11β—HSD控制糖皮质激素对睾酮合成抑制的研究——11β—HSD mRNA的表达

已往的研究发现,大鼠Leydig细胞中的11β－羟类固醇脱氢酶（11β－HSD）通过控制细胞内皮质酮（大鼠体内的糖皮质激素）浓度调节睾酮合成。本研究通过观察11β－HSD活性可调的大鼠动物模型中Leydig细胞内11β－HSD mRNA的表达情况,以明确这些表达是否和酶活性测定结果具有一致性。结果表明,大鼠Leydig细胞中的11β－HSD mRNA的表达量和其酶活性水平具有明显的一致性。在大鼠体内,生理水平或高浓度的皮质酮调节Leydig细胞中11β－HSD活性是通过调节细胞中稳定性mRNA的表达实现的。     

激素调节大鼠间质细胞中11β—羟类固醇脱氢酶活性

糖皮质激素（大鼠体内是皮质酮）抑制睾丸间质细胞中睾酮合成。１１β－羟类固醇脱氢酶（１１β－ＨＳＤ）通过控制细胞内糖皮质激素浓度调节睾酮合成,并且其活性又能被大鼠内源性皮质酮诱导,由此保护了间质细胞中睾酮的生物合成,使之免于受到糖皮质激素的过度抑制。本研究旨在观察大鼠间质细胞中受１１β－ＨＳＤ调节的两种激素———皮质酮和睾酮是否对培养的大鼠间质细胞中１１β－ＨＳＤ活性及其ｍＲＮＡ表达具有调节作用。结果表明,皮质酮能增加切除肾上腺大鼠培养的间质细胞中１１β－ＨＳＤ氧化酶活性及其ｍＲＮＡ表达。睾酮则明显抑制培养的大鼠间质细胞中１１β－ＨＳＤ氧化酶活性及其ｍＲＮＡ表达。     

大鼠内源性糖皮质激素对间质细胞功能的影响

本文旨在评价大鼠体内糖皮质激素（大鼠体内是皮质酮）对间质细胞中睾酮合成和１１－β羟类固醇脱氢酶（１１β－ＨＳＤ）活性的影响。为观察内源性皮质酮对间质细胞中睾酮合成的影响，本文测定了切除肾上腺雄性大鼠（４５天龄）血清皮质酮、睾酮，ＬＨ含量和经ＬＨ刺激的纯化间质细胞中睾酮生成量及纯化间质细胞中１１β－ＨＳＤ活性水平。结果表明，切除肾上腺后大鼠血清睾酮水平高于手术对照组及切除后补充皮质酮大鼠。切除肾上腺后大鼠和切除后补充皮质酮大鼠血清ＬＨ水平均无明显变化，表明在上述二实验组中，由于内源性皮质酮变化而导致的间质细胞中睾酮生成的变化不依赖ＬＨ的存在。切除肾上腺后大鼠其纯化的间质细胞睾酮生成量比对照组增加一倍。但经补充皮质酮后睾酮生成量被抑制到对照组水平以下，表明给切除肾上腺后大鼠补充皮质酮能明显地抑制睾酮生成。切除肾上腺后大鼠间质细胞中１１β－ＨＳＤ活性降低，并且这一降低可经补充皮质酮得到恢复。上述结果表明生理性浓度皮质酮对间质细胞中睾酮合成行使直接的负性控制，同时诱导细胞内１１β－ＨＳＤ活性，由此保护间质细胞中睾酮合成免于受到糖皮质激素的过度抑制。     

大鼠间质细胞11β—羟类固醇脱氢酶mRNA的表达

间质细胞中１１β－羟类固醇脱氢酶通过控制细胞内糖皮质激素浓度调节睾酮合成。大鼠出生后２６天内，其未成熟间质细胞不含１１β－ＨＳＤ，随着间质细胞成熟，１１β－ＨＳＤ逐渐产生，成年大鼠间质细胞中１１β－ＨＳＤ活性最高。１１β－ＨＳＤ控制着间质细胞中糖皮质激素浓度，生理浓度糖皮质激素同样调节着１１β－ＨＳＤ活性水平。本研究观察了三个不同年龄组大鼠和切除肾上腺后及切除后补充皮质酮大鼠，间质细胞中１１β－Ｈ     

