建立永生化皮肤成纤维细胞的初步研究：pIRES2-EGFP-hTERT真核表达载体的构建

目的：构建同时含有荧光蛋白表达基因和端粒酶催化亚单位(hTERT)表达基因的真核质粒载体，为hTERT cDNA的稳定转染提供快速有效的鉴定手段，并为建立永生化的皮肤成纤维细胞，为皮肤试验提供稳定的细胞系奠定基础。方法：选取带有荧光蛋白表达基因的空载体和带有hTERT cDNA的载体，利用基因重组技术，获得新的载体pIRES2-EGFP-hTERT，筛选阳性克隆进行酶切和序列测定。结果：酶切电泳分析，获得了3．4kb和5．3kb大小的两条片段；测序结果两端序列正确。结论：重组载体pIRES2-EGFP-hTERT构建成功,为hTERT cDNA的稳定转染提供快速有效的鉴定手段，为建立永生化的皮肤成纤维细胞系奠定了基础。     

人乙酰肝素酶全长编码cDNA的克隆

目的 克隆乙酰肝素酶(HPA)全长编码cDNA并构建其真核表达载体.方法 培养HepG2细胞后,收集细胞,提取HepG2细胞总mRNA,反转录合成cDNA.以cDNA作为模板通过PCR法扩增HPA蛋白全长编码cDNA;构建真核表达载体.结果 所获得的乙酰肝素酶cDNA序列共1632 bp,与已报道的人乙酰肝素酶编码基因全长cDNA序列一致,并构建了以pcDNA3.1(+)为载体的真核表达质粒.结论 本实验克隆出了人乙酰肝素酶编码cDNA序列,并成功构建了真核表达载体.     

人血小板衍生生长因子B在大肠杆菌中的表达及对骨组织修复的影响

目的：为研究人血小板衍生生长因子BB(PDGF—BB)在大肠杆菌中的表达及其在治疗骨折愈合、骨质疏松等疾病中的作用，克隆了PDGF—B的成熟肽基因并进行了序列分析。方法：从脐静脉内皮细胞提取总RNA，经反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增出包含全长编码人PDGF—B基因cDNA，再以此为模板，用特异引物进行PCR扩增出PDGF—B成熟肽基因；将目的基因连接到载体pGEM—T上，进行序列测定。之后将此片段克隆到表达载体pQE30，构建成表达质粒pQE30—PDGFB。结果：重组质粒经酶切及PCR鉴定，证实PDGF—B成熟肽基因克隆成功，序列正确。结论：PDGFB基因的成功克隆和原核表达载体的构建，为促进骨修复功能研究及基因工程生产奠定了基础。     

SARS-CoVS蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的：克隆表达SARS-CoVS蛋白，构建SARS全长基因疫苗。方法：从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1和S2蛋白的编码序列，再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western检测S蛋白的表达。结果：PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段，两片段插入pVAX1构建重组表达载体后，经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoVs蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

CML28树突状细胞核酸疫苗的构建及其表达研究

为了构建负载CML28的核酸疫苗，并在树突状细胞中进行表达，用分子克隆的方法，从K562细胞中克隆出CML28的cDNA全长，将其亚克隆至pGEM—T载体，经测序后酶切，克隆至真核表达载体pcDNA3．1HisA，将重组质粒pcDNA3．1HisA—CML28进行酶切分析和测序鉴定；从正常人外周血中分离外周血单个核细胞（PBMC），在IL-4和GM—CSF条件下诱导分化为树突状细胞（DC），并进行鉴定；用电穿孔的方法将重组质粒pcDNA3.1 HisA—CML28导入到DC中，Western Blot检测His-CML28融合蛋白的表达。结果表明：经酶切分析和测序鉴定，重组质粒pcDNA3.1 HisA—CML28含有正确的CML28全长序列；经电穿孔导入Dc后，重组质粒能表达His—CML28蛋白。结论：成功构建了CML28树突状细胞核酸疫苗。     

