高产AmpC酶大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌的实验室检测

大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌是条件致病菌，也是重要的院内感染病原菌，在医院感染分离率一直趋于首位，近年来，由于广谱抗生素的广泛大量应用，导致这些细菌耐药性变得越来越复杂。AmpC酶是继ESBLs之后，临床上出现的又一重要耐药机制，与ESBLs不同，AmpC酶具有更加广泛的耐药谱，对头孢菌素、头霉烯类及单环菌素表现耐药，且不被市场上出售的酶抑制剂所抑制。所以监测和检测上述两种细菌产AmpC酶的情况，对预防和控制院内感染的发生具有重要的意义。     

大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌AmpC酶的检测

目的了解我院大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌产AmpC酶情况。方法按NCCLS推荐的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)确证试验,对369株大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌进行ESBLs酶的检测,并用改良三维试验、三维试验抑制试验及AmpC酶诱导试验对表型可疑产AmpC酶的菌株进行检测。结果73株表型可疑产AmpC酶的菌株中检出34株产AmpC酶,大肠埃希氏菌24株,肺炎克雷伯氏菌10株,其中有5株大肠埃希氏菌2、株肺炎克雷伯氏菌同时产ESBLs酶。2株肺炎克雷伯氏菌诱导产AmpC酶。结论产生AmpC酶是大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌对头孢类抗生素耐药的又一重要机制,实验室应对其检测和监测给予足够重视,以指导临床合理选用抗生素、减缓对细菌耐药的选择性压力、避免医院感染的发生和流行。     

EDTA纸片法检测大肠埃希菌和克雷伯菌的高产AmpC酶

目的寻找一种简便、快速、有效的检测高产AmpC酶的方法。方法用纸片扩散法对1935株大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌进行AmpC酶的初筛试验,然后用EDTA纸片法、头孢西丁三维试验和多重聚合酶链反应（PCR）同时对327株初筛阳性细菌进行AmpC酶的检测,并进行方法学比较。结果PCR、头孢西丁三维试验、EDTA纸片法阳性菌株分别为54、85、94株,阳性率分别为2．79％、4．39％、4．86％,EDTA法与三维试验的符合率为97．25％,2种检测方法差异无显著性（P〉0．05）;EDTA对质粒AmpC酶的检测率高于三维试验。结论EDTA纸片法用于这2种临床菌株中持续高产AmpC酶的检测,方法简便,结果可靠,无需特殊仪器支持,可在临床实验室推广使用。     

EDTA纸片法检测大肠埃希菌和克雷伯菌的高产AmpC酶

目的寻找一种简便、快速、有效的检测高产AmpC酶的方法。方法用纸片扩散法对1 935株大肠埃希菌和克雷伯菌属细菌进行AmpC酶的初筛试验,然后用EDTA纸片法、头孢西丁三维试验和多重聚合酶链反应(PCR)同时对327株初筛阳性细菌进行AmpC酶的检测,并进行方法学比较。结果PCR、头孢西丁三维试验、EDTA纸片法阳性菌株分别为54、85、94株,阳性率分别为2.79%、4.39%、4.86%,EDTA法与三维试验的符合率为97.25%,2种检测方法差异无显著性(P>0.05);EDTA对质粒AmpC酶的检测率高于三维试验。结论EDTA纸片法用于这2种临床菌株中持续高产AmpC酶的检测,方法简便,结果可靠,无需特殊仪器支持,可在临床实验室推广使用。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒AmpC酶基因型及流行病学分析

