树大网膜前脂肪细胞原代培养及诱导分化

目的探讨树大网膜前脂肪细胞原代培养的方法,优化其诱导分化的方法。方法采用酶消化的方法对树大网膜组织进行原代培养,待其传至第三代时,用含0.5mmoL/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μmol/L胰岛素、0.2mmoL/L吲哚美辛、1μmoL/L地塞米松的高糖DMEM诱导配方对树大网膜前脂肪细胞进行成脂诱导,14d后见到细胞内聚集脂滴,对其进行油红O染色。结果树大网膜脂肪细胞在体外成功培养,细胞形态良好,呈梭形。诱导后的脂肪细胞第3d出现少数出现小脂滴,14d左右,大部分细胞胞质中出现圆而大的脂滴。结论树大网膜脂肪组织可在体外进行培养,稳定传代并能诱导分化为成熟的脂肪细胞。     

维生素D对人脂肪细胞脂联素、瘦素表达的影响

目的研究1,25二羟维生素D对人脂肪细胞脂联素、瘦素表达的影响。方法原代分离培养人大网膜前脂肪细胞:前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞:应用免疫组化法检测脂联素、瘦素的表达。结果成功培养人前脂肪细胞并诱导人前脂肪细胞分化为脂肪细胞。分化组脂联素及瘦素表达水平高于未分化组,而1,25二羟维生素D对脂肪细胞脂联素及瘦素表达水平均具有影响,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 1,25二羟维生素D对人脂肪细胞脂联素、瘦素的表达有抑制作用。     

原代培养的人皮下和网膜前脂肪细胞分化特性比较

目的探讨原代培养的人皮下和网膜前脂肪细胞在体外以无血清培养基诱导分化条件下细胞特性的差别。方法选择8例行择期电切开手术的健康成年女性腹部皮下和网膜分离前脂肪细胞,进行原代培养。细胞在无血清培养基诱导分化的条件下体外培养14d。观察分化后不同部位来源细胞的细胞内脂质含量和前脂肪细胞分化标志物——甘油-3-磷酸脱氢酶的活性。细胞的胰岛素敏感性通过葡萄糖消耗试验进行测定。结果诱导分化后,人皮下和网膜前脂肪细胞的胰岛素敏感性指标葡萄糖消耗量和细胞晚期分化指标G3PDH活性差异均无统计学意义（P〉0．05）。网膜来源的前脂肪细胞分化后脂质含量指标油红O高于皮下来源细胞（t=2．506,P=0．025）。结论在同等分化条件下,网膜前脂肪细胞较之皮下来源细胞的脂肪含量增加,提示前脂肪细胞的分化存在部位特异性。     

不同部位人前脂肪细胞生物学特性的比较

目的优化前脂肪细胞的分离培养方法 ,观察其形态学变化,比较其增殖以及成脂分化的潜能。方法无菌条件下采集腹部开放手术患者的网膜脂肪及腹腔内肾周脂肪,经胶原酶消化法分离培养人前脂肪细胞,倒置显微镜下观察人前脂肪细胞的形态,对传代至第3代的前脂肪细胞通过绘制生长曲线比较增殖能力的差别,并进行成脂诱导分化后,采用油红O染色的方法对其分化能力进行鉴定。结果不同部位获得的前脂肪细胞形态以长梭形为主,增殖活跃,其中腹腔内前脂肪细胞数量更多,呈旋涡状生长。腹腔内前脂肪细胞的增殖能力高于网膜来源的细胞。经成脂诱导分化后,可以诱导为成熟的脂肪细胞。结论采用腹腔内脂肪组织得到的人前脂肪细胞在体外易于分离培养,数量较多、纯度较高、活性更好,可以稳定传代。此种方式获得的前脂肪细胞可以为研究肥胖等相关代谢性疾病提供实验室基础。     

