富血小板血浆诱导脂肪干细胞成骨作用的实验研究

目的探讨在体外培养中富血小板血浆（PRP）对脂肪干细胞的增殖及诱导成骨的影响。方法从Wistar大鼠自体动脉血中提取PRP，配制成条件培养液，并作用于培养状态的脂肪干细胞，MTT法检测细胞的增殖情况，Kaplow法染色检测细胞碱性磷酸酶表达情况，碱性磷酸酶活性检测，茜素红染色鉴定钙结节形成情况。结果脂肪干细胞经诱导培养后，PRP诱导组较对照组增殖明显（P〈0．01），碱性磷酸酶活性较对照组增高明显（P〈0．01），PRP诱导组碱性磷酸酶染色阳性，茜素红染色可见钙结节形成。结论体外培养时，PRP可促进脂肪干细胞的增殖并能诱导成骨分化，从而为骨组织工程提供一种新的方法。     

兔脂肪干细胞的分离培养鉴定及成骨诱导分化研究

[目的]探讨在成骨诱导条件下兔脂肪干细胞的体外诱导分化情况：[方法]取3个月龄日本大耳白兔颈背部皮下脂肪，用Ⅰ型胶原酶消化获得细胞。Stro-1免疫细胞化学染色鉴定细胞性质；加入成骨诱导液后依次进行形态学、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积相关检测。[结果]（1）原代所获细胞Stro—1表达阳性？（2）在诱导条件下，Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶及钙盐沉积均呈阳性表达。[结论]脂肪干细胞来源广、易获取、对机体创伤小，与骨髓间充质干细胞类似，经体外诱导后可实现成骨分化，为骨组织工程提供了一种新的种子细胞：     

大鼠脂肪基质干细胞的培养及其向成骨细胞分化的研究

目的：研究大鼠脂肪基质干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）分离培养的方法，探讨大鼠脂肪基质干细胞在体外向成骨细胞分化的能力。方法：取成年Sprague—Dawley大鼠腹股沟处脂肪组织，胶原酶消化分离．接种于自制基础培养基巾分离传代。于基础培养基中传至第二代时改换诱导培养基，诱导向成骨细胞分化，培养2-4周．用碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色鉴定成骨细胞分化能力。结果：大鼠脂肪中能够分离培养出生长旺盛的脂肪基质下细胞：经向成骨细胞诱导培养后，碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色阳性，证实细胞能够分化为成骨细胞。结论：大鼠脂肪组织可分离培养出脂肪基质干细胞，生物学特性与骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）相似，能够向成骨细胞分化，有望成为组织工程的种子细胞来源。     

脂肪组织来源干细胞的成骨诱导和外源性基因转染表达研究

目的：探讨脂肪组织来源的干细胞（ADSCs）表达外源性基因的可能性。方法：取小香猪腹部皮下脂肪组织，通过Ⅰ型胶原酶消化、离心等方法分离培养ADSCs，再经原代培养和传代培养。利用成骨诱导剂（10^-7mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/L左旋抗坏血酸）诱导ADSCs向成骨方向分化，观察其生长形态，并通过Gomori改良钙钴法和von Kossa染色对其成骨表型进行鉴定。另设一对照组，培养基中不加入成骨诱导剂。脂质体介导人内皮细胞生长因子（hVEGF）和骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）转染ADSCs细胞，观察转染后细胞形态和生长情况，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学方法分别检测hVEGF mRNA、BMP-2 mRNA及其蛋白质表达。结果：成骨诱导剂能显著诱导体外培养的ADSCs向成骨细胞分化，诱导19d的ADSCs体积增大，细胞由梭形变为多边形，Gomori改良钙钴法染色显示其胞浆内富含碱性磷酸酶颗粒，诱导15d和19d，碱性磷酸酶阳性细胞分别为（25.0±7.5）%和（49.7±6.9）%。von Kossa染色表明聚集的细胞团中央有钙化结节形成。RT-PCR检测证实，经质粒转染的ADSCs中hVEGF和hBMP-2基因表达明显增强，对照组呈弱表达。免疫组织化学检测证实转染ADSCs内有棕色的阳性颗粒出现，未转染细胞则呈现阴性。结论：ADSCs能被成功诱导为成骨细胞，hVEGF和hBMP-2基因能成功地转入ADSCs并表达，这为促进骨组织工程的血管化和成骨活性奠定了基础。     

