HIV 外膜糖蛋白 gp120 和 gp41 在昆虫细胞中表达及其免疫学特性的评价

将编码完整ｇｐ１２０和完整ｇｐ４１的基因分别克隆到杆状病毒转移质粒中。使用重组转移质粒与野生杆状病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞，经挑选获得分别带有编码ｇｐ１２０和ｇｐ４１基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Ｓｆ９细胞后在细胞中分别表达了ＨＩＶ外膜糖蛋白ｇｐ１２０和ｇｐ４１。其重组蛋白的分子量分别为１２０×１０３和４１×１０３。此重组糖蛋白在免疫荧光、免疫印染和酶联免疫实验中都能被ＨＩＶ阳性血清所识别。动物免疫实验表明此重组糖蛋白能诱导很强的特异性抗体产生。     

Characterization of Neospora caninum Surface Protein NcSRS2 Based on Baculovirus Expression System and Its Application for Serodiagnosis of Neospora Infection

The baculovirus expression system has proved to be a useful tool for the production of recombinant proteins. Here we have characterized the Neospora caninum surface protein NcSRS2 produced by two types of the recombinant virus and also have developed an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using recombinant NcSRS2 for the serologic diagnosis of Neospora infection. Western blot analysis showed two major protein bands that were detectable in insect cells infected with each recombinant baculovirus, and a lower-molecular-weight protein was detected in culture supernatants from a cell infected with the recombinant virus lacking the hydrophobic C-terminal tail. Analysis of the N-terminal amino acids showed that the secreted NcSRS2 lacked 6 kDa of the N-terminal signal peptide. Moreover, the detergent-soluble protein of insect cells infected with the recombinant baculovirus expressing the full-length NcSRS2 gene was used to develop an ELISA system based on specificity and reactivity to antisera against Toxoplasma gondii, Hammondia heydorni, or N. caninum. Anti-N. caninum mouse, dog, and bovine sera recognized the recombinant NcSRS2 on Western blots. Furthermore, we have shown that the developed ELISA system consistently discriminates indirect fluorescent-antibody test (IFAT)-positive bovine sera against N. caninum from IFAT-negative sera. These results indicate that the ELISA using baculovirus-expressed NcSRS2 can be useful for effective and reliable serodiagnosis of N. caninum infection.     

我国D2—43株PrM—E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性研究

目的 通过观察含我国登革2型病毒株（D2－43）的PrM-E基因的复制型SFV重组质粒DNA的免疫原性,为登革新型疫苗的研制提供依据。方法 将PrM-E基因自T载体上切下,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中。将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK21细胞,表达产物的特异性用间接免疫荧光法进行鉴定。采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA,然后以不同剂量通过肌肉注射途径免疫Balb/c鼠,鼠血清中的抗体用间接免疫荧光法进行检测。结果 含PrM-E基因的重组SFV质粒DNA在BHK21细胞中可表达登革2型病毒的特异蛋白;经免疫Balb/c鼠后,鼠血清可与登革D2－43感染的C6／36抗原片起特异的抗原抗体反应。结论 含登革2型病毒PrM-E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb/c鼠中可诱导登革2型病毒特异抗体的产生,但抗体水平较低。     

用杆状病毒系统表达戊型肝炎病毒全长结构基因的研究

目的：获取含有戊型肝炎病毒（HEV）全长结构基因的重组杆状病毒，表达戊型肝炎病毒结构蛋白。方法：将HEV全长结构基因（5147－7126nt）插入杆状病毒表达载体pAcUW51，与线性化杆状病毒DNA（Baculo Gold DNA）共转染Sf9昆虫细胞，挑病毒斑进一步感染Sf9细胞，用SDS－PAGE，Western Blot及免疫荧光检测戊型肝炎病毒结构蛋白的表达及活性。结果：SDS－PAGE分析表明HEV结构基因在杆状病毒系统中高效表达，有相对分子质量约为73000和63000两种形式；Western Blot及免疫荧光检测证明表达产物可与HEV阳性血清特异反应，说明具有HEV特异抗原性。结论：应用杆状病毒表达系统成功表达了HEV结构蛋白。     