大鼠间质细胞中11β-羟类固醇脱氢酶mRNA的表达

间质细胞中１１β－羟类固醇脱氢酶（１１β－ＨＳＤ）通过控制细胞内糖皮质激素（大鼠体内是皮质酮）浓度调节睾酮合成。大鼠出生后２６天内，其未成熟间质细胞不含１１β－ＨＳＤ，随着间质细胞成熟，１１β－ＨＳＤ逐渐产生，成年大鼠间质细胞中１１β－ＨＳＤ活性最高。１１β－ＨＳＤ控制着间质细胞中糖皮质激素浓度，生理浓度糖皮质激素同样调节着１１β－ＨＳＤ活性水平。本研究观察了三个不同年龄组大鼠和切除肾上腺后及切除后补充皮质酮大鼠，间质细胞中１１β－ＨＳＤｍＲＮＡ表达情况，发现：出生２１天大鼠间质细胞中无１１β－ＨＳＤｍＲＮＡ的表达，４５天大鼠有１１β－ＨＳＤｍＲＮＡ表达，９０天大鼠表达量最大，切除肾上腺后大鼠间质细胞中１１β－ＨＳＤｍＲＮＡ表达降低，切除后经皮质酮补充大鼠１１β－ＨＳＤｍＲＮＡ表达量回复到对照组水平。结果表明三个不同年龄组大鼠间质细胞中１１β－ＨＳＤｍＲＮＡ表达情况和以往采用免疫组织化学及生物化学方法测定抗原含量或酶活性的结果是一致的。内源性及生理浓度的皮质酮对１１β－ＨＳＤｍＲＮＡ表达的调节也表现出类似的一致性     

大鼠内源性糖皮质激素对间质细胞功能的影响

本文旨在评价大鼠体内糖皮质激素（大鼠体内是皮质酮）对间质细胞中睾酮合成和１１－β羟类固醇脱氢酶（１１β－ＨＳＤ）活性的影响，为观察内源性皮质酮对间质细胞中睾酮合成的影响，本文测定了切除肾上腺雄性大鼠（４５天龄）血清皮质酮睾酮，ＬＨ含量和经ＬＨ刺激的纯化间质细胞中质酮生成量及纯化间质细胞中１１β－ＨＳＤ活性水平，结果表明，切除肾上腺后大鼠血清睾酮水平高于手术对照组及切除后补充皮质酮大鼠。切除肾上腺后     

皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡中caspase-3活化途径的研究

目的我们新近的研究表明，超生理剂量的皮质酮（大鼠体内的糖皮质激素）可通过激活caspase-3诱导大鼠Leydig细胞凋亡。本研究拟评价在皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡过程中，caspase-3的激活是否有其上游的caspase-8平和 caspase-9的参与。方法采用荧光分光光度法榆测经皮质酮处理的大鼠Leydig细胞中caspase-8活性，以DNA梯状电泳条带作为评价细胞凋亡的指标，观察caspase-8抑制剂是否能够抑制细胞凋亡，采用RTPCR枪测皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞中caspase-9的mRNA水平。结果在皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞中出现caspase-8活性增高，以12h最为址著，升高的caspase-8的活性可被caspase-8抑制剂抑制，并导致Leydig细胞的凋亡过程被阻断。Leydig细胞中caspase-9的mRNA水平在皮质酮作用下上升，同样以12h最为显著。结论皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞调亡与caspase-8和caspase-9有关。     

大鼠间质细胞中11β—羟类固醇脱氢酶特性的研究

糖皮质激素经受体介导对间质细胞中睾酮合成行使直接的抑制作用。间质细胞中１１β－羟类固醇脱氢酶（１１β－ＨＳＤ）通过控制细胞内糖皮质激素浓度调节睾酮合成。至今，已鉴定了两种１１β－ＨＳＤ同工酶，Ｉ型从肝脏中纯化，是以ＮＡＰＤ（Ｈ）为辅酶的氧化还原酶。从肾脏纯化的Ⅱ型，是依赖ＮＡＤ的氧化酶。有关间质细胞中１１β－ＨＳＤ的研究，尤其对其特性的研究尚不深入。本研究通过测定间质细胞中Ｉ型１１β－ＨＳＤ抗原及     

Cox7a2对睾酮合成及StAR、P450scc和3β-HSD蛋白表达影响研究

目的研究Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leyidg细胞中过农达对LH诱导的睾酮合成及对StAR(睾酮合成调节关键蛋白),P450scc(胆同醇侧链裂解酶),3β—HSD(3β-羟基甾脱氢酶)蛋白表达的影响。方法构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3小鼠睾丸Leydig细胞,融合蛋白表达及LH诱导刺激后,ELISA测定细胞上清液中睾酮含量,Western blot检测StAR蛋白、P450scc和3β-HSD酶的表达变化。结果Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中过表达抑制LH诱导的睾酮合成,降低StAR蛋白的表达,对P450scc和3β-HSD的蛋白表达没有明显影响。结论在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中,Cox7a2至少通过抑制类固醇快速调节蛋白StAR的表达,进而抑制LH诱导的睾酮合成。     