脂肪基质干细胞培养及其定向分化为成骨细胞、软骨细胞特性的研究

目的研究脂肪基质干细胞（adipose—derived stem cells，ADSCs）分离培养的方法，探讨大鼠ADSCs在体外向成骨细胞、软骨细胞分化的能力。方法从成年SD大鼠腹股沟处无菌获取脂肪组织，胶原酶消化分离，培养出ADSCs。基础培养基传至第二代时改换诱导培养基，分别诱导向成骨、软骨细胞分化，培养2～4周，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Vonkossa染色鉴定向成骨细胞分化能力；阿新蓝染色鉴定向软骨细胞分化能力。RT—PCR检测成骨细胞、软骨细胞标志基因。结果大鼠脂肪能够分离培养出生长旺盛的ADSCs；向成骨细胞诱导，ALP、Vonkossa染色阳性，RT—PCR检测有ALP、Osteocalcin及Osteopontin表达；向软骨细胞诱导，阿新蓝染色阳性，RT—PCR检测有Ⅱ型胶原、X型胶原和Aggreean表达。结论大鼠脂肪组织可以分离培养出ADSCs，生物学特性与骨髓基质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）相似，能够向成骨细胞、软骨细胞分化，有希望成为组织工程理想的种子细胞来源。     

人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化

目的：探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能。方法：组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化。结果：成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似。成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节。结论：所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞。在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能。     

低强度脉冲超声对人脂肪干细胞成骨诱导影响的实验研究

[目的]探讨低强度脉冲超声在人脂肪干细胞成骨诱导中的影响。[方法]取手术患者腹部及腰背部处脂肪,采用胶原酶消化离心贴壁法分离培养脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs),流式细胞仪检测细胞表面标记。第6代细胞分为四组:(1)阴性对照组:ADSCs于完全培养基中培养,不接受LIPUS剌激;(2)LIPUS组:ADSCs于完全培养基中培养,接受LIPUS刺激;(3)成骨诱导组:ADSCs于成骨诱导培养基中培养;(4)LIPUS联合成骨诱导组:ADSCs在成骨诱导培养基中培养,接受LIPUS刺激。[结果]ADSCs形态传至10代时仍无变化。流式细胞仪分析第6代hADSCs细胞表面特异性标记结果显示,CD105:99.61%,CD29:97.54%,CD45:0.26%,CD44:97.4%,CD14:2.51%。LIPUS+诱导组的碱性磷酸酶(ALP)表达明显高于其他组,而单用LIPUS,并不能促进成人脂肪干细胞成骨分化。[结论]LIPUS可以促进成骨诱导培养基培养下的成人脂肪干细胞的成骨分化。     

脂肪源性干细胞体外成骨特性的研究

目的探讨兔脂肪源性干细胞体外成骨分化能力。方法取3个月龄新西兰白兔颈背部皮下脂肪组织,型胶原酶消化获得细胞。绘制细胞生长曲线,采用免疫细胞荧光法检测细胞表面抗原CD44、CD45;分别加入条件培养液对所获得细胞进行成骨成脂诱导,并分别进行形态学、碱性磷酸酶、钙盐沉积和油红O染色相关检测;将脂肪源性干细胞分为成骨诱导组和非成骨诱导组,分别于诱导后1、2、3、4周检测两组的碱性磷酸酶和钙离子浓度并作统计分析。结果 a）所获细胞CD44阳性表达,CD45阴性表达;所绘制的生长曲线成典型的＂S＂型。b）在诱导条件下,碱性磷酸酶及钙盐沉积均呈阳性表达,油红O染色为阳性。c）碱性磷酸酶浓度在诱导组与非诱导组之间存在组间差别,在各个时间点诱导组碱性磷酸酶浓度均高于非诱导组（P〈0.05,n=5）;诱导组碱性磷酸酶浓度在不同诱导时相其浓度变化趋势不同（P〈0.05,n=5）;钙离子浓度在诱导组与非诱导组之间存在组间差别,在各个时间点诱导组钙离子浓度高于非诱导组（P〈0.05,n=5）。诱导组钙离子浓度在不同诱导时相其浓度变化的趋势不同（P〈0.05,n=5）。结论脂肪干细胞的易分离培养、增殖快和良好的成骨诱导活性完全符合对种子细胞的要求,是一种理想的骨组织工程种子细胞。     