小鼠前脂肪细胞3T3-L1培养与四联诱导分化方法的探讨

摘要： 目的 改进小鼠前脂肪细胞 3T3-L1 的培养并诱导分化为成熟脂肪细胞的方法。方法 使用含有 10％胎牛血清 （FBS） 的高糖型 DMEM 液体培养基常规培养小鼠前脂肪细胞, 2~3 d 换液 1 次。细胞按诱导分化方式的不同分为三联诱导组和四联诱导组。三联诱导组诱导分化培养基Ⅰ成分为常规培养基基础上加用人胰岛素 10 mg/L, 1- 甲基-3-异丁基黄嘌呤 （IBMX）0.5 mmol/L, 地塞米松 （DEX） 1.0 μmol/L; 四联诱导组诱导分化培养基Ⅰ的成分为在三联诱导组基础上加入吲哚美辛 0.1 mmol/L。2 组均诱导分化培养基Ⅰ培养 2 d, 连续诱导 2 次后换用诱导分化培养基Ⅱ, 成分为： 高糖型 DMEM 培养基含 10 %胎牛血清、 100 U/mL 青霉素和 100 mg/L 链霉素混合液, 人胰岛素 10 mg/ L。培养 2 d, 连续诱导 2 次。倒置显微镜和油红 O 染色观察诱导前及诱导后 2 组细胞的形态变化。结果 小鼠前脂肪细胞 3T3-L1 状态良好, 呈现铺路石状生长, 均匀布满培养瓶底, 2 d 传代 1 次。四联诱导组诱导分化结果优于三联诱导组。三联诱导剂诱导前脂肪细胞后, 细胞形态并未发生明显变化。四联诱导剂诱导前脂肪细胞后, 可达到 90％以上的成熟脂肪细胞。成熟的脂肪细胞呈圆形, 有大量脂滴聚集, 油红 O 染色显现橘红色。结论 在三联诱导基础上加入吲哚美辛的四联诱导法可以更好地促进脂肪前体细胞分化。     

组胺对白色脂肪细胞脂肪合成以及调控的机制研究

目的：在体外探索组胺对脂肪合成的影响及其作用机制。方法：培养3T3L1细胞,诱导为白色脂肪细胞,运用RT-PCR技术检测组胺和苯海拉明对白色脂肪细胞中脂肪细胞脂肪酸结合蛋白2（aP2 mRNA）水平的影响。结果：组胺可以增加分化成熟的3T3L1小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪细胞）aP2的表达,剂量效应图显示组胺为20μmol/L时aP2表达量为最高,时间效应图显示在共同孵育6 h后aP2表达量达到最高;苯海拉明与同剂量组胺相比,可以显著降低aP2的表达（P〈0.05）。结论：组胺可以刺激分化成熟的3T3L1细胞的aP2的表达,苯海拉明可以抑制组胺的效应。组胺能增加脂肪细胞的脂肪合成,维持白色脂肪细胞能量代谢的平衡。     

白藜芦醇对小鼠3T3-L1细胞增殖与分化的影响及其机制

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对小鼠3T3-L1细胞增殖、分化的影响及其机制。方法培养3T3-L1前脂肪细胞,添加不同剂量的白藜芦醇,用WST-1法检测细胞的增殖;用油红O染色后以染色比色法分析脂肪细胞的分化程度;采用RealtimePCR技术检测各组脂联素和瘦素的mRNA表达;采用Westernblot技术检测相关位点,包括沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,Sirt1)、过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated re-ceptor γ,PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(CCTT Aenhan-cerbinding proteinα,C/EBPα)的蛋白质表达。结果Res明显抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,且呈一定的时间-剂量依赖关系;与对照组比较,Res组脂联素和瘦素的mRNA表达水平下降(P<0.01),Res抑制3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化;添加Res导致脂肪细胞中Sirt1蛋白表达水平上升,PPARγ和C/EBPα蛋白表达水平下降。结论白藜芦醇能抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化,其机制可能是通过增加Sirt1表达,抑制脂肪细胞分化相关蛋白PPARγ、C/EBPα的表达。     

TNF-α对人脂肪细胞与单核/巨噬细胞共培养体系中脂联素和瘦素表达的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人原代脂肪细胞与单核/巨噬细胞系THP-1共培养体系中脂联素和瘦素表达的影响.方法 建立脂肪细胞与单核/巨噬细胞共培养体系,将细胞分为六组:对照组(A组),脂肪细胞单独培养;共培养组(B组),脂肪细胞和THP-1细胞共培养;共培养TNF-α组(C组),脂肪细胞和THP-1共培养,TNF-α 10 ng/ml干预24 h;共培养SP、PD、SB组(D、E、F组),分别用丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路阻断剂SP600125、PD98059、SB203580预处理1 h后,TNF-α 10 ng/ml干预24 h.收集细胞培养的上清液,ELISA法检测脂联素和瘦素的表达.结果 与A组相比,其余各组脂联素表达均减少(P<0.05);D、E、F组脂联素表达较C组增加(P<0.05).各组瘦素表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 TNF-α诱导共培养体系中MAPK信号通路激活;脂肪细胞与单核/巨噬细胞之间相互作用,影响下游炎症因子的表达.     