目的研究大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产质粒型AmpC酶株的比率、酶的基因型及其流行病学状况。方法收集本院、福建省立医院两家医院2004年9月至2005年3月的67株耐头孢西丁不重复大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，用酶提取物三维试验检测高产AmpC酶；抽提高产AmpC酶株质粒，用PCR及产物序列分析确定质粒AmpC酶和13内酰胺酶的基因型；质粒转化试验定位耐药基因；ERIC-PCR指纹图确定产酶株间的同源关系。结果福州两家医院耐头孢西丁菌中产质粒型AmpC酶的发生率，大肠埃希菌分别为16．7％和10．5％，肺炎克雷伯菌则分别为8．0％和0。2株肺炎克雷伯菌产DHA-1型、4株大肠埃希菌产CMY-2型、1株大肠埃希菌产CMY-22型质粒AmpC酶；5株产CMY型AmpC酶的大肠埃希菌还分别同时产CTX—M-14、CTX—M-27、TEM-144和TEM-1型13内酰胺酶。7株菌中，1株肺炎克雷伯菌和3株大肠埃希菌可将头孢西丁耐药性转移给受体菌。7株产酶菌ERIC—PCR指纹图显示，2株肺炎克雷伯菌来自相同克隆，其余菌株来自不同克隆。结论福州地区发现产DHA-1型AmpC酶肺炎克雷伯菌和产CMY-2型及CMY-22型AmpC酶大肠埃希菌。CMY-22型AmpC酶和TEM-144型13内酰胺酶是国内外首次报道，GenBank登录号为DQ256079和DQ2560S0。     

大肠埃希菌和克雷伯菌ESBLs及AmpC酶的检测

近年来，由于β-内酰胺类抗生素，特别是第3代头孢菌素的广泛应用，细菌对这类抗生素产生的耐药问题十分突出，给临床抗感染治疗带来极大困难。革兰阴性杆菌是临床感染的主要病原菌，其中AmpC酶在革兰阴性杆菌耐药机制中的地位日渐突出，特别是质粒型AmpC酶的出现，使AmpC酶获得了与ESBLs相同的进化背景，     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒型 AmpC 酶基因型的检测分析

目的：针对该院临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌质粒型 AmpC 酶基因型进行研究分析。方法收集2011年7月至2012年8月对头孢西丁不敏感无重复临床分离大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共176株,采用聚合酶链反应（PCR）法和扩增全基因序列分析大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产 AmpC 酶基因型。结果 PCR 结果显示,AmpC 酶基因（ampC 基因）阳性率为18．2％主要以 DHA 型为主,阳性率为59．4％,CIT 型为37．5％,EBC 为3．1％;其中,大肠埃希菌 ampC 基因阳性率为11．4％,以CIT 型为主,阳性率为77．8％,DHA 型和 EBC 型阳性率均为11．1％;肺炎克雷伯菌 ampC 基因阳性率为23．7％,以 DHA 型为主,阳性率为78．3％,CIT 型为21．7％。基因序列结果显示,DHA 型有18株为 DHA‐1基因型和1株摩根摩根菌 ampC 基因型,一致率97．0％,CIT 型有10株为 CMY‐2基因型,1株 CMY‐42基因型和1株 CMY‐4基因型;EBC 型为阴沟肠杆菌 ampC 基因型,一致率为99．0％。将32株基因序列提交 GenBank ,均被接受,其登录号为 KJ127248～ KJ127279。结论该院临床分离大肠埃希菌 ampC 基因主要以 CMY‐2型为主,而肺炎克雷伯菌主要以 DHA‐1型为主。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs和AmpC酶及传播方式的检测

目的 了解大肠埃希菌(E.coli)和肺炎克雷伯菌(K.pn)产ESBLs和AmpC酶的发生率、耐药性情况及传播方式.方法 对临床分离的66株E.coli和38株K.pn,用ESBLs表型确证试验纸片扩散法检测ESBLs,酶提取物三维实验检测AmpC酶,琼脂二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC),质粒反式接合实验检测耐药基因的传播.结果 E.coli和K.pn产ESBLs/AmpC酶的发生率分别为74.2%(49/66)/10.6%(7/66)和71.0%(27/38)/13.1%(5/38),同时产ESBLs和AmpC酶的E.coli和K.pn分别为7.6%(5/66)和10.5%(4/38).这些产酶株对三代头孢菌素、氨曲南、头孢美唑全部耐药,对含酶抑制剂复合物敏感性较低,对亚胺培南敏感;产ESBLs菌株的传播绝大部分依赖质粒水平转移,而产AmpC酶菌株的传播只有小部分依赖质粒水平转移.结论 临床分离的E.coli和K.pn菌株大部分产ESBLs或AmpC酶,且存在一定比例既产ESBLs又产AmpC酶的菌株,对这些菌株的监测和阻止其传播具有重要意义.     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs和AmpC酶及传播方式的检测