SARS-CoV、229E和OC43的抗原相关性研究

目的：分析SARS冠状病毒（SARS—CoV）和人冠状病毒（229E和OCA3）的抗原相关性。方法：制备三株冠状病毒的免疫兔血清及其重组核衣壳（N）蛋白的免疫小鼠血清，分别采用SARS法、Western blot和免疫荧光法对免疫血清进行检测以分析三株冠状病毒的抗原相关性。结果：Westem blot结果显示重组N蛋白免疫小鼠血清仅与各自的冠状病毒或重组N蛋白有特异性反应，相互间无交叉反应，而SARS结果显示OC43重组N蛋白免疫小鼠血清与SARS—CoV、229E N蛋白出现了构象抗体的交叉反应。同时，免疫荧光结果显示SARS—CoV和OCA3免疫兔血清与229E感染细胞存在较明显的交叉反应，但在SARS、Westem blot结果中全病毒免疫兔血清均仅与各自N蛋白特异性反应，相互间无交叉反应。结论：SARS—CoV、229E和OCA3N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应，而SARS—CoV、OC43全病毒免疫血清均和229E出现明显的交叉反应。另外，基因重组的OCA3 N蛋白与另外二种N蛋白出现重组构形表位的交叉反应，提示以基因重组的蛋白作为诊断试剂，可能会因为蛋白的空间构象发生改变而产生非特异性反应。     

重组杆状病毒表达HEV ORF2抗原片段

目的：用重组杆状病毒表达戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV)ORF2基因片段,并对其免疫学特性进行研究。方法：与中间转染载体pVL1393相连构建重组质粒,在Lipofectin介导下将其与杆状病毒线性DNA（BaculoGold^TM)共转染Sf9昆虫细胞得到重组病毒,用免疫荧光,Western blot等方法对表达产物进行免疫学特性初步研究,并进行动物免疫试验。结果：含ORF2结构基因片段的重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中获得了高效表达,经免疫荧光,Western blot,动物免疫试验证实该重组蛋白为HEV特异性蛋白,可刺激机体产生相应抗体。结论：重组杆状病毒能有效表达HEV抗原基因,所表达的ORF2重组蛋白具有HEV抗体识别的抗原表位,具有较好的抗原性和免疫原性。     

人Cosmc 胞外段蛋白在昆虫细胞Sf-9 中的表达与纯化研究

目的:利用昆虫细胞Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统表达人Cosmc 胞外段蛋白,为体外研究Cosmc 蛋白的结构和功能奠定基础,同时也为O-连接糖基化及相关疾病的研究提供思路。方法:采用Bac-to-Bac 系统,构建重组转移质粒pFastBac1-Cosmc extracellular domain(pFastBac1-Cosmc ED),转化到含穿梭载体Bacmid 的感受态细胞DH10Bac 中,通过蓝白斑筛选和PCR 鉴定,获得重组转座子rBacmid-Cosmc ED。在脂质体介导下,重组病毒感染Sf-9 无血清细胞,在Sf-9 中表达Cosmc 胞外段蛋白,由于Cosmc N 端加有昆虫细胞信号肽HBM(Honey Bee Melittin)且不含有跨膜段,所以Cosmc 胞外段蛋白表达后分泌到培养基上清中,通过SDS-PAGE 和Western blot 对表达产物进行检测,并通过Ni-NTA 亲和层析柱对其进行纯化分析。结果:SDS-PAGE 和Western blot 分析显示得到一条分子量约为33 kD 的特异性条带,与目的蛋白大小相符,质谱结果进一步证明所得蛋白为Cosmc 胞外段蛋白。结论:Sf-9 细胞中可成功表达Cosmc 胞外段蛋白,为进一步研究Cosmc 的结构和功能奠定基础。     

SETD4蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒系统的表达

目的　通过昆虫杆状病毒表达系统表达SETD4（SET domain-containing 4）蛋白,并纯化SETD4蛋白,为深入探讨SETD4的功能奠定基础。 方法　提取小鼠正常肝组织的RNA,通过RT-PCR扩增SETD4基因,并克隆至pFastBac-HTB构建重组载体,再转座获得重组杆粒;通过脂质体介导将重组杆粒转染SF9细胞产生重组病毒,扩增病毒感染细胞并获得重组蛋白;利用Ni2+亲和柱来纯化蛋白,并通过Western Blot及考马斯亮蓝染色鉴定SETD4蛋白。 结果　经双酶切鉴定及测序证实SETD4基因插入了供体质粒;经PCR鉴定证实SETD4基因插入了穿梭载体;经考马斯亮蓝染色证实纯化得到重组蛋白,用His-Tag抗体和SETD4特异性抗体在50 kD处可检测到目的条带。 结论　成功利用昆虫杆状病毒表达系统够表达了SETD4,并纯化了SETD4。     