8-溴-环磷酸腺苷和TGF-α在PCOS患者颗粒细胞中的作用

目的 探讨8-溴-环磷酸腺苷(8-Bromo-cyclic adenosine monophosphate 8-Br-cAMP)和转化生长因子-α(TGF-α)对多囊卵巢综合征(PCOS)患者离体卵巢黄素化颗粒细胞雌二醇(E2)生成的影响.方法 收集体外授精-胚胎移植(IVF-ET)时PCOS组和正常组的黄素化颗粒细胞进行体外原代培养,在其培养的不同时间(0、48、120 h)以睾酮(10-7mol/L)作为底物,分别添加8-Br-cAMP(2mmol/L)和/或TGF-α(10ng/ml)于无血清培养液(TCM199)中,共培养3h后收集培养上清、细胞.用放射免疫法(RIA)测定颗粒细胞分泌E2量;用考马斯亮蓝G250/BSA测颗粒细胞蛋白含量,以校正E2含量.结果 TGF-α在0h显著刺激PCOS组颗粒细胞分泌E2的量(P＜0.05),而48h、120 h均显著抑制PCOS组颗粒细胞分泌E2的量(P＜0.05);8-Br-cAMP在0h、48h、120 h均显著增强PCOS组颗粒细胞雌激素的产生;8-Br-cAMP显著增强TGF-α的作用(P＜0.05).结论 ①8-Br-cAMP加速PCOS患者卵巢颗粒细胞内雄激素向雌激素的转化;②TGF-α抑制PCOS患者卵巢颗粒细胞内雄激素向雌激素的转化;③TGF-α的作用是在8-Br-cAMP之后.     

催产素对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的影响

目的 观察催产素对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢的影响。方法 3T3-L1前脂肪细胞体外培养,并诱导其分化成熟为脂肪细胞。研究催产素对脂肪细胞葡萄糖消耗量以及三酰甘油、游离脂肪酸和甘油的影响。采用实时荧光定量PCR法检测糖脂代谢相关基因GLUT-1、GLUT-4、ATGT、HSL的m RNA表达。结果 与对照组比较,催产素20、50、100μg/m L组葡萄糖消耗量有所增加,且表现出剂量相关。催产素组较对照组的三酰甘油降低,而甘油和游离脂肪酸增高。催产素50μg/m L组中脂代谢相关基因HSL表达明显高于对照组,糖代谢相关基因GLUT-4 m RNA表达水平增加。结论 催产素处理可减少3T3-L1细胞脂质合成、增加脂质分解作用,并可明显改善脂质积聚。     

肾上腺素对大鼠前脂肪细胞增殖、分化及其细胞内cAMP的影响

目的研究肾上腺素对大鼠前脂肪细胞增殖、分化及其细胞内cAMP水平的影响,探讨肾上腺素对大鼠前脂肪细胞的作用机制。方法原代培养大鼠前脂肪细胞,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测六味地黄超微饮片含药血清对前脂肪细胞的增殖,以酶组织化学法检测其对前脂肪细胞分化过程中的磷酸甘油脱氢酶(GPDH)的影响,油红O染色方法测定其对细胞内脂肪积聚的影响。在大鼠前脂肪细胞生长旺盛时加入肾上腺素,以该细胞内的cAMP水平作为评价指标,利用cAMP与125I-cAMP和特异性蛋白激酶竞争结合原理测定该细胞内cAMP浓度。结果肾上腺素促进大鼠前脂肪细胞的增殖,抑制分化过程中GPDH的升高及脂肪积聚;升高大鼠前脂肪细胞内cAMP水平。结论肾上腺素-β受体-cAMP系统可能参与大鼠前脂肪细胞的增殖与分化。     

雄激素对卵巢颗粒细胞乳酸生成的作用

目的观察雄激素对小鼠卵巢颗粒细胞乳酸生成的作用,探讨多囊卵巢综合征高雄激素状态下的卵巢病理生理变化及其机制。方法体外培养小鼠颗粒细胞,分别用10-10、10-8、10-7和10-6 mol/L的睾酮刺激24h,测量培养上清液的乳酸含量。然后,加入10-8 mol/L胰岛素作用30min,检测胰岛素刺激后的乳酸生成量。结果 10-8、10-7和10-6 mol/L睾酮作用24h后,颗粒细胞乳酸生成显著下降(P<0.05);10-7 mol/L睾酮作用24h,再用胰岛素刺激30min后颗粒细胞的乳酸生成亦显著下降(P<0.05)。结论较高浓度的雄激素可抑制小鼠卵巢颗粒细胞的乳酸生成,影响其能量代谢。     