大鼠间质细胞中11β-羟类固醇脱氢酶特性的研究

糖皮质激素经受体介导对间质细胞中睾酮合成行使直接的抑制作用。间质细胞中１１β－羟类固醇脱氢酶（１１β－ＨＳＤ）通过控制细胞内糖皮质激素浓度调节睾酮合成。至今，已鉴定了两种１１β－ＨＳＤ同工酶，Ⅰ型从肝脏中纯化，是以ＮＡＤＰ（Ｈ）为辅酶的氧化还原酶。从肾脏纯化的Ⅱ型，是依赖ＮＡＤ的氧化酶。有关间质细胞中１１β－ＨＳＤ的研究，尤其对其特性的研究尚不深入。本研究通过测定间质细胞中Ⅰ型１１β－ＨＳＤ抗原及其ｍＲＮＡ表达，观察间质细胞中该酶的优势辅酶，纯化的活间质细胞中１１β－ＨＳＤ催化反应类型及间质细胞１１β－ＨＳＤ对糖皮质激素调节的反应等几个方面来评价间质细胞中１１β－ＨＳＤ的特性。结果发现，间质细胞显示Ⅰ型１１β－ＨＳＤ抗原及其ｍＲＮＡ的表达（ＲＴ－ＰＣＲ产物，６９６ｂｐ），未见有Ⅱ型ｍＲＮＡ表达。间质细胞中该酶是以ＮＡＤＰ（Ｈ）为优势辅酶（Ｐ＜０．０５），以氧化反应为优势的氧化还原酶（Ｐ＜０．０５）。切除肾上腺后大鼠其纯化的活间质细胞及培养的间质细胞１１β－ＨＳＤ氧化酶活性受糖皮质激素调节（Ｐ＜０．０５）。本研究表明，大鼠间质细胞中１１β－ＨＳＤ是一个以催化氧化反应为优势，以ＮＡＤＰ（Ｈ）为辅酶的Ⅰ型同工酶，     

非酶糖基化终末产物抑制大鼠睾丸Leydig细胞睾酮的生成

目的:研究非酶糖基化终末产物受体(RAGE)在大鼠睾丸Leydig细胞上的表达及非酶糖基化终末产物(AGEs)对大鼠睾丸Leydig细胞睾酮合成的抑制作用。方法:原代培养大鼠睾丸Leydig细胞,RT-PCR和免疫荧光技术检测RACE在大鼠Leydig细胞上表达,不同浓度AGEs处理Leydig细胞(25、50、100、200μg/ml),ELISA法测定睾酮分泌量。结果:RT-PCR和免疫荧光结果表明RAGE在大鼠睾丸Leydig细胞上表达,不同浓度AGEs处理后,人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导的Leydig细胞睾酮合成量呈剂量浓度依赖性下降,与对照组相比,50、100、200μg/ml AGEs处理组差异显著(P0.01)。结论:大鼠Leydig细胞上存在RAGE受体,AGEs显著抑制原代培养大鼠Leydig细胞睾酮的分泌。     

皮质酮诱导大鼠Leydig细胞凋亡是一经caspase-3激活的过程

目的 超生理剂量的皮质酮(大鼠体内的糖皮质激素)能诱导大鼠Leydig细胞凋亡。但有关皮质酮诱导Leydig细胞凋亡的细胞内机制尚不清楚。本研究旨在观察皮质酮是否经caspase-3激活的途径诱导大鼠Leydig细胞凋亡。方法 采用Western Blot方法检测不同时间点上经皮质酮处理的大鼠Leydig细胞中caspase-3酶原及裂解的caspase-3酶表达情况。运用荧光发光法检测不同时间点上经皮质酮处理的人鼠Leydig细胞中caspase-3酶活性。结果 caspase-3酶原表达水平在皮质酮处理6h时开始上升，12h及24h时表达量下降，而具生物活性的、裂解的caspase-3酶于12h时开始出现，24h时的表达水平最为显著。caspase-3酶活性在皮质酮处理12h时明显升高，以24h时最为显著。Caspase-3抑制剂DEVD-CHO对经皮质酮处理12、24及48h的Leydig细胞中的caspase-3酶活性均具有明显的抑制作用，加caspase-3抑制剂的处理组其细胞基因组DNA电泳未见有凋亡特征性的梯状条带。结论 皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡是一经caspase-3激活的过程。     