目的了解大肠埃希菌(E.coli)和肺炎克雷伯菌(K.pn)产ESBLs和AmpC酶的发生率、耐药性情况及传播方式。方法对临床分离的66株E.coli和38株K.pn,用ESBLs表型确证试验纸片扩散法检测ESBLs,酶提取物三维实验检测AmpC酶,琼脂二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC),质粒反式接合实验检测耐药基因的传播。结果E.coli和K.pn产ESBLs/AmpC酶的发生率分别为74.2%(49/66)/10.6%(7/66)和71.0%(27/38)/13.1%(5/38),同时产ESBLs和AmpC酶的E.coli和K.pn分别为7.6%(5/66)和10.5%(4/38)。这些产酶株对三代头孢菌素、氨曲南、头孢美唑全部耐药,对含酶抑制剂复合物敏感性较低,对亚胺培南敏感;产ESBLs菌株的传播绝大部分依赖质粒水平转移,而产AmpC酶菌株的传播只有小部分依赖质粒水平转移。结论临床分离的E.coli和K.pn菌株大部分产ESBLs或AmpC酶,且存在一定比例既产ESBLs又产AmpC酶的菌株,对这些菌株的监测和阻止其传播具有重要意义。     

肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌AmpC β内酰胺酶的表型检测

目的 比较研究临床实验室对AmpCβ内酰胺酶（AmpC酶）的表型检测方法,了解对头孢西丁不敏感的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中产生hmpC酶和超广谱β内酰胺酶（ESBLs）的分布情况。方法 利用加与不加3-氨基苯酚硼酸（APB）的头孢他啶、头孢噻肟和头孢西丁纸片进行APB纸片增强试验检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶,并与Tris-EDTA纸片试验检测AmpC酶的结果进行比较。用CLSI纸片确认实验检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产生的ESBLs。结果 APB纸片增强试验与Tris-EDTA纸片法检测结果完全一致。对头孢西丁不敏感的62株肺炎克雷伯菌和74株大肠埃希菌中,分别检测到产AmpC酶41株（66．1％）和33株（45．0％）。AmpC酶和ESBLs同时存在的肺炎克雷伯菌占51．6％,单产AmpC酶和单产ESBLs的肺炎克雷伯菌分别为14．5％和21．0％;而大肠埃希菌则以单产ESBLs为主,占40．5％,单产AmpC酶及同时产生AmpC酶与ESBLs的分别占20．3％和24．3％。结论 APB纸片增强试验和Tris-EDTA纸片试验操作简单,应用方便,成本低廉,均可用于临床实验室检测产AmpC酶的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。     

Evaluation of phenotypic screening methods for detecting plasmid-mediated AmpC beta-lactamases-producing isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae

Detection of plasmid-mediated (P-M) AmpC beta-lactamase-producing isolates is considered critical for epidemiologic studies and hospital infection control, but the documents of the Clinical and Laboratory Standards Institute do not contain any recommendation for the phenotypic detection. In this study, phenotypic detection methods, cefoxitin-Hodge test and induction test, were evaluated using cefoxitin-resistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates. The cefoxitin-Hodge test detected all bla(CMY-10), and 97.4% of bla(CMY-2) allele-positive isolates, but only 57.3% of bla(DHA-1) allele-positive isolates. Induction test with an aztreonam and an amoxicillin-clavulanic acid disk was more sensitive than with cefoxitin disk, which detected 86.6% of bla(DHA-1) allele-positive isolates. These phenotypic tests should be useful to screen P-M AmpC beta-lactamase-producing E. coli and K. pneumoniae isolates.     