不同频率间歇低氧对3T3-L1脂肪细胞炎症因子和脂肪因子的影响

目的:测定不同频率间歇低氧处理的脂肪细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和瘦素、脂联素水平的变化.方法:以分化成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象,随机分为8组,即4个不同频率间歇低氧组(IH1-4,处理方案为分别循环充入1.5％ O245s和21％O22min15s、4min15 s、5min 45 s和8rmin45 s,每组60个循环)和各自的正常氧对照组(SC1～4,分别给予相应时间的21％O2处理).完成暴露后收集培养基,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定脂肪细胞上清液中TNF-α、IL-6、瘦素和脂联素的水平.结果:各间歇低氧组脂肪细胞上清液内TNF-α、IL-6和瘦素的水平均明显高于各自的正常氧对照组(P＜0.05或P＜0.01),且IH3组显著高于其余IH组(P＜0.05或P＜0.01);各间歇低氧组脂肪细胞上清液内脂联素的水平均明显低于各自的正常氧对照组(P＜0.01),且IH3组显著低于其余IH组(P＜0.05或P＜0.01).结论:间歇低氧可以导致体外培养的脂肪细胞TNF-α、IL-6、瘦素和脂联素的分泌异常,脂肪细胞的内分泌功能紊乱可能参与了阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者的胰岛素抵抗的发生.     

MnCl_2对体外培养大鼠Leydig细胞P450scc的影响

目的探讨锰对体外培养大鼠Leydig细胞P450scc的影响。方法建立体外培养大鼠Leydig细胞的原代培养方法,染锰(0、10、30和100μmol/L)24 h后,原子吸收光谱法检测细胞内外锰的含量,ELISA方法检测细胞培养上清液中睾酮及细胞内外P450scc的含量,并运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测Leydig细胞P450sccmRNA的表达水平。结果与对照组相比,在设计剂量范围内,随着染锰剂量加大,细胞培养上清液中睾酮及细胞内Mn的含量逐渐增加,30和100μmol/L时,有统计学意义(P0.05)。细胞内外P450scc含量不断增加,30和100μmol/L时,细胞内该酶的增加有统计学意义(P0.05);10、30和100μmol/L时,细胞外该酶的增加有统计学意义,P0.05。P450scc mRNA的表达水平升高,100μmol/L时,有统计学意义,P0.05。结论在该试验条件下,MnCl2可上调P450scc基因的表达,增加细胞内P450scc含量,促进体外培养Leydig细胞合成睾酮。     

高密度脂蛋白对炎症状态下脂肪细胞功能的保护作用

目的探讨高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)对炎症状态下脂肪细胞胆固醇流出的保护作用。方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成为成熟的脂肪细胞,用不同浓度的HDL(10~100mg·L-1)孵育16h,然后加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,100μg·L-1)共同孵育6h,收集细胞上清测定白介素-8(interleukin-8,IL-8)的浓度,并检测不同浓度的HDL对LPS刺激的脂肪细胞胆固醇流出的影响。结果LPS刺激脂肪细胞使得IL-8的分泌增多(P<0.05),HDL能降低细胞上清中IL-8的含量(P<0.05),并呈浓度依赖性;LPS刺激脂肪细胞使得胆固醇的流出明显减少(P<0.05),在炎症状态下HDL呈浓度依赖性的促进脂肪细胞胆固醇的流出(P<0.05)。结论HDL能够降低炎性脂肪细胞分泌的趋化因子IL-8的水平,并能促进细胞内胆固醇的流出。     

大黄素对体外大鼠骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化的影响

目的观察大黄素对骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化的影响,以探讨大黄素对骨质疏松发生时伴随的脂肪增多现象中所起的作用。方法16只3mon龄SD大鼠随机分成4组:对照组、激素组、复方碳酸钙治疗组、大黄素治疗组。给药90d后收集骨髓基质细胞。应用油红O染色法及RTPCR的方法判断是否成功诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化,同时观察大黄素对骨髓基质细胞成脂分化后脂肪细胞的数目和脂蛋白脂酶mRNA表达的影响。结果体内灌胃给予泼尼松的激素组大鼠的骨髓基质细胞体外培养时分化为脂肪细胞的能力明显增强。复方碳酸钙组和大黄素组大鼠骨髓基质细胞分化为脂肪细胞的能力较激素组明显下降,其中大黄素下调脂蛋白脂酶mRNA表达的作用强于复方碳酸钙。结论体内给予糖皮质激素后,骨髓基质细胞体外培养时自发向脂肪细胞方向分化的能力和经体外诱导后向脂肪细胞方向分化的能力都明显增强,大黄素可能有对抗糖皮质激素成脂诱导的作用。     

