细胞凋亡、细胞增殖在人颈椎间盘退变过程中的作用

目的 探讨细胞凋亡、细胞增殖在人颈椎间盘退变过程中的作用以及人颈椎间盘细胞凋亡可能涉及的信号转导途径.方法 收集手术切除的33份突出颈椎间盘组织,以22份正常人颈椎间盘组织作为对照,组织形态学和TUNEL法检测凋亡细胞,免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、bax及Caspase-3的表达.结果 实验组的细胞密度低于对照组(髓核内:6.30±1.54比8.96±1.14;软骨终板内:17.27±1.82比25.41±1.89);实验组的TUNEL阳性细胞率高于对照组(髓核内:11.73±1.36比7.02±1.26;软骨终板内:13.04±1.75PC6.86±1.42);实验组髓核内PCNA阳性细胞率高于对照组(8.38±1.98比4.55±1.54);实验组髓核内bax阳性细胞率和Caspase-3阳性细胞率分别高于对照组(bax:19.32±1.95比10.94±1.72;Caspase-3:15.05±1.74比8.92±1.48);TUNEL阳性细胞率与细胞密度之间呈负相关(P＜0.01);实验组髓核内PCNA阳性细胞率与细胞密度之间呈正相关(P＜0.01);两组髓核内bax阳性细胞率、Caspase-3阳性细胞率均与TUNEL阳性细胞率之间呈正相关(P＜0.01).结论 细胞凋亡与细胞增殖间的不平衡可能是人退变颈椎间盘内细胞密度下降的原因,人颈椎间盘髓核细胞的过度凋亡可能与bax和Caspase-3的表达上调有关.     

兔退变椎间盘中髓核细胞凋亡与BNIP3基因表达的意义

目的髓核细胞凋亡可能与髓核组织代谢障碍产生缺氧,导致BNIP3基因表达有关。通过观察兔退变椎间盘中髓核组织的细胞密度、细胞凋亡率及BNIP3的表达,为进一步了解髓核细胞凋亡机制提供实验依据。方法健康3月龄雄性新西兰大白兔30只,体重(2.3±0.2)kg,随机分为实验组(n=20)及对照组(n=10)。实验组大白兔采用针刺L3、4、L4、5及L5、6椎间盘制备椎间盘退变模型;对照组仅暴露椎间盘后缝合。术后4、8周通过MRI检查评价椎间盘退变情况,采用组织学观察和TUNEL法检查椎间盘髓核组织中凋亡细胞,用免疫组织化学染色法检测兔椎间盘髓核细胞BNIP3的表达。结果 MRI检查示实验组术后4、8周椎间盘髓核信号强度呈逐渐降低趋势。根据Pfirrmann分级标准,实验组术后4、8周椎间盘退变分级比较,差异均有统计学意义(P0.05)。组织学观察及TUNEL检查示:对照组椎间盘髓核中细胞密度高,可见少量散在的凋亡细胞;实验组术后4、8周时椎间盘髓核组织内细胞密度逐渐降低,可见较多凋亡细胞。各时间点实验组细胞密度、TUNEL染色阳性细胞率与对照组比较,以及实验组各指标两时间点间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。对照组椎间盘髓核组织细胞中无BNIP3表达;实验组术后4、8周椎间盘髓核组织细胞中BNIP3表达逐渐增多,BNIP3染色阳性细胞率分别为13.45%±1.16%、32.00%±1.82%,BNIP3灰度值分别为194.32±4.65、117.54±2.11,各时间点间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论椎间盘退变与髓核组织中细胞密度下降有关,细胞凋亡是椎间盘髓核细胞减少的原因之一,BNIP3参与了椎间盘髓核细胞凋亡。     

脊索细胞研究进展

椎间盘再生研究中,脊索细胞独特的生理功能受到关注.成人髓核内脊索细凋亡与髓核内蛋白多糖含量降低、胶原含量增加、水含量丢失相关.脊索细胞分泌的可溶性因子具有引导终板软骨细胞向髓核迁移,调节髓核细胞蛋白多糖合成的作用.脊索细胞可促进髓核软骨样细胞增殖和表型维持,在维持髓核内细胞数量及细胞外基质含量中起着重要作用.脊索细胞独特的生理功能,在组织工程修复退变椎间盘研究中展现出广阔的应用前景.     