Ca2+和CaN凋亡信号通路参与皮质酮诱导的Leydig细胞凋亡中FasL的表达

目的观察在皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡中,Ca2 和钙调神经磷酸酶(CaN)依赖的信号通路是否参与FasL表达的调控。方法利用钙定性探针Fluo-3/AM检测皮质酮作用下的Leydig细胞中Ca2 浓度变化。通过酶底物法测定CaN活性。以Westernblot检测FasL表达。用Annexin-Ⅴ-FITC和PI双标评价Leydig细胞凋亡率。结果经超生理剂量皮质酮处理的Leydig细胞中出现Ca2 浓度升高,CaN活性增加及FasL表达增加。环孢菌素A可抑制CaN活性,使FasL表达下调,细胞凋亡率下降。结论Ca2 和CaN依赖的信号通路参与了皮质酮诱导的大鼠Leydig细胞凋亡;CaN介导了由Ca2 引发的FasL表达,Ca2 和CaN在大鼠Leydig细胞凋亡过程中起重要作用。     

邻苯二甲酸单乙基己基酯对原代培养大鼠睾丸Leydig细胞睾酮合成的影响

目的:探讨邻苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)的代谢产物邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)对SD大鼠体外培养睾丸间质细胞(Leydigcells)睾酮合成的影响。方法:建立SD大鼠睾丸Leydig细胞体外原代培养模型,MEHP染毒剂量组分为对照(0μmol/L)、62.5、125、250、500、1000μmol/L,通过噻唑蓝(MTT)法观察线粒体活性,放射免疫法测定睾酮浓度,RTPCR法测定Leydig细胞类固醇合成急性调节蛋白(StAR)mRNA表达。结果:MEHP染毒24h后,Leydig细胞线粒体活性在250μmol/L时显著上升,1000μmol/L时显著下降,与对照组比较,差异均有显著性(P<0.01)。基础状态及人绒毛膜促性腺激素(hCG)刺激状态下,Leydig细胞睾酮合成水平均呈上升趋势,与对照组相比,250、500μmol/L剂量组差异均有显著性(P<0.01)。Leydig细胞StARmRNA的表达在62.5、125、250μmol/L时与对照组相比均未见有显著性改变,在500、1000μmol/L时显著下降(P<0.01)。结论:MEHP直接影响原代培养Leydig细胞线粒体活性及睾酮合成,胆固醇跨膜转运的调节因子StAR与MEHP引起睾酮合成上升的原因可能无关。     

严重烫伤对睾丸间质细胞影响的实验研究

采用大鼠３０％Ⅲ度烫伤模型，应用光镜、电镜、３β－羟甾脱氢酶（３β－ＨＳＤ）组织化学染色及其相对活性的测定和血清睾酮及黄体生成素（ＬＨ）浓度的检测，分不同时相对严重烫伤后３０天内大鼠睾丸间质细胞的改变进行了动态观察。结果表明，烫伤后睾丸间质细胞有不同程度的变性、坏死；间质细胞内３β－ＨＳＤ活性迅速降低，伤后３０天仍保持较低水平；血清睾酮水平迅速下降，并持续维持较低水平，伤后３０天仍不回升，而血清ＬＨ浓度无明显改变。提示烫伤后血清睾酮下降的机理可能与睾丸间质细胞的受损及糖皮质激素升高有关。     

大鼠睾丸间质细胞体外培养不同时间3β-羟基类固醇脱氢酶的表达

目的探讨通过差速贴壁法获得的7天龄、3周龄大鼠睾丸间质内细胞的细胞群体构成、体外培养不同时间3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）的表达水平变化,以及细胞睾酮分泌功能变化。方法联合应用胶原酶消化、不锈钢滤网过滤及差速贴壁法获得7天龄、3周龄雄性Wistar大鼠睾丸间质组织内细胞,贴壁细胞以DMEM/F12培养液培养,分别对原代培养2h、4d细胞进行3β-HSD免疫化学染色及流式细胞分析,原代培养细胞同时给予人绒毛膜促性腺激素（HCG）刺激,测定HCG刺激组和非刺激组各代细胞培养液上清中睾酮水平及其对HCG刺激的反应。结果7天龄、3周龄鼠差速贴壁法获得的睾丸间质内细胞群经流式细胞鉴定,3β-HSD阳性细胞所占比例分别为（5.4±1.2）%、（59.2±3.2）%;培养4d后,两组3β-HSD阳性细胞比例分别为（93.6±1.2）%、（95.4±3.2）%。两组原代培养细胞均有睾酮生成功能,在HCG刺激下睾酮分泌均明显上升,7天龄组培养细胞睾酮分泌高峰迟于3周龄组。结论差速贴壁法获得的7天龄、3周龄大鼠睾丸间质细胞群中均含有部分Leydig干细胞（Stem Leydig cells,SLCs）,SLCs在体外培养过程中逐渐分化,表达3β-羟基类固醇脱氢酶,并产生睾酮。     

