Ⅰ期+Ⅱ期（P＜0.05）；免疫组化显示，肺癌组织中ODC蛋白表达明显高于癌旁正常肺组织(P＜0.05);不同病理类型和分化程度肺癌组织中ODC蛋白表达未见明显差异（P＞0.05），Ⅲ期肺癌组织中ODC蛋白表达较Ⅰ期+Ⅱ期明显升高（P＜0.05）；Western Blot显示，肺癌组织中ODC蛋白表达明显高于癌旁正常肺组织；MTT法观察生长曲线检测数据表明，ODC的反义RNA表达载体转染组细胞的增殖明显比对照组细胞和空载体转染组细胞缓慢。结论：ODC表达增强与老年人肺癌发生、发展、浸润及转移有关，可作为判断肺癌生物学行为的参考指标; ODC的反义RNA表达载体对A 549肺癌细胞株的生长具有一定的抑制作用。     

应用重组分泌型内皮抑素腺相关病毒治疗肾细胞癌

【目的】研究重组分泌型内皮抑素腺相关病毒（rAAV—Endostatin，rAAV—ES）的抗肿瘤血管生成及抑制肾细胞癌进展的作用。【方法】应用rAAV—ES转染肾癌细胞，ELISA法测定上清液中重组内皮抑素的浓度并检测其对血管内皮细胞趋化运动的抑制作用；建立裸鼠肿瘤模型，检测肾癌细胞被感染后的成瘤率及全身应用rAAV—ES后抑制肿瘤发展的作用及其毒副作用。【结果】RCC细胞感染rAAV—ES后上清液中重组内皮抑素浓度为52．67ng／ml，对血管内皮细胞趋化运动的抑制率为38．13％；转染rAAV—Es后的肾癌细胞成瘤率为对照组的60％，体内实验证实全身应用rAAV—ES后血清中内皮抑素长期高效表达，肿瘤生长速度减慢，瘤体微血管密度变低，心脑组织检查未见缺血和其他病理改变。【结论】rAAV—ES无毒副作用，可有效地抑制肿瘤的血管生成，从而抑制肾细胞癌的发生和发展。     

趋化因子受体CXCR4小分子干扰RNA表达载体的构建及表达

目的： 构建趋化因子受体CXCR4小分子干扰RNA（siRNA）表达载体，研究其对CXCR4基因表达的沉默效果，探索抗人免疫缺陷病毒-1 （HIV-1）治疗的新途径。方法： 根据软件设计针对CXCR4基因的siRNA序列，经退火成互补双链，克隆到Psilencer^M3.1-H1 neo载体中，经测序鉴定插入序列的正确性。转染MT₄细胞后，采用RT-PCR及流式细胞仪方法检测转染siRNA质粒的实验组、转染空载体的阴性对照组和空白细胞对照组间抑制基因表达情况。结果： PCR及琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒Psilencer^M 3.1-H1- siRNA neo，有正确的特异性片段，DNA测序也证明具有正确序列；该载体转染MT₄细胞48 h后，能明显抑制CXCR4基因表达，其表达抑制率为70%，与空白对照组和阴性组比较差异有显著性（P<0.05）。结论： 成功构建趋化因子受体CXCR4的siRNA表达载体。     

CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的：构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法：采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体, PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP -CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果：PCR法获得了约1 810 bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论：构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭、转移的作用

目的 探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在乳腺癌细胞（231）侵袭、转移过程所起的作用。方法 构建GRP78真核反义表达载体,转染入231细胞,利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况;并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果 转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞;反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论 GRP78是乳腺癌的一个促癌基因,下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

pcDNA 3.0-tyr转染GM细胞及鉴定

目的 研究peDNA 3．0-tyr在正常人成纤维母细胞株（GM0639细胞）中的表达。方法 peDNA 3．0-tyr真核表达质粒扩增、纯化后经测序、酶切鉴定；电穿孔法将peDNA 3．0-tyr转染GM细胞，RT．PCR检测；测定490nm吸光度值，细胞爬片Fontana染色，证实酪氨酸酶基因表达及其表达水平。结果 测序及酶切结果提示peDNA 3．0-tyr质粒含有酪氨酸酶全长eDNA片段；转染peDNA 3．0-tyr的细胞的PCR产物长度与预期长度一致，而转染peDNA3．0空载体的细胞PCR产物无此条带；转染peDNA 3．0-tyr的GM细胞的A490显著高于转染空载体的细胞及未转染的GM细胞（P〈0．001）；转染peDNA 3．0-tyr的GM细胞Fontana染色于胞浆内见棕褐色银沉着颗粒，而转染peDNA3．0空载体以及未转染的细胞缺乏此颗粒。结论 peDNA 3．0-tyr可体外转染GM0639细胞并成功表达，为后续研究奠定基础。     

人脂肪组织来源基质干细胞成脂分化及Ad-EGFP体外转染研究

目的探讨重组腺相关病毒载体能否有效地转染脂肪组织来源基质干细胞及（ADSC）其影响，同时为组织工程寻找一种理想的病毒载体及细胞示踪标记方法。方法采用抽脂法分离培养ADSC，诱导培养液诱导细胞成脂分化，行细胞形态学检查，细胞表面抗原鉴定，油红。染色，评价细胞成脂情况。在此基础上转染Ad-EGFP，观察细胞形态学改变及荧光表达的时间与强度，计算转染效率，确定转染的理想感染复数（MOI）值，同时通过活力和增殖实验进行Ad-EGFP体外转染对ADSC的影响研究。结果细胞扩增迅速，形态良好，经诱导后呈现明显的成脂改变。实验确定Ad转染细胞的较佳MOI值为50，以此值转染Ad-EGFP后细胞荧光持续高效稳定表达，并可传至子代，可以满足示踪标记的需要。Ad转染效率高，对细胞活性影响小。结论ADSC的培养和分化能满足脂肪组织工程的要求；Ad长期稳定表达目的基因，是一种理想的组织工程病毒载体；基因转染方法高效稳定表达EGFP。可作为种子细胞良好的示踪标记方法。