脊索细胞研究进展

椎间盘再生研究中,脊索细胞独特的生理功能受到关注。成人髓核内脊索细凋亡与髓核内蛋白多糖含量降低、胶原含量增加、水含量丢失相关。脊索细胞分泌的可溶性因子具有引导终板软骨细胞向髓核迁移,调节髓核细胞蛋白多糖合成的作用。脊索细胞可促进髓核软骨样细胞增殖和表型维持,在维持髓核内细胞数量及细胞外基质含量中起着重要作用。脊索细胞独特的生理功能,在组织工程修复退变椎间盘研究中展现出广阔的应用前景。     

退变大鼠颈椎间盘细胞凋亡的实验研究

目的动态观察大鼠颈部动静力失去平衡后颈椎间盘细胞凋亡的改变.方法建立动静力失衡性颈椎间盘退变模型,透射电镜、TUNEL法、流式细胞仪PI法检测造模3、5、7月后椎间盘细胞凋亡程度.结果退变椎间盘内有典型凋亡的细胞,以软骨细胞为主.与对照组比较,各个模型组软骨细胞凋亡指数明显升高(P＜0.01);模型组间比较,5月、7月较3月细胞凋亡指数明显升高(P＜0.01).结论退变椎间盘软骨细胞凋亡数目增多可能是椎间盘退变的机理之一.     

人退变腰椎间盘中细胞凋亡与Bax及半胱胺酸蛋白酶蛋白3基因的表达

目的 检测人腰椎间盘组织中的细胞密度、细胞凋亡率以及Bax和半胱氨酸蛋白酶蛋白3(Caspase-3)的表达,为深入了解人腰椎间盘退变的机制提供实验依据,并为将来通过生物学方法 延缓腰椎间盘退变提供新的思路.方法 实验组30个椎间盘标本(L2～S1)来自27例行后路腰椎间盘切除椎间融合手术自愿捐赠的患者,男18例,女9例;年龄30～72岁,平均51.09岁.所有病变节段均经MRI证实,患者术前均未接受椎间盘造影、胶原酶髓核溶解或椎间盘激光汽化术.对照组20个标本(L2～S1)来自5例青年男性意外死亡者新鲜尸检腰椎间盘;年龄24～37岁,平均30.83岁.采用HE染色观察凋亡软骨细胞、凋亡小体和细胞密度,TUNEL染色法检测人腰椎间盘中的凋亡细胞率,用SP免疫组织化学法检测Bax及Caspase-3表达,图像分析Bax及Caspase-3的平均灰度值.结果 HE染色示对照组、实验组软骨终板和髓核内的平均细胞密度分别为(17.16±1.22)、(12.41±0.95)个/HP,二者差异有统计学意义(P＜0.01).TUNEL染色观察示对照组的软骨终板与髓核内的平均凋亡细胞率为6.97%±0.92%,低于实验组的12.59±0.95%(P＜0.01).SP免疫组织化学染色示对照组髓核内Bax、Caspase-3染色阳性细胞率分别为11.02%4±1.18%和9.01%±1.00%,均低于实验组的19.29%±1.18%和15.07%±0.97%,差异均有统计学意义(P＜0.01).对照组腰椎间盘髓核内Bax、Caspase-3的平均灰度值分别为187.33±7.88和185.68±3.26,实验组分别为124.98±6.69和160.13±4.37,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.01).将全部腰椎间盘标本进行Pearson相关分析,对照组和实验组腰椎间盘凋亡细胞率与细胞密度间成负相关,相关系数r分别为-0.88和-0.93(P＜0.01)两组髓核内Bax、Caspase-3阳性细胞率与凋亡细胞率之间成正相关,相关系数r分别为0.83和0.91(P＜0.01).结论 细胞密度下降参与了人腰椎间盘的退变过程,Bax和Caspase-3的表达上调在人腰椎间盘髓核细胞的凋亡过程中有一定作用.     

退变大鼠颈椎间盘细胞凋亡的实验研究

目的：动态观察大鼠颈部动静力失去平衡后颈椎间盘细胞凋亡的改变。方法：建立动静力失衡性颈椎间盘退变模型，透射电镜、TUNEL法、流式细胞仪PI法检测造模3、5、7月后椎间盘细胞凋亡程度。结果：迟变椎间盘内有典型凋亡的细胞，以软骨细胞为主。与对照组比较，各个模型组软骨细胞凋亡指数明显升高(P＜0．01)；模型组间比较，5月、7月较3月细胞凋亡指数明显升高(P＜0．01)。结论：退变椎间盘软骨细胞凋亡数目增多可能是椎间盘退变的机理之一。     

