三七法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析

目的对三七法呢基焦磷酸合酶(FPS)进行基因克隆及序列分析。方法采用cDNA末端快速扩增法,以三七根总RNA为模板扩增出三七FPS基因。结果序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长1 409 bp,开放阅读框共编码343个氨基酸残基,推测的氨基酸序列与积雪草、灰白银胶菊、黄花蒿的FPS的氨基酸序列同源性最高,分别达95%、87%、86%。结论首次分离并报道了三七FPS cDNA克隆,为进一步研究三萜皂苷生物合成机制及其在提高植物药用价值方面的应用奠定基础。     

罗汉果法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆及其序列分析

目的 对罗汉果甜苷V生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)基因的全长cDNA序列进行克隆,为研究罗汉果甜苷V生物合成与基因调控奠定基础.方法 根据植物FPPS基因保守功能域设计简并引物,通过PCR和RACE方法克隆罗汉果FPPS基因的全长cDNA.结果 获得罗汉果FPPS (SgFPPS)基因的全长cDNA序列共1354个核苷酸,包含一个1026核苷酸的开放阅读框架(open reading frame,ORF),cDNA编码的蛋白包含342个氨基酸,推断蛋白质相对分子质量为3.92×104.NCBI Blastx结果显示,SgFPPS基因编码的蛋白与苹果树来源FPPS具有最高同源性,氨基酸一致度达85.1％.SgFPPS具有异戊烯基转移酶的5个典型保守功能域.进化树分析结果显示,SgFPPS基因与苹果树的FPPS具有较近的亲缘关系.结论 首次克隆SgFPPS基因的全长cDNA序列,为分析SgFPPS基因表达特性及其在罗汉果甜苷V生物合成中的功能奠定基础.     

甘草酸合成生物学元件初探：甘草法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及序列分析

甘草酸是中药甘草的主要有效成分,法呢基焦磷酸合酶（FPS）是甘草酸合成途径中关键酶之一。根据甘草转录组数据设计引物,对FPS 基因进行克隆,获得甘草FPS 基因的全长编码序列。甘草FPS 基因编码区全长1 029 bp,编码342 个氨基酸残基。将甘草FPS 基因与GenBank 中其他植物FPS 基因序列进行比对分析,发现其核酸序列与鹰嘴豆、苜蓿、蒺藜苜蓿、大豆、百脉根的序列相似度最高,分别达到94%、94%、93%、93%、92%。进一步的系统进化分析表明FPS 基因具有较高的保守性,其序列进化树与植物分类一致。     

甘草酸合成生物学元件初探：甘草法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及序列分析＊

甘草酸是中药甘草的主要有效成分,法呢基焦磷酸合酶（FPS）是甘草酸合成途径中关键酶之一。根据甘草转录组数据设计引物,对FPS基因进行克隆,获得甘草FPS基因的全长编码序列。甘草FPS基因编码区全长1029 bp,编码342个氨基酸残基。将甘草FPS基因与GenBank中其他植物FPS基因序列进行比对分析,发现其核酸序列与鹰嘴豆、苜蓿、蒺藜苜蓿、大豆、百脉根的序列相似度最高,分别达到94%、94%、93%、93%、92%。进一步的系统进化分析表明FPS基因具有较高的保守性,其序列进化树与植物分类一致。     

濒危药用植物茅苍术法呢基焦磷酸合酶基因克隆及其表达分析

目的克隆茅苍术Atractylodes lancea倍半萜类成分生物合成关键酶法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因全长并分析其表达规律。方法以茅苍术总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆茅苍术FPPS基因(Al FPPS)的c DNA全长,并进行生物信息学分析;用q RT-PCR和GC-MS分析不同生长阶段FPPS在茅苍术根茎中的表达及倍半萜类成分量变化,并分析二者的相关性。结果获得Al FPPS基因全长c DNA为1 320 bp(Gen Bank accession no.KX443242),含一个长1 029 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸,包含5个保守功能域,其中2个富含天冬氨酸(DXXDD)。q RT-PCR及GC-MS结果显示不同时期茅苍术Al FPPS基因表达量与倍半萜类成分量呈显著正相关。结论首次克隆获得Al FPPS基因的全长c DNA,初步证明Al FPPS基因是茅苍术倍半萜类成分生物合成途径中的重要调控位点,为茅苍术倍半萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据。     