人胎盘间充质干细胞的体外分离纯化及成骨能力的研究

目的通过体外分离纯化人足月胎盘间充质干细胞(hPMSCs),以研究其生物学特征及成骨能力。方法 采用胶原酶消化贴壁培养及人淋巴细胞分离液从人足月胎盘中分离纯化间充质干细胞(MSCs);流式细胞仪检测其细胞表面标志物的表达并运用MTT测定细胞生长曲线;电镜观察细胞超微结构;地塞米松、维生素C与β-甘油磷酸钠联合诱导其向成骨细胞分化,碱性磷酸酶及茜素红染色检测其碱性磷酸酶活性及钙结节。结果培养14天后可见大量贴壁细胞呈成纤维状生长,传代后增殖能力显著增强;强表达CD44,CD29,不表达CD34,CD45;经诱导后具有向成骨细胞分化的潜能,茜素红及碱性磷酸酶染色结果阳性。结论 人足月胎盘中同样含有MSCs,与其他来源的MSCs生物学特性相似,并且具有向中胚层细胞分化的能力,可作为组织工程及细胞替代疗法新的干细胞来源。     

大分子拥挤对脂肪干细胞增殖及其成骨分化能力的影响

目的 研究大分子拥挤环境对脂肪干细胞(ADSCs)增殖及体外成骨分化能力的影响。方法 将大分子拥挤试剂Ficoll 400和Ficoll 70分别以25 mg/mL和37.5 mg/mL的浓度混合,制备成50 mg/mL Fc混合液,用于体外培养ADSCs。通过CCK-8法、dsDNA核酸定量分析及BCA蛋白浓度测定,定量检测大分子拥挤环境对ADSCs增殖能力的影响;在不同培养时间对ADSCs进行成骨诱导,茜素红染色,检测ADSCs成骨分化能力。结果 CCK-8法检测显示大分子拥挤促进了ADSCs的增殖;dsDNA核酸定量分析及BCA蛋白浓度测定结果表明,大分子拥挤促进了ADSCs的DNA和蛋白质的合成;茜素红染色结果显示,大分子拥挤环境下ADSCs成骨分化能力增强,钙结节增加。结论 大分子拥挤环境对ADSCs的增殖及其体外成骨分化均有一定的促进作用。     

长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞生物学特性的影响

目的通过观察长期体外培养对人脂肪源性间充质干细胞(ADSCs)生物学特性的影响,鉴定ADSCs作为组织工程种子细胞的优越性。方法通过流式细胞技术观察长期体外培养对人ADSCs表面抗原表达和凋亡的影响。通过碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及RT-PCR检测长期体外培养对人ADSCs成骨分化潜能的影响。结果原代ADSCs表面高表达间充质干细胞表面标记物,而不表达血源性细胞表面标记物,标记物不随传代次数变化。早期ADSCs凋亡率为1%～2%,随传代次数增多凋亡率逐渐增加．但幅度不大。碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色和RT-PCR检测显示ADSCs传至第8代时仍能保持成骨分化潜能。结论ADSCs生物学特性稳定,是较为理想的组织工程及再生医学研究的种子细胞。     