HIV-1 膜蛋白基因片段杆状病毒转移载体克隆及重组体的构建

目的：构建编码HIV－1外膜糖蛋白的gp120和gp41基因杆状病毒转移载体，并在昆虫细胞中表达gp120和gp41重组蛋白。方法：从HIV－1基因克隆PNL4－3（NY5／LAV）中应用聚合链反应扩增目的基因gp120和gp41，克隆到PGEM－T载体中，限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定目的基因，再经EcoRI和BamHI双酶切后定向克隆到杆状病毒转移载体PAC－SecG2T中，再次测序鉴定。通过在sf9昆虫细胞中同源重组、空斑筛选、病毒鉴定、SDS－PAGE、Western-blot对重组病毒和重组蛋白进行分析。结果：限制性内切酶酶切和DNA序列分析表明，gp120和gp41正确克隆到杆状病毒转移载体PACSecG2T中；SDS－PAGE和Eestern-blot结果表明在昆虫细胞中成功表达了HIV外膜糖蛋白gp120和gp41。结论：成功构建了PACSecG2T-gp120和PACSecG25-gp41杆状病毒转移载体，并在杆状病毒－昆虫细胞表达系统中表达了HIV－1 gp120和gp41重组蛋白，Western-blot证明具有较好的免疫原性。     

SARS病毒N蛋白的表达与DNA疫苗的构建

目的：在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒核衣壳N蛋白，并构建其DNA疫苗。方法：构建含N基因的原核表达载体pQEN，并在大肠杆菌M15中表达N蛋白。采用NP亲和层析法纯化目的蛋白。将N基因克隆入真核表达载体pSecTagB中，构建真核重组质粒pSecN。以其免疫小鼠制备抗血清，并用ELISA法检测其与大肠杆菌中表达的重组N蛋白及天然全病毒N蛋白的反应性。结果：重组N蛋白能与DNA疫苗免疫的小鼠血清以及SARS患者血清发生特异性反应；SARS—CoV病毒颗粒也可与DNA疫苗免疫的小鼠血清发生特异性反应。结论：重组N蛋白保留了病毒的一些特异性抗原表位，可作为用ELISA法检测SARS—CoV的抗原。构建的DNA疫苗可在小鼠体内产生高效价的抗SARS病毒N蛋白的特异性抗体，从而为该疫苗的开发奠定了基础。     

Expression of SARS coronavirus nucleocapsid protein and construction of its DNA vaccine]

AIM: To express the nucleocapsid (N) protein of SARS coronavirus (SARS-CoV) in E. coli and construct its DNA vaccine. METHODS: The prokaryotic expression vector pQEN containing N gene was constructed and transformed into the E. coli. The recombinant N protein was then expressed and purified by Ni(2+)-NTA affinity resin. In addition, the N gene was cloned into the eukaryotic expression plasmid pSecTagB and the eukaryotic recombinant expression vector pSecN was obtained. The DNA vaccine pSecN was injected to immunize the BALB/c mice to produce the antiserum against N protein of SARS-CoV. Subsequently, the reactivity of the antiserum with recombinant N protein and SARS-CoV particles was assayed by ELISA. RESULTS: Recombinant N protein reacted strongly and specifically with the sera from immunized mice and SARS patients. Similarly, the sera of immunized mice could also react specifically with SARS-CoV particles. CONCLUSION: The recombinant N protein could be used as a good antigen to detect SARS. The DNA vaccine pSecN could also efficiently induce the production of IgG against N protein of SARS-CoV, which offered clues to the development of a potential DNA vaccine.     