膜荚黄芪法呢基焦磷酸合酶基因密码子偏性分析

目的法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)是调控黄芪甲苷生物合成途径关键酶,为该基因外源表达选择合适的宿主,进而为提高黄芪甲苷产量提供理论依据。方法以长白山膜荚黄芪为植物材料,克隆了FPS基因的编码序列。运用EMBOSS及Codon W等在线软件分析了FPS基因的密码子偏好性,并将其与玉米、青蒿等7种植物FPS基因及大肠杆菌基因组密码子偏好性进行比较。结果膜荚黄芪FPS基因偏好于以A或T碱基结尾的密码子,与大肠杆菌Escherichia coli基因组共有22个密码子存在差异。结论进一步提高膜荚黄芪FPS基因在大肠杆菌中的表达水平,需对其密码子进行优化。     

温郁金法呢基焦磷酸合酶（CwFPPS）基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

目的 克隆温郁金Curcuma wenyujin萜类生物合成中的限速酶法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）的全长cDNA序列。方法 根据温郁金转录组数据设计特异引物，PCR扩增FPPS全长cDNA序列并对其进行生物信息分析；构建"基因-GFP"融合表达载体，利用农杆菌介导烟草叶片进行亚细胞定位分析；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因在植物组织中的特异性表达。结果 温郁金CwFPPS基因全长1196 bp，包含1个长为1071 bp的开放阅读框，编码356个氨基酸，GenBank登入号为MT489462；CwFPPS编码蛋白属于类异戊二烯生物合成酶超级家族（C1）成员，包含5个保守的功能域，其中2个是富含天冬氨酸（DDXXD）的活性中心；亚细胞定位显示该蛋白位于泡质、细胞膜或细胞核上。qRT-PCR分析表明，CwFPPS基因在根茎中特异表达，相对表达水平是叶片中的13.7倍。结论 克隆获得的温郁金CwFPPS基因全长及其特异表达信息，可为后续进行基因功能鉴定及倍半萜成分的代谢工程研究提供依据。     

枸骨法尼基焦磷酸合酶IcFPS2基因克隆与原核表达分析

目的 克隆枸骨Ilex cornuta三萜皂苷生物合成途径中关键酶法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）基因,对其进行组织特异性表达分析,构建原核表达载体并进行重组蛋白诱导表达,探究其参与调控三萜皂苷生物合成的功能。方法 结合枸骨转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术从枸骨叶中扩增得到了IcFPS2基因的c DNA序列,对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量进一步分析其组织表达特异性,构建原核表达载体pET32a-IcFPS2,并转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达。结果 IcFPS2基因长1259 bp,开放阅读框为1050 bp,编码350个氨基酸,其蛋白质相对分子质量和等电点分别为40 200、5.54。氨基酸序列比对分析表明枸骨与栀子、杜仲、甘草、绞股蓝、竹节参的FPS氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析显示,IcFPS2蛋白与西洋参、人参、竹节参FPS蛋白聚为一支,表明枸骨FPS蛋白可能与双子叶植物五加科FPS蛋白在功能上较为...     

刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、 生物信息学及表达分析

目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达最具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.     

阳春砂二酮辅酶A合成酶的基因克隆及序列分析

目的 对阳春砂姜黄素生物合成途径的关键酶二酮辅酶A合成酶（diketide CoA synthase,DCS）基因的编码cDNA序列进行克隆,为研究阳春砂姜黄素生物合成与基因调控奠定基础。方法 结合阳春砂的转录组注释,根据编码区序列设计引物,通过PCR方法克隆阳春砂DCS基因的编码区cDNA。结果 PCR扩增了一个长1 170 bp的基因片段,该片段编码由389个氨基酸组成的DCS。同源性比对结果显示基因编码蛋白与姜黄的DCS具有氨基酸一致性达96%,与水仙等植物的查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）氨基酸一致性达66%～69%。进化树分析结果显示,与姜黄Curcumae Longae具有较近的亲缘关系。结论 首次从阳春砂中克隆DCS基因获得其编码区序列,为分析基因表达特性及其在姜黄素生物合成中的功能奠定基础。     