前列腺癌PC-3细胞条件培养液对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:探讨前列腺癌PC-3细胞条件培养液(PC-3-CM)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:从健康成人骨髓分离、培养、扩增hBMSCs。第3代(P3)hBMSCs用于该实验的研究。PC-3细胞培养至对数生长期时换液,继续培养24 h后收集培养上清液即PC-3-CM。hBMSCs分别在常规培养液(对照组)和含50%PC-3-CM的培养液(实验组)中培养,采用WST-8法检测PC-3-CM对hBMSCs增殖活性的影响。根据培养液的不同,将hBMSCs分为4组:常规培养液组(Ⅰ组,对照组),含50%PC-3-CM培养液组(Ⅱ组),成骨诱导剂组(Ⅲ组)和含50%PC-3-CM的成骨诱导剂组(Ⅳ组),通过碱性磷酸酶(ALP)染色、活性检测和Von Kossa钙染色、钙沉积定量来观察PC-3-CM对hBMSCs成骨分化的影响。结果:培养第1、3、5和7天,WST-8法检测显示,实验组细胞吸光度(A)值分别为0.437 0±0.028 5、0.798 0±0.021 3、1.909 0±0.061 2和2.302 3±0.061 0,对照组分别为0.406 0±0.022 3、0.664 3±0.007 5、1.372 7±0.017 6和1.794 7±0.011 5。两组间除第1天的A值无统计学差异(P>0.05)外,其余3 d实验组的A值均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。4组细胞ALP染色阳性率和染色强度依次增高,ALP活性分别为0.292 5±0.033 0、1.297 5±0.023 6、2.125 0±0.073 3和3.795 0±0.026 9,依次升高(P<0.01)。4组细胞钙结节数目依次增多,染色强度依次增强,钙沉积含量分别为0.039 0±0.006 4、0.435 0±0.049 2、0.977 5±0.035 2和1.271 3±0.035 2,依次升高(P<0.01)。结论:PC-3-CM可促进人hBMSCs增殖和成骨分化。     

Choukroun’SPRF对体外培养人脂肪干细胞增殖及成骨分化的影响

目的：观察自体富血小板纤维蛋白Choukroun＇s PRF（Choukroun＇s platelct-rich fibrin）对体外培养人脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）增殖及成骨分化能力的影响。方法：取吸脂术者自愿捐献的脂肪组织分离培养ADSCs,采用Choukroun法制备自体PRF备用,观察细胞生长情况。取第3代ADSCs分别向骨细胞、脂肪细胞、神经球细胞定向诱导分化鉴定,并行细胞表面抗原CD29、CD45、CD90流式检测鉴定。将第3代ADSCs分别采用含PRF的普通培养基（PRF组Ⅰ）和不含PRF的普通培养基（对照组Ⅰ）进行培养,观察细胞生长情况,培养1天、3天、5天、7天后采用CCK-8试剂检测细胞增殖活性。另外分别采用含PRF的成骨诱导培养基（PRF组Ⅱ）、不含PRF的成骨诱导培养基（对照组Ⅱ）及不合PRF的普通培养基（空白组）进行培养,第7天、14天、21天、28天行碱性磷酸酶活性（ALP活性）检测;诱导细胞培养后第7天、14天天各组分别行von Kossa染色观察钙结节形成情况。结果：第3代ADSCs倒置显微镜下观察大多呈梭形,向骨细胞、脂肪细胞、神经干细胞定向诱导鉴定均为阳性,流式检测鉴定CD29、CD90为阳性,CD45为阴性。CCK-8法示PRF组Ⅰ的0D值均大于对照组Ⅰ,两组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。ALP活性检测示PRF组Ⅱ第7天、14天、21天、28天细胞活性较对照组Ⅱ均大,两组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。PRF组Ⅱ成骨诱导7天后vonKossa染色阳性;14天后阳性细胞增多,对照组Ⅱ诱导7天未见钙结节,14天见少量阳性钙结节,空白组培养14天未见黑色钙结节。结论：Choukroun’sPRF明显促进脂肪干细胞增殖及成骨分化,为骨组织工程提供了新的技术。PRF与干细胞共同培养可能还有许多潜在的临床及生物工程应用价值,值得进一步研究。     