髓核内注射过氧化还原酶Ⅱ对兔椎间盘退变过程的影响

目的探讨髓核内注射人重组过氧化还原酶（Peroxiredoxin,Prx）对兔椎间盘退变过程的影响。方法通过纤维环穿刺法建立新西兰大白兔椎间盘退变模型（L3～4～L5～6）,24只兔随机分为高浓度组、低浓度组和对照组,每组各8只。4周后MRI显示造模成功,然后行L3～4～L5～6椎间盘内注射,高浓度组和低浓度组分别注射1 mg/mL、10μg/mL Prx蛋白,对照组注射0.1%磷酸盐缓冲液,注射量均为25μL。在注射后2、4、12、16周每组分别随机取2只兔行脊柱MRI检查,采用硫酸咔唑法检测髓核蛋白多糖的含量,免疫组化检测型胶原含量,并做病理切片HE染色观察组织及细胞的改变情况。结果蛋白注射后三组椎间盘均发生不同程度退变,注射后16周,高浓度组髓核内水分的含量明显低于低浓度组和对照组（P〈0.05）;髓核内蛋白多糖含量高浓度组显著低于低浓度组和对照组（P〈0.05）;细胞外基质型胶原灰度值高浓度组显著低于低浓度组和对照组（P〈0.05）,而低浓度组和对照组比较差异没有统计学意义（P〉0.05）。结论高浓度（1 mg/mL）Prx在椎间盘退变过程中起促进退变作用。     

大鼠终板软骨细胞体外自然退变过程中Asporin基因的表达及意义

目的通过大鼠终板软骨细胞体外自然传代的退变模型,探讨大鼠终板软骨细胞体外自然退变过程中Asporin基因的表达及意义。方法取大鼠腰椎终板软骨细胞,酶消化法及自然传代法分离培养大鼠终板软骨细胞,选取P1代及P5代,体外培养6d,在倒置显微镜下观察细胞形态,利用HE染色及甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行观察及鉴定。用RT-PCR及Westernblot检测Ⅱ型胶原、蛋白多糖及Asporin基因变化。结果随着细胞传至P5代,细胞形态上有梭形变趋势,Ⅱ型胶原（P5/P1=0.111767,P=0.009842）及蛋白多糖表达（P5/P1=0.328965,P=0.002371）明显下调,Asporin蛋白表达明显上调。结论终板软骨细胞传至P5代,细胞发生自然退变,Asporin基因表达明显上调,提示Asporin基因表达与终板软骨的退变具有重要联系。     

蛋白酶Caspase-6在腰椎间盘髓核组织中表达的研究

目的 探讨凋亡相关蛋白酶Caspase-6在腰椎间盘退变中的作用.方法 将45例腰椎间盘突出症病人作为手术组,并分为:青年组;中年组;老年组.5例青少年型特发性脊柱侧弯病人作为对照组.对照组标本均为术中所取出L2/3新鲜椎间盘髓核组织;手术组标本均为术中所取出L4/5新鲜椎间盘髓核组织;采用TUNEL法和免疫组织化学S-P法,分别检测腰椎间盘髓核中的凋亡阳性细胞率及Caspase-6的表达情况.结果 青年、中年、老年手术组髓核内TUNEL阳性细胞率分别为(45.71±2.05)％、(53.65±2.93)％、(68.39±4.33)％.对照组髓核内TUNEL阳性细胞率为(17.80±0.62)％.四个组两两之间差异均有统计学意义(P＜0.05).髓核内TUNEL阳性细胞率与年龄呈正相关(P＜0.01).青年、中年、老年手术组髓核内Caspase-6染色阳性细胞率分别为(38.58±1.80)％、(53.19±2.67)％、(62.72±4.65)％.对照组髓核内Caspase-6染色阳性细胞率为(19.32±1.49)％.四个组两两之间差异均有统计学意义(P＜0.05).髓核内Caspase-6染色阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率和年龄之间均呈正相关(P＜0.01).结论 细胞凋亡参与了腰椎间盘退变过程,年龄是细胞凋亡的重要影响因素;腰椎间盘组织细胞凋亡过程有Caspase-6蛋白酶参与调节,Caspase-6的表达上调可能在腰椎间盘退行性变发生和发展中发挥重要作用.     