板蓝根活性组分预防肥胖作用及机制研究

目的探讨板蓝根活性组分(ACIR)的预防肥胖作用及其可能的作用机制。方法高脂饮食诱导小鼠肥胖的同时给予不同剂量ACIR,观察小鼠体质量、进食量、脂肪重量、脂肪细胞形态、肝脏重量及血脂变化,并进行小鼠负重游泳实验;体外培养诱导分化3T3-L1前脂肪细胞,观察ACIR对脂肪细胞增殖、分化和脂滴形成的影响。结果 ACIR能显著降低小鼠体质量、脂肪系数及肝脏重量,使脂肪细胞变小;改善小鼠进食量,明显延长小鼠负重游泳时间,使血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)含量降低,但高密度脂蛋白(HDL)无明显变化;抑制前脂肪细胞增殖和分化,减少脂滴形成。结论 ACIR具有预防肥胖和降血脂作用,其可能的机制是抑制前脂肪细胞增殖和分化。     

板蓝根水提物对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的探讨板蓝根水提物(water extract of Radix Isatidis,WERI)对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响及其作用机制。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,MTT法和流式细胞技术检测WERI对细胞增殖的影响;鸡尾酒诱导剂诱导3T3-L1前脂肪细胞,油红O染色和比色分析法观察WERI对前脂肪细胞分化及脂肪积累的影响;采用RT-PCR检测脂肪细胞的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)及CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding proteinα,C/EBPα)mRNA的表达;Western blot法检测PPARγ及C/EBPα蛋白表达。结果WERI在一定浓度范围内能有效抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,同时细胞周期呈现G_0/G_1向S期阻滞;与空白组相比,用不同浓度的WERI处理后,3T3-L1前脂肪细胞的分化受到明显抑制,且细胞内脂滴生成量明显减少;PCR及Western blot结果显示,WERI还可以抑制脂肪细胞PPARγ和C/EBPα基因及蛋白的表达。结论 WERI具有抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖作用,并可通过下调PPARγ和C/EBPαmRNA及蛋白表达来抑制细胞成脂分化。     

不同程度间歇低氧对3T3-L1脂肪细胞炎性细胞因子和脂肪因子的影响

【摘要】目的 测定不同程度间歇低氧（IH）处理的3T3-L1脂肪细胞中炎性细胞因子和脂肪因子水平的变化。 方法 建立阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）模式间歇低氧/再氧合（IH/ROX）细胞模型,将分化成熟的3T3-L1脂肪细胞分为5组,即3个不同程度IH组（5%O₂,7.5%O₂,10%O₂,编号为IH-1,IH-2,IH-3）、持续低氧（10%O₂,CH）组和正常氧对照（21%O₂,IN）组。采用ELISA法测定脂肪细胞上清液中肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、瘦素和脂联素的水平,Western blot测定脂肪细胞中低氧诱导因子（HIF）-1α、葡萄糖转运蛋白（Glut）-1水平,Real-time-PCR测定脂肪细胞中HIF-1α,lut-1、TNF-α、IL-6、瘦素、脂联素的mRNA表达水平。 结果 IH组和CH组TNF-α、IL-6和瘦素蛋白及其mRNA水平均高于IN组,IH-1组TNF-α、IL-6和瘦素蛋白及瘦素mRNA水平高于IH-2、IH-3组（均P＜0.05）;IH组和CH组脂联素蛋白及其mRNA水平均低于IN组,IH-1组低于IH-2、IH-3组（均P＜0.05）。 结论 OSA模式IH与脂肪细胞炎性细胞因子和脂肪因子的表达和释放有关,IH可能是脂肪细胞炎症反应的基础,参与OSA患者胰岛素抵抗的发生。     

大豆黄素衍生物LRXH609的减肥作用及机理探讨

目的：探讨大豆黄素衍生物IRXH609（LRX）的减肥作用和可能的机理。方法：以高脂饮食诱导肥胖大鼠,测量体重、Lee’s指数、腹腔脂肪重量、摄食量、血脂和血糖,检验LRX灌服30d后的减肥效果;体外培养诱导分化3T3-L1前脂肪细胞,观察药物对脂肪细胞增殖、脂质合成和分解的影响。结果：LRX显著降低高脂饮食诱导的肥胖大鼠体重、Lee’s指数、腹腔脂肪重量;降低血液中TC和游离脂肪酸（FFA）含量;抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖;显著提高3T3-L1前脂肪细胞内激素敏感脂酶（HSL）活性,促进脂肪分解释放甘油（Gly）,减少细胞内TG含量。结论：LRXH609有显著的减肥和调血脂作用,可能的机理是通过抑制前脂肪细胞增殖和分化,激活HSL促进脂肪细胞内TG分解,降低脂肪细胞内TG存储量。