鱼腥草查耳酮合成酶1基因cDNA克隆、差异表达及其蛋白质序列分析

目的 克隆鱼腥草查耳酮合成酶1（CHS1）基因并分析其蛋白质序列。方法 根据已经克隆的植物CHS基因的保守序列设计一对引物,以鱼腥草总RNA为模板,采用RT-PCR和SON-PCR的方法快速获得CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段1 188 bp的序列,序列分析表明,该片段编码395个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在62.3%以上,生物信息学分析表明,该蛋白含有CHS家族的特征多肽序列“RLMMYQQGCFAGGTVLR”和“GVLFGFGPGL”,不含信号肽序列。相对荧光定量PCR分析表明,CHS1基因在花中的表达量最高,其次是地上茎,再次是地下茎,叶片中表达量最低。结论 首次从鱼腥草中克隆了CHS1基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白(Actin)基因进行克隆及序列分析.方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序.结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87％以上.结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究.方法 根据黄花蒿MCS (AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列.将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a (+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白.半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况.结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子.构建pET-21a (+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a (+)-MCS原核表达体系.AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低.结论 克隆了AaMCS基因,建立pET-2 1a (+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础.     

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究.方法 采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性.结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性.结论 首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达.     

龙骨马尾杉PcFPS1基因克隆及序列分析

目的 对龙骨马尾杉Phlegmariurus carinatus法呢二磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthase,FPS）基因PcFPS1编码区进行克隆及序列分析。方法 根据已获得的龙骨马尾杉转录组数据,从中获得1条编码FPS的转录本,采用RT-PCR方法获得PcFPS1的编码区序列,并对PcFPS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。结果 序列分析表明,所克隆的PcFPS1基因编码区长为1 119 bp,编码372个氨基酸残基,PcFPS1与挪威云杉Picea abies的FPS具有70%的序列相似性。生物信息学预测PcFPS1蛋白基本不含跨膜区,具有萜类合酶保守结构域,不含信号肽。结论 首次获得龙骨马尾杉PcFPS1基因的编码区序列,为进一步研究PcFPS1在石杉科植物萜类及甾醇类化合物生物合成途径中的功能及鉴定酶活性位点奠定基础。     

广藿香八氢番茄红素脱氢酶PcPDS1基因克隆和序列分析

目的 为阐明广藿香类胡萝卜素代谢途径,克隆了广藿香Pogostemon cablin八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因,并对其进行相关生物信息学分析.方法 搜索本课题组建立的广藿香转录组数据库,获得PDS基因全长序列,并设计全长引物进行PCR验证;利用生物信息学软件对PDS基因进行生物信息学分析.结果 本研究获得的广藿香PDS基因命名为PcPDS1(GenBank登录号为KC854409),该基因全长1 960个碱基,编码569个氨基酸.基于生物信息软件分析了PcPDS1基因编码蛋白的理化特性.系统进化树分析结果表明,PcPDS1基因与黄龙胆Gentiana lutea的PDS序列同源性最高,与烟草Nicotiana tabacum、番薯Ipomoea batatas次之,与自然进化关系保持一致.结论 成功克隆、分析了广藿香PcPDS1基因.     

宁夏枸杞查耳酮合成酶基因cDNA片段的克隆及生物信息学分析

目的 克隆宁夏枸杞类黄酮/异黄酮生物合成途径中的关键酶查耳酮合成酶（CHS,EC2.3.1.74）。方法 以宁夏枸杞为材料,利用同源克隆和RT-PCR技术得到1条CHS基因,并对其进行生物信息学分析。结果 该家族的cDNA 片段长为1 148 bp,编码382个氨基酸,蛋白相对分子质量为4.168×10⁴,等电点为6.22。氨基酸序列和结构分析显示CHS基因家族有一个活性位点,即查耳酮和二苯乙烯合成酶活性位点。宁夏枸杞CHS（LyCHS）蛋白很可能定位在细胞质。对二级结构和三级结构进行预测,发现LyCHS蛋白中无规则卷曲126个,α螺旋和β折叠分别为166和25个,延伸链65个。系统进化分析表明,LyCHS基因与马铃薯野生种、马铃薯、番茄具有很高的同源性。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为JQ964237。结论 首次克隆了LyCHS基因片段,为研究其表达特性以及功能提供了基础。