一株变异SARS冠状病毒N蛋白的原核表达及活性测定

目的 :克隆编码严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS CoV)N蛋白的DNA ,构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并诱导表达。方法 :采用RT PCR方法从病毒培养液中获得N基因片段 ,并克隆入T EASY载体中。经PCR、双酶切鉴定后 ,测序。将N蛋白基因序列定向插入原核表达载体pGEX 2T中 ,表达融合蛋白。用表达产物与抗SARS CoV抗体阳性血清做Westernblot。结果 :N蛋白DNA测序的结果与GenBank比对缺失 2 0个bp。GST N融合蛋白以可溶形式表达。Westernblot检测表明 ,其与抗SARS CoV抗体阳性血清的反应呈阳性。结论 :成功地构建原核表达质粒pGEX 2T/N ,并表达GST N融合蛋白 ,为下一步的研究奠定了基础。     

人睾丸精子结合蛋白-His6融合蛋白在真核细胞中的表达及亲和纯化

目的:构建含有人睾丸精子结合蛋白基因(testisspermbindingprotein,tsbp)的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp,并进行表达和纯化。方法:以克隆有tsbp全长cDNA序列的原核表达载体pGEX5X1/tsbp为模板,用PCR扩增tsbp,并通过DNA重组构建真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体稳定转染HEK293细胞后,应用RTPCR、Westernblot和细胞免疫荧光技术检测His6tsbp融合蛋白的表达。选择高表达量的细胞克隆,扩增并用Ni2 NTA金属亲和层析柱(IMAC)从细胞裂解液中纯化融合蛋白His6tsbp,纯化产物的纯度用SDSPAGE和Westernblot进行鉴定。结果:成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp。以重组体转染HEK293细胞后,用RTPCR检测到tsbpmRNA的表达。细胞免疫荧光染色呈阳性反应,Westernblot检测到培养细胞中有融合蛋白His6tsbp的表达。经Ni2 NTA金属亲和层析柱分离纯化,得到纯化的重组蛋白His6tsbp。结论:构建了pcDNA3.1/mycHis(-)B/tsbp真核表达载体,并在HEK293细胞中表达和亲和层析纯化,为下一步的研究奠定了基础。     

麻疹病毒血凝素和融合蛋白基因的克隆与表达及其重组蛋白的免疫学评价

采用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法从麻疹病毒Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株基因组中扩增出血凝素Ｈ基因和融合蛋白Ｆ基因，并利用转移质粒将这两个基因分别重组到杆状病毒多角体蛋白启动子（ＰＨ）控制之下，获得重组病毒ｖＢＭＶＨ和ｖＢＭＶＦ。重组杆状病毒感染Ｓｆ９昆虫细胞，表达的重组蛋白分别具有血凝、血溶活性。红细胞吸附抑制试验、免疫印迹、酶联免疫试验结果显示重组蛋白在生物学、生化学特性与天然蛋白类似，并能被天然麻疹免疫血清（人、鼠、兔）所识别。动物实验表明，重组蛋白具有诱生中和抗体的能力。重组血凝素免疫血清还具有血凝抑制抗体活性。这些结果说明杆状病毒－昆虫细胞体系表达的麻疹病毒血凝素和融合蛋白具有较好的生物学活性及免疫原性和抗原性。     

Functional characterization of partially purified Epstein-Barr virus DNA polymerase expressed in the baculovirus system

The DNA polymerase gene of Epstein-Barr virus (EBV) was cloned into baculovirus transfer vector (pBlueBac). The recombinant baculovirus (AcEBP-15) was obtained by cotransfection ofSpodoptera frugiperda (Sf9) cells with infectious DNA fromAutographa californica multiple nuclear polyhedrin virus (AcMNPV) and pBlueBac plasmid carrying EBV polymerase gene. Infection of Sf9 cells with the recombinant virus produced substantial quantities of the EBV DNA polymerase protein of the expected size (110 kD). The identity of the EBV polymerase 110-kD polypeptide was determined by (a) immunoprecipitation and Western blot analyses with rabbit polyclonal antiserum specific for a synthetic peptide derived from the coding sequence of the polymerase gene; (b) identification of a polypeptide of identical size (110 kD) from EBV-infected cells; (c) measurement of DNA polymerase activity similar to that of the enzyme induced in EBV-infected cells; and (d) neutralization of the enzymatic activity by the rabbit antiserum and inhibition by phosphonoacetic acid. Our results indicate that the baculovirus expression system provides large quantities of functional polymerase suitable for biochemical and structural analyses, thereby furthering our understanding of the mechanism of viral DNA replication and its inhibition by antiviral drugs.     