三种AmpC酶表型检测方法比较

目的对革兰阴性菌产AmpC酶的检测方法进行评价,并寻找一种适合临床常规应用的AmpC酶检测方法。方法对39株耐头孢西丁的革兰阴性菌同时进行改良Hodge试验、三维试验、氯唑西林(CLO)双纸片协同试验和ampC基因聚合酶链反应(PCR)检测,比较4种方法的结果。结果39株革兰阴性杆菌中,改良Hodge试验、三维试验和CLO双纸片协同试验检出产AmpC酶的阳性率分别为38.5%、43.6%和28.2%,3种方法AmpC酶检出率的差异无统计学意义(P>0.05)。与PCR结果比较,改良Hodge试验特异性为87%,敏感性为75%;三维试验的特异性为78%,敏感性为75%;CLO双纸片协同试验特异性为87%,敏感性为50%。PCR显示ampC基因阳性率为41%(16/39),对16株阳性菌进行ampC基因测序,测序结果与基因数据库内相应的ampC核酸序列比对发现,同源性均在98%~100%之间。结论改良Hodge试验可作为一种操作快速、简便的筛选试验检测革兰阴性菌产AmpC酶的情况,而CLO双纸片协同试验可作为一种操作简便的排除产AmpC酶试验应用于实验室,但在准确性上低于改良Hodge试验。     

三种AmpC酶表型检测方法比较

目的对革兰阴性菌产AmpC酶的检测方法进行评价,并寻找一种适合临床常规应用的AmpC酶检测方法。方法对39株耐头孢西丁的革兰阴性菌同时进行改良Hodge试验、三维试验、氯唑西林（CLO）双纸片协同试验和ampC基因聚合酶链反应（PCR）检测,比较4种方法的结果。结果39株革兰阴性杆菌中,改良Hodge试验、三维试验和CLO双纸片协同试验检出产AmpC酶的阳性率分别为38．5％、43．6％和28．2％,3种方法AmpC酶检出率的差异无统计学意义（P〉0．05）。与PCR结果比较,改良Hodge试验特异性为87％,敏感性为75％;三维试验的特异性为78％,敏感性为75％;CLO双纸片协同试验特异性为87％,敏感性为50％。PCR显示ampC基因阳性率为41％（16／39）,对16株阳性菌进行ampC基因测序,测序结果与基因数据库内相应的ampC核酸序列比对发现,同源性均在98％～100％之间。结论改良Hodge试验可作为一种操作快速、简便的筛选试验检测革兰阴性菌产AmpC酶的情况,而CLO双纸片协同试验可作为一种操作简便的排除产AmpC酶试验应用于实验室,但在准确性上低于改良Hodge试验。     

3种肺炎克雷伯菌生物膜制备方法的比较

目的比较3种体外制备肺炎克雷伯菌生物膜的方法。方法用高分子滤膜琼脂培养法、高分子滤膜肉汤培养法和输液管肉汤培养法制备肺炎克雷伯菌生物膜,通过菌落计数判断3种方法的效果。结果培养5和10d后,3种方法的菌落计数分别是:(1.32±0.26)×109CFU/mL,(0.22±0.026)×109CFU/mL,(0.15±0.025)×109CFU/mL和(3.68±0.51)×109CFU/mL,(0.24±0.022)×109CFU/mL,(0.20±0.035)×109CFU/mL。高分子滤膜琼脂培养法明显优于其他2种方法(P<0.01)。结论用高分子滤膜琼脂培养法制备肺炎克雷伯菌生物膜操作简便,效果最佳。     

肺炎克雷伯菌产ESBL和AmpC酶菌株基因分型

随着抗生索在临床应用的不断增多,革兰阴性杆菌引起的多重耐药问题已成为全球关注的焦点,其中尤以β内酰胺类抗生素耐药为主~([1]).我国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一,耐药菌引起的医院感染人数,已占到住院感染患者总人数的30%左右~([2]).     