养精胶囊通过调控StAR启动子促进睾酮合成的研究

目的探讨养精胶囊促进睾丸间质(Leydig)细胞合成睾酮(T)功能的具体作用机制。方法在Leydig细胞(MLTC-1细胞系)中加入不同剂量养精胶囊提取液24 h后,用化学发光法检测细胞上清T浓度;用免疫荧光显微镜分析类固醇快速调节蛋白(StAR)的表达情况;用RT-PCR及Western blot法测StAR mRNA及蛋白质的表达;用双荧光素酶报告基因实验检测StAR启动子的活性。结果低、中、高剂量养精胶囊提取液作用24 h后,均可以促进MLTC-1细胞合成睾酮的功能;养精胶囊提取液可以促进MLTC-1细胞StAR免疫荧光的表达;养精胶囊提取液可以促进MLTC-1细胞StAR mRNA和蛋白质的表达;养精胶囊提取液可以提高MLTC-1细胞中StAR启动子的活性。结论养精胶囊能通过调控Leydig细胞中StAR启动子的活性,促进StAR mRNA和蛋白的表达,进而提高睾酮合成的功能。     

雄蚕益肾方对LOH大鼠Leydig细胞胆固醇转运蛋白、睾酮合成酶和SF-1表达的影响

目的:探讨雄蚕益肾方对LOH大鼠Leydig细胞胆固醇转运蛋白、睾酮合成酶和SF-1表达的影响。方法:25只18月龄雄性SD大鼠随机均分为模型组、丙酸睾酮组、雄蚕益肾方-低、中、高剂量组,2月龄雄性SD大鼠5只设为正常组。雄蚕益肾方-低、中、高剂量组分别给予10.4、20.8、41.6 g/(kg·d)体重剂量的雄蚕益肾方配方颗粒剂灌胃;丙酸睾酮组大鼠肌注5.21 mg/(kg·d).体重剂量的丙酸睾酮,每周3次;正常组和模型组给予相同体积的蒸馏水灌胃,均连续28 d。实验结束后取睾丸组织进行Western印迹检测StAR、TSPO、CYP11A1、HSD3B7、HSD17B4和SF-1蛋白表达。结果:模型组大鼠睾丸组织StAR、TSPO、CYP11A1、HSD3B7、HSD17B4蛋白和SF-1表达均显著低于正常组(P<0.05);与模型组相比,雄蚕益肾方-低、中、高各剂量组大鼠睾丸组织StAR、TSPO、CYP11A1、HSD3B7、HSD17B4蛋白和SF-1显著增高(P<0.05)。结论:雄蚕益肾方能上调LOH大鼠睾丸组织胆固醇转运蛋白(StAR、TSPO)、睾酮合成酶(CYP11A1、HSD3B7、HSD17B4)以及上游转录因子SF-1表达水平,可能是其干预LOH的机制之一。     

自噬信号因子P70S6K参与Cox7a2调控睾酮生成机制研究

目的:研究Cox7a2对TM3 Leydig细胞睾酮生成的影响以及涉及其中的自噬调控信号的作用。方法:构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3 Leydig细胞。ELISA测定睾酮水平,Western印迹检测Cox7a2对睾酮合成快速调节蛋白StAR表达和自噬调控因子P70S6K磷酸化水平的影响。结果:在TM3 Leydig细胞中,LH刺激能增加促进StAR蛋白表达,增加睾酮合成水平。Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中抑制P70S6K磷酸化水平,降低StAR蛋白的表达,进而抑制LH诱导的睾酮合成。结论:Cox7a2通过抑制快速调节蛋白StAR的表达减少LH诱导的睾酮分泌,这至少和Cox7a2抑制自噬调控因子P70S6K有关。     

Cox7a2通过ROS调控睾丸Leydig细胞睾酮生成的研究

目的 研究Cox7a2调控睾酮牛成的影响及其机制.方法 构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3小鼠睾丸Leydig细胞.ELISA法测定上清液中睾酮含量,Western blot检测类固醇合成快速调节蛋白StAR表达,荧光分光光度计检测ROS水平.结果 Cox7a2抑制LH诱导的睾酮合成,降低StAR蛋白的表达,升高ROS水平.结论 Cox7a2通过抑制类固醇合成快速调节蛋白StAR的表达调控睾酮分泌,至少和增高ROS水平有关.