大鼠脂肪干细胞体外诱导成平滑肌样细胞的研究

目的:研究大鼠脂肪干细胞(ADSCs)体外单层培养条件下诱导分化为平滑肌样细胞的可行性。方法:从SD大鼠的腹股沟脂肪垫分离获取脂肪干细胞,测定其生长曲线。取第4代细胞用成脂诱导液诱导分化,并用油红O染色鉴定。取第4代细胞用成骨诱导液诱导分化,并用Von Kossa染色鉴定。取第4代细胞用含有β-巯基乙醇的成平滑肌诱导液诱导,并用免疫组化的方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果:脂肪干细胞成梭形和多角形,体外生长迅速,生长曲线表明传代2 d后细胞进入对数生长期。第4代细胞成脂诱导后,油红O染色证实细胞内存在脂滴;成骨诱导后,Von Kossa染色证实有矿化结节。脂肪干细胞诱导平滑肌样细胞免疫组化结果,β-巯基乙醇诱导组和未诱导组细胞α-SMA的表达阳性率分别为(29.80±6.89)%、(2.89±1.24)%。诱导组细胞α-SMA的表达阳性率高于未诱导组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:脂肪干细胞经诱导后出现明显的平滑肌细胞特征,可成为平滑肌相关疾病在组织工程研究上新的种子细胞来源。     

唑来膦酸对小鼠胚胎成骨细胞增殖和分化的影响

目的研究唑来膦酸对小鼠胚胎成骨细胞体外增殖和成骨分化的影响。方法将小鼠胚胎成骨细胞体外传代培养,使用含不同浓度（1.0、0.1μmol/L）唑来膦酸的成骨诱导培养基干预细胞,不含唑来膦酸的培养基作对照,培养1、3、5 d采用CCK-8试剂盒检测唑来膦酸对成骨细胞增殖的影响;培养14 d行碱性磷酸酶（ALP）染色;培养21 d行茜素红染色;培养7 d,实时定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测转录因子Runx2、成骨标志物Ⅰ型胶原（Collagen TypeⅠ）、ALP、骨钙素（OCN）基因的表达,免疫印迹法（Western Blotting）检测转录因子Runx2蛋白的表达。结果不同浓度的唑来膦酸干预细胞后,CCK-8实验检测吸光度值随天数增加而升高,各组之间差异无统计学意义（P〉0.05）。随着唑来膦酸浓度的升高,ALP染色和茜素红染色逐渐变浅,Runx2、Collagen TypeⅠ、ALP、OCN基因的表达量降低,Runx2蛋白的表达量降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论唑来膦酸在选定浓度（1.0、0.1μmol/L）下不影响成骨细胞的增殖,但对其分化功能的抑制作用随着浓度的增加而增强。     

CD204阴性人脂肪来源细胞体外成软骨潜能的初步研究

目的比较CD204+和CD204-两种人脂肪来源细胞的干细胞特性和体外诱导成软骨的能力。方法分离培养人脂肪来源细胞并进行流式细胞分选,分别获得CD204+和CD204-两种细胞。将这两种细胞培养扩增至第2代,观察其形态学特点;成脂、成骨定向诱导分化,油红O染色、茜素红染色定性;同时将两种细胞进行pellet成软骨诱导分化,比较体外诱导成软骨的能力,并以HE、Safranin O和Ⅱ型胶原免疫组化染色等进行鉴定。结果经流式细胞分选,脂肪来源细胞中CD204表达阳性率约为10%。分选后的CD204+和CD204-细胞均呈成纤维细胞样贴壁生长,但CD204-细胞具有更强的增殖能力。成脂诱导10 d后,两组细胞油红O染色均可见胞浆内有大量红染脂滴,但CD204+细胞具有更强的成脂潜能。成骨诱导2周后,两组细胞茜素红染色均可见钙结节红染,而CD204-细胞具有更强的成骨潜能。同时,细胞pellet成软骨诱导4周后,大体观可见CD204-细胞组pellet形成白色透明样软骨成分,而CD204+细胞组pellet外观微黄。HE和Ⅱ型胶原免疫组化染色均显示CD204-组pellet可见成熟软骨陷窝形成,Safranin O染色显示CD204-组软骨特异性细胞外基质沉积;而CD204+细胞组pellet则呈纤维化改变。结论脂肪组织来源的CD204-细胞具有干细胞的生物学特点,且有良好的成软骨潜能,可以成为软骨组织工程良好的种子细胞来源。