弓形虫ROP2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :构建弓形虫棒状体蛋白 (ROP2 )基因重组质粒并在大肠杆菌中表达 ,用于筛选弓形虫新的诊断抗原和疫苗分子。方法 :根据ROP2基因已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出ROP2基因片段 ,再克隆到pGEX 4T 1质粒 ,重组质粒经酶切及PCR鉴定 ,而后进行测序 ;重组质粒在大肠杆菌BL2 1 (DE3)中进行ITPG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE及WesternBlot分析。结果 :ROP2基因PCR产物大小与预期相符 ,约 1 0 4 3bp ,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合 ;SDS PAGE及免疫印迹显示ROP2融合蛋白表观分子量约为 5 5kDa ,表达产物约占菌体总蛋白1 7% ,具有一定的免疫反应性。结论 :克隆并表达了弓形虫ROP2基因 ,为下一步弓形虫诊断及疫苗研究奠定了基础     

TP47蛋白在梅毒血清学诊断中的应用

目的采用原核基因工程技术重组表达梅毒螺旋体TP47蛋白,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法PCR扩增获得TP47基因片段并构建pET28b-TP47原核表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导蛋白质表达。经镍柱纯化后通过质谱技术进行鉴定。采用免疫印迹法测定其与梅毒患者血清的免疫反应性。建立基于重组TP47抗原的ELISA间接法并对30份TPPA阳性血清和75份TPPA阴性血清进行方法学验证。结果PCR扩增获得约1．1kb的基因片段,成功构建原核表达载体pET28b-TP47。重组蛋白在细菌中以包涵体形式表达,约占菌体蛋白含量的70％,分子量约39000Mr,经纯化后其纯度约95％。经质谱分析表明重组蛋白为TP47蛋白。免疫印迹法证实TP47蛋白能够与梅毒患者血清发生特异性反应,ELISA测定TPPA阳性血清和阴性血清的符合率分别为97％（29／30）和97％（73／75）。结论通过DNA重组技术成功获得了梅毒螺旋体TP47蛋白,证实其与梅毒阳性血清具有良好的反应性,为研发新一代梅毒感染诊断试剂盒奠定了基础。     

法桐花粉主要过敏原基因Pla a1重组表达及鉴定

目的:表达、纯化和鉴定法国梧桐花粉主要变应原基因Platanus acerifolia pollen allergen1(Pla a1)。方法:首先根据文献查找并在GenBank获取法国梧桐花粉主要变应原基因序列Pla a1,利用DNAStar软件进行密码子优化;合成全基因;将Pla a1与载体pET-44a连接后转入大肠杆菌Rosetta中进行诱导并优化目的蛋白表达;利用亲和层析法纯化该外源表达蛋白;应用Western blot,利用法桐花粉过敏患者血清鉴定纯化后的目的蛋白的抗原性。结果:成功构建了pET44a-Pla a1阳性质粒;获得了法桐花粉主要变应原重组蛋白Pla a1;对该重组蛋白进行了亲和层析纯化;免疫印记法表明重组蛋白具有一定的抗原性。结论:首次利用密码子优化的方法获得融合Strep TagⅡ的法桐花粉过敏原重组蛋白Pla a1,为制备高纯度变应原、重组低致敏过敏原及变应原核酸疫苗奠定基础。     

汉滩病毒囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端在昆虫细胞中的融合表达

目的：在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，融合表达汉滩病毒的囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端。方法：构建含有汉滩病毒G2S0．7嵌合基因的表达载体pFBDHTa—G2S0．7，并转化DH10Bac感受态菌。利用其含有的细菌Tn7转座系统，将嵌台基因重组至杆状病毒穿梭质粒hacmid中，并筛选含有G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒，在昆虫细胞中表达该融合蛋白。对表达产物用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹进行检测。结果：构建了的含G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒，感染昆虫细胞后，可表达相应大小的融合蛋白。该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别。结论：利用杆状病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0．7，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的：原核表达呼吸道合胞病毒（RSV）非结构NSl蛋白,并对其免疫特性进行研究。方法采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a（＋）载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Westernblot法鉴定抗体的特异性。结果重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确．经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达．表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42000Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Westernblot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15000Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带。结论NSl基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应。