EB病毒BZLF1N基因的克隆与序列分析

目的:克隆EB病毒BZLFIN基因编码区的cDNA并对其序列进行分析.方法:采用RT-PCR方法,从B95-8细胞获得BZLF1N基因的cDNA,克隆至pGEM-TEasy载体,选择阳性克隆并进行序列测定.结果:构建的重组载体中含有EB病毒BZLF1N基因的全长序列,与Genebank公布的序列完全一致.结论:获得EB病毒BZLF1N基因的克隆,为进一步的研究奠定了基础.     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的 构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3，制备肿瘤DNA疫苗，为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法 从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA，进行RT-PCR扩增出全长cDNA，并克隆入PUCl9载体，经DNA测序证实序列无误后，将MAGE-3基因克隆入pcDNA3．1( )真核表达载体。结果 经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段，成功克隆人PUCl9载体，经DNA测序证实为MAGE-3，编码MAGE-3基因全部947bp序列，读框正确，进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3．1／MAGE-3。结论 成功构建了MAGE-3真核表达质粒，为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础，对提供有效治疗方案，提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

SARS-CoV S蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的:克隆表达SARS-CoVS蛋白,构建SARS全长基因疫苗。方法:从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoVS1和S2蛋白的编码序列,再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western检测S蛋白的表达。结果:PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段,两片段插入pVAX1构建重组表达载体后,经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞,收集细胞总蛋白,Western检测获得特异蛋白带。结论:成功克隆并表达了SARS-CoVS蛋白,为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3,制备肿瘤DNA疫苗,为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA,进行RT-PCR扩增出全长cDNA,并克隆入PUC19载体,经DNA测序证实序列无误后,将MAGE-3基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体。结果经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段,成功克隆入PUC19载体,经DNA测序证实为MAGE-3,编码MAGE-3基因全部947bp序列,读框正确,进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3.1/MAGE-3。结论成功构建了MAGE-3真核表达质粒,为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础,对提供有效治疗方案,提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

靶向克隆法构建PEP-1-VP3基因的原核表达载体

目的 利用PCR 产物靶向克隆法构建细胞穿透肽-凋亡素(PEP-1-VP3)的原核表达载体.方法 以PGEX-6P-1/TAT-VP3 质粒为模板,PCR 扩增VP3 基因的366 bp 片段,应用靶向克隆酶,将VP3 基因插入到线性pET15b-PEP-1,得到重组表达质粒pET15b-PEP-1-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Nde Ⅰ和BamHⅠ双酶切图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体.结果 PCR产物经过电泳可见366 bp 特征性的VP3 片段,重组的质粒经过双酶切获得了一个大小为440 bp 的特征性PEP-1-VP3 片段,重组质粒测序证实VP3 cDNA 编码区成功地克隆入了pET15b-PEP-1,且其序列与GeneBank 中VP3 cDNA 序列完全一致.结论 靶向克隆法可快速、高效地构建PEP-1-VP3 基因的原核表达载体,为制备PEP-1-VP3 融合蛋白奠定基础.     

RHD基因的克隆及其在K562细胞中的表达

本研究目的在于克隆人类红细胞RHD基因，构建RhD表达载体，观察其在K562细胞中的表达。从脐血网织红细胞中提取总RNA，采用逆转录聚合酶链反应扩增RHD／CE基因，扩增产物通过TA连接克隆到pGEM-T质粒，采用测序方法筛选多个克隆获得RHD基因。将获得的RHD基因进一步亚克隆构建pcDNA3．1(-)表达载体。重组表达载体通过superfect试剂盒转染K562细胞，最后观察K562细胞中RHD基因的转录和表达。结果表明：成功分离克隆到RHD基因，构建的pcDNA3.1(-)重组表达载体经酶切和测序证实RHD cDNA序列及插入方向正确。转染后的K562细胞内有相应的mRNA转录，细胞表面有RhD抗原表达。结论：RHD cDNA转染的K562细胞能表达RhD抗原，该表达体系有助于进一步研究各种RhD变异型的分子基础。     

人血小板衍生生长因子B在大肠杆菌中的表达及对骨组织修复的影响

目的:为研究人血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)在大肠杆菌中的表达及其在治疗骨折愈合、骨质疏松等疾病中的作用,克隆了PDGF-B的成熟肽基因并进行了序列分析。方法:从脐静脉内皮细胞提取总RNA,经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出包含全长编码人PDGF-B基因cDNA,再以此为模板,用特异引物进行PCR扩增出PDGF-B成熟肽基因;将目的基因连接到载体pGEM-T上,进行序列测定。之后将此片段克隆到表达载体pQE30,构建成表达质粒pQE30-PDGFB。结果:重组质粒经酶切及PCR鉴定,证实PDGF-B成熟肽基因克隆成功,序列正确。结论:PDGFB基因的成功克隆和原核表达载体的构建,为促进骨修复功能研究及基因工程生产奠定了基础。     

人胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的：构建胰岛索样生长因子1（insulin growth faetor 1，IGF-1）的真核细胞表达质粒，转染神经胶质瘤细胞（C6细胞），建五hIGF-1稳定表达细胞株，为进一步观察胰岛索样生长因子1基因体内转染后对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响打下基础。方法：实验于2004-05／09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室进行，用聚合酶链反应方法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出IGF—1cDNA，然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中，酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的hIGF-1基因序列；使用C6细胞株，用脂质体方法转染C6细胞。经G418筛选，形成阳性细胞克隆。继续培养4周，进行Western blot检测。结果：重组的真核细胞表达质粒pcDNA3．1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。Western blot检测结果证实转染的hIGF-1基因在C6细胞内成功表达。结论：实验所构建的重组真核细胞表达载体pcDNA3．1-hIGF-1能够稳定表达有活性的hIGF-1，实验结果对进一步观察脊髓损伤后胰岛素样生长因子1抑制神经细胞凋亡的作用有一定意义。     

重组人内皮抑素基因克隆及其质粒抑瘤活性的鉴定

目的：利用大肠杆菌表达系统表达重组人内皮抑素，并将其作用于小鼠宫颈癌动物模型，检测其效果。方法：采用RT－PCR方法从人胚肝中提取人内皮抑素cDNA，将其克隆入pGEM-T Easy克隆载体中；经全自动序列分析仪测序确证后，将人内皮抑素cDNA亚克隆入原真核表达载体PQE－30，构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒；将该重组质粒注射入小鼠宫颈癌模型。结果：成功获得551bp人内皮抑素基因，测序证实序列正确。构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒，此质粒能有效抑制肿瘤生长。结论：人内皮抑素具有抗肿瘤生长作用，为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础。     

人IGF-I基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选

目的 设计并筛选人IGF-I有效RNA干扰片段,构建IGF-I-siRNA慢病毒表达载体.方法 对人IGF-I基因编码区分析、筛选序列4条,阴性对照序列1条.与pGCL-GFP质粒重组后,转染大肠杆菌感受态细胞.阳性克隆经过鉴定后得到正确重组子,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T 细胞,体外直接感染表达IGF-I的人血管平滑肌细胞.通过用Realtime-PCR检验干扰效果.结果 ①成功地合成四条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pGCSIL-GFP载体中,构建重组质粒PscSI-1、2、3、4,及无关基因的重组质粒PscNC,酶切鉴定和测序证实载体构建成功;②Realtime-PCR检测IGF-I的mRNA表达,发现重组质粒PscSI-1转染人血管平滑肌细胞后IGF-I mRNA表达最低,重组质粒PscNC转染组细胞内IGF-I mRNA的表达量与空白对照的水平接近(P>0.05).结论 成功构建了小的发夹式IGF-I慢病毒表达载体.在人IGF-I序列位点1010～1028 bp、序列为ACCTTGTCTAAGTGGTTTA可以在人血管平滑肌细胞中实现对人IGF-I基因表达的有效沉默.     

国人胰岛细胞自身抗原ICA69原核表达型质粒的构建

目的：应用基因工程技术生产适用于I型糖尿病早期诊断的试剂盒打下基础。方法：从中国人胰岛细胞瘤组织总RNA中，经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）克隆了胰岛细胞自身抗原69KD蛋白（ICA69）基因的cDNA，双脱氧末端终止法对其全部核苷酸序列予以确定后，将此编码483个氨基酸、全长1449bp的cDNA重组入表达型质粒中。结果：核苷酸序列分析证实重组质粒接口处读码框架正确。结论：为ICA69重组基因的表达及表达产物在临床诊断中的应用奠定了基础。     

重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达

目的：制备含过氧化氢酶基因的重组腺病毒，转染血管平滑肌细胞，观察过氧化氢酶表达水平。方法：将过氧化氢酶cDNA亚克隆至pShuttle-CMV中，将其和pAdEasy-1在细菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒pAdEasy-1-Cat，再转染Ad-293细胞，包装成重组腺病毒颗粒；经纯化获取重组腺病毒AdCat。转染血管平滑肌细胞，Westem blot鉴定细胞中过氧化氢酶表达。结果：正确构建了重组腺病毒载体，获得高滴度重组腺病毒，转染血管平滑肌细胞后过氧化氢酶高表达。结论：重组腺病毒AdCat转染增加血管平滑肌细胞中过氧化氢酶表达，为用过氧化氢酶基因进行再狭窄的防治打下了基础。