大鼠增龄过程中髓核组织HSC70的表达及其意义

目的探讨在增龄过程中SD大鼠髓核组织中HSC70的表达及其意义。方法 3月龄、12月龄、24月龄SD大鼠各8只,HE染色检测椎间盘组织的退变情况;RT-PCR法测定髓核组织中HSC70的表达;Western blot检测髓核组织中HSC70的表达。结果大鼠增龄过程可部分反映椎间盘的退变变化;RT-PCR和Western blot均显示HSC70在不同年龄组SD大鼠髓核中均有表达,且24月龄（1.26±0.21;0.56±0.07）表达较3月龄组（1.60±0.30;0.68±0.07）表达明显降低（P〈0.05;P〈0.01）;但与3月龄和24月龄组相比,12月龄组HSC70变化（1.49±0.29;0.61±0.09）无差异（P〉0.05;P〉0.05）。结论 HSC70在椎间盘退变过程中的表达降低,提示HSC70的降低可能与椎间盘退变的发展进程有关。     

前路融合对兔颈椎邻近节段椎间盘的影响

目的探讨前路融合内固定对兔颈椎邻近节段椎间盘的影响。方法60只新西兰白兔随机分4组,每组15只。1组为假手术对照组,余3组为实验组（分别为C34、C45、C56颈椎前路融合内固定组）。术后3、6、9个月每组取5只摄X线片,并取邻近上、下节段椎间盘做组织形态学检查,用免疫组化方法观察纤维环、髓核Ⅰ、Ⅱ型胶原的变化。结果随着时间的推移,实验组的X线片可见手术间隙融合,邻近节段椎体终板硬化;免疫组化结果：髓核中Ⅱ型胶原表达下降,纤维环中Ⅰ型胶原表达增加,随着时间的延长表现更为显著,Ⅰ型胶原有逐渐取代Ⅱ型胶原的趋势,胶原变化在C3-4、C4-5上、下邻近节段差异无统计学意义（P〉0.05）,而C56的下位邻近节段变化重于上位邻近节段,差异有统计学意义（P〈0.05）。实验组6个月与9个月分别与对照组6个月与9个月比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论颈椎前路融合内固定可引起兔颈椎邻近节段的退变,不同水平融合内固定对邻近节段椎间盘的影响不同。     

Morphology of the human vertebral endplate

It is presumed that poor intervertebral disc cell nutrition is a contributing factor in degeneration, and is exacerbated by vertebral endplate sclerosis. Yet, quantitative relationships between endplate morphology and degeneration are unavailable. We investigated how endplate bone microstructure relates to indices of disc degeneration, such as morphologic grade, proteoglycan content, and cell density. Intervertebral core samples [n = 96, 14 subjects, L1–L5 level, ages 35–85 (64 ± 16 years), degeneration grade 1 (n = 4), grade 2 (n = 32), grade 3 (n = 44), grade 4 (n = 10), grade 5 (n = 6)] that included subchondral bone, cartilage endplate, and adjacent nucleus were harvested from human cadaveric lumbar spines. The morphology of the vertebral endplate was analyzed using µCT and the adjacent nucleus tissue was collected for biochemical and cellular analyses. Relationships between vertebral endplate morphology and adjacent disc degeneration were analyzed. Contrary to the prevailing notion, vertebral endplate porosity increased between 50% and 130% and trabecular thickness decreased by between 20% and 50% with advancing disc degeneration (p < 0.05). We also observed that nucleus cell density increased (R² = 0.33, p < 0.05) and proteoglycan content decreased (R² = 0.47, p < 0.05) as the endplate became more porous. Our data suggest that endplate sclerosis is not a fundamental factor contributing to disc degeneration. Rather, the opposite was observed in our samples, as the endplate became progressively more porous with age and degeneration. Since ischemic disc cell behavior is commonly associated with degenerative change, this may be related to other factors such as the quality of vertebral capillaries, as opposed to decreased permeability of intervening tissues. © 2011 Orthopaedic Research Society Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 30:280–287, 2012     

成人腰椎软骨终板的组织学特征

目的探讨健康成人腰椎软骨终板组织学特征。方法选取18具新鲜成人尸体腰椎标本,死亡原因为车祸伤或意外,无腰椎外伤和糖尿病。从8个不同区域取材,制备软骨终板样本,利用高敏感测高仪测量软骨终板厚度,通过显微镜观察经HE染色后终板的组织学特征。结果不同区域软骨终板厚度差异有统计学意义(P 0.05),终板厚度为0.696～1.045 mm,后区下部终板最厚,中央区上部最薄。HE染色结果显示,软骨终板的细胞密度比髓核和纤维环的细胞密度高,软骨终板中央区和侧区的胶原纤维分别比髓核和纤维环组织中的胶原纤维更加紧密。结论腰椎不同区域软骨终板厚度不同,其组织学特征与椎间盘的营养供应相关。     