全国10所教学医院产ESBLs和质粒AmpC酶大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的研究

目的研究全国10所教学医院临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中同时产ESBLs及质粒型AmpC酶菌株的比率及其基因型特点,比较不同地区间的差别。方法收集来自中国不同地区的10所教学医院2003年度产ESBLs的大肠埃希菌90株和肺炎克雷伯菌61株,用等电聚焦电泳测定β内酰胺酶的等电点;接合试验证实酶基因有无可转移性;采用多重聚合酶链反应(MPCR)及序列分析确定质粒AmpC酶的基因型。结果武汉、南京、济南等地产ESBLs大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌所占比率相近,均在50%左右;北京产ESBLs大肠埃希菌所占比率低于肺炎克雷伯菌;其他各城市产ESBLs大肠埃希菌所占比率均略高于肺炎克雷伯菌。在产ESBLs菌株中24.4%大肠埃希菌和19.4%肺炎克雷伯菌对头孢西丁耐药。除沈阳无对头孢西丁耐药菌株外,其他医院均存在对头孢西丁耐药株。产ESBLs菌株基因型主要为CTX—M型,其中以CTX-M-9组最为常见,其次为CTX-M-1组。在同时产ESBLs和AmpC的菌株中,肺炎克雷伯菌多于大肠埃希菌,且均为CTX-M/ DHA-1型(多为CTX-M-9/DHA-1型)。3株同时产ESBLs和AmpC肺炎克雷伯菌的接合子PCR结果与其供体菌完全相同。结论参与本研究的各所教学医院产ESBLs菌株基因型主要为CTX-M-9组,在同时产ESBLs和AmpC酶的菌株中,肺炎克雷伯菌多于大肠埃希菌,多为CTX-M-9/DHA-1型,该酶可通过质粒传播。     

膜孔蛋白在产AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的作用

目的调查产头孢菌素β-内酰胺酶（AmpC酶）的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌膜孔蛋白的表达情况,分析其耐药机制。方法收集2003至2009年间产AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌65株,三维试验确定细菌AmpC酶的产生情况,多重聚合酶链反应（PCR）扩增ampC基因和膜孔蛋白ompF、ompK35、ompK36基因,实时定量逆转录RT-PCR检测膜孔蛋白的相对表达量,纸片扩散法检测抗菌药物的敏感性。结果 32株大肠埃希菌中,14株（43.75%）膜孔蛋白ompF转录水平下调;33株肺炎克雷伯菌中,17株（51.52%）膜孔蛋白ompK35、ompK36转录水平下调。结论在产AmpC酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中膜孔蛋白的低表达是造成耐药不可忽视的因素之一。     

武汉市儿童医院临床分离大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌中产质粒介导AmpC酶和ESBLs的研究

目的研究武汉市儿童医院临床分离高产质粒AmpC酶和超超广谱β内酰胺酶（SSBL）肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌的分子流行病学特征。方法收集我院2005年8月-2006年8月住院患儿临床分离的头孢西丁中介或耐药的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌161株。采用三维试验检测AmpC酶，表型确认试验检测ESBLs，质粒转化试验定位耐药基因；采用PCR技术扩增质粒AmpC与CTX—M基因；使用限制性片段长度多态性（RFLP）技术确定CTX—M基因簇的特征；利用基因测序确定AmpC酶及CTX—M的基因亚型。结果DHA-1型和ACT-1型为主要的质粒AmpC酶基因型，发现1种新的ACT型质粒AmpC酶，其与ACT-1的同源性仅为84％。CTX—M-14型和CTX-M-3型为主要的ESBLs基因型。最常见的大肠埃希菌SSBL基因组合为CTX-M-14＋DHA-1＋ACT-1型，肺炎克雷伯菌的为CTX—M-3＋DHA-1＋ACT-1。结论我院临床分离的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中，产SSBL菌株所占比例显著高于单产质粒AmpC酶菌株；CTXM-14／CTX—M-3＋DHA-1＋ACT-1是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中最常见的SSBL基因型。