TGF-β3修饰退变髓核细胞移植修复兔退变椎间盘的效果观察

目的探讨TGF-β3基因修饰后退变髓核细胞生物学效应以及植入兔退变椎间盘后对退变椎间盘的影响。方法将重组腺病毒载体Ad-TGF-β3与第2代退变髓核细胞按10∶1比例混合培养转染(Ad-TGF-β3组),待细胞融合后传代,MTT检测转染细胞增殖活性,Western blot检测TGF-β3蛋白含量,免疫细胞化学染色观察对数生长期转染细胞Ⅱ型胶原染色阳性率;采用病毒空载体转染髓核细胞(Adv组)和未经转染髓核细胞(空白组)作为对照。取30只新西兰兔,体重3.2～3.5 kg,雌雄不限,通过针刺L3、4、L4、5和L5、6椎间盘制备椎间盘退变模型。将实验动物按照随机数字法分为3组,转染细胞组(A组,n=12)、退变细胞组(B组,n=12)和空白对照组(C组,n=6)。A、B组将100μL浓度为1×105个/mL对应细胞悬液注射入退变椎间盘,C组同法注入等量PBS。注射后6、10、14周取A、B组各4只、C组2只实验动物处死,取L3、4、L4、5和L5、6椎间盘行组织学观察,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达。结果 Ad-TGF-β3转染后髓核细胞活性明显改善;转染后3、7、14 d,TGF-β3在髓核细胞内表达逐渐升高;Ad-TGF-β3组髓核细胞细胞质内见棕黄色Ⅱ型胶原阳性染色,阳性率显著高于Adv组及空白组(P<0.05)。组织学观察示,A组椎间盘退变程度较B、C组明显减轻。6、10、14周A组Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达显著高于B、C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TGF-β3基因修饰退变髓核细胞后可明显改善细胞生物活性,转染后髓核细胞植入兔体内可明显增加退变椎间盘的基质分泌。     

The relationship between apoptosis of endplate chondrocytes and aging and degeneration of the intervertebral disc.

STUDY DESIGN: Apoptosis in cervical intervertebral disc cells and cartilaginous endplate cells was examined by the nick end labeling (TUNEL) technique during the process of natural aging and in a mouse experimental spondylosis model. OBJECTIVES: To determine the role of apoptosis in aging and degeneration of intervertebral discs by monitoring chronologic changes in the quantity and localization of apoptotic cells. SUMMARY OF BACKGROUND DATA: Apoptosis occurs within human intervertebral discs, but little is known about the pathologic significance of this process. On the other hand, the cartilaginous endplate is known to decrease in thickness and to disappear with aging and degeneration. The cause of this age-related change remains unclear. METHODS: A mouse spondylosis model was prepared via surgical resection of the posterior spinal element in 12 mice to examine the experimentally induced spondylosis process. Eighteen naturally aged mice were also used to examine the influence of aging. Paraffin-embedded midsagittal sections of the cervical spine were obtained 2, 3, 6, and 12 months after surgery in the spondylosis model and in the age-matched naturally aged mice, as well as in 4-week-old and 18-month-old naturally aged mice. Sections were stained with hematoxylin and eosin, safranin-O, and the TUNEL procedure. The number of apoptotic cells and vital cells were counted in the cartilaginous endplate of the intervertebral disc excluding the growth cartilage, and the degree of disappearance of the cartilaginous endplate was evaluated. RESULTS: Apoptosis, particularly noticeable in the cartilaginous endplate, increased with age and resulted in a marked decrease in cell density. Subsequently, the structure of the cartilaginous endplate began to disappear. Apoptosis was more evident and the structure of the cartilaginous endplate began to disappear more rapidly in the surgically treated group than in the naturally aged group. CONCLUSIONS: TUNEL-positive cells in the cartilaginous endplate increased with age, with destruction of the cartilaginous endplate after apoptosis (TUNEL-positive cell death). The application of the spondylosis model increased the incidence of apoptosis preceding the development of spondylosis. This suggests that apoptosis plays a role in the age-related changes seen in the cartilaginous endplate of the intervertebral disc and in the experimentally induced spondylosis process.