诱导成体人牙周韧带干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的从成体人牙周组织中分离培养牙周韧带干细胞，研究其分化为软骨细胞的可行性。方法选取10～15岁的年轻患者因正畸拔除的健康牙齿，刮取根中1／3的牙周膜，采用组织块培养法得到牙周韧带细胞，待细胞达一定量后用有限元稀释法进行单细胞克隆，筛选牙周韧带干细胞（PDLSC），体外采用离心管聚集体诱导法进行软骨化诱导培养，光镜下观察诱导细胞形态学的改变，甲苯胺蓝染色、免疫组化、RT-PCR等方法检测胶原和糖蛋白的体外表达情况。结果体外离心管聚集体诱导培养3周后，实验组呈白色半透明状，甲苯胺蓝染色显示在外周区域有大量软骨基质成分沉积，组织学显示有较为明显的软骨陷窝。免疫组化及RT-PCR检测到Ⅱ型胶原表达，Ⅱ型胶原染色呈强阳性。对照组细胞团块逐渐收缩、崩解，组织学检测无软骨陷窝结构，Ⅱ型胶原免疫组化结果阴性。结论从成体人牙周组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能，也为牙周组织工程的应用奠定了实验基础。     

载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：探讨载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells)构建组织工程骨的可行性,并筛选辛伐他汀的有效载药量。方法：采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法,制备不同浓度(辛伐他汀质量分别为0.1、0.5、1 mg)的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,扫描电镜观察孔隙率,绘制药物释放曲线;茜素红染色、I型胶原染色观察成骨诱导液和辛伐他汀对骨髓基质干细胞向成骨分化的作用;将第3代BMSCs经dil染色后,接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的黏附情况,CCK-8和碱性磷酸酶(ALP)检测对其增殖和分化作用;采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200~300 μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;经辛伐他汀和成骨诱导组I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;4组支架材料与细胞黏附性较好,0.5 mg组细胞生长状态最佳。CCK-8和ALP检测0.5 mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论：辛伐他汀和成骨诱导液联合利用,能够更有效地促进BMSCs向成骨分化;载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;载0.5 mg辛伐他汀PLGA/CPC支架材料能够有效促进BMSCs的增殖和分化。     

松质骨支架与成骨细胞生物相容性的实验研究

目的：观察松质骨支架对成骨细胞的粘附、生长、增殖的影响,为骨组织工程支架的选择提供实验依据.方法：采用Ficoll梯度离心法得到兔骨髓基质干细胞,经诱导培养为成骨细胞并通过相差显微镜观察、Ⅰ型胶原免疫组化法染色、四环素染色确认为成骨细胞;采用物理化学方法对猪松质骨进行处理得到猪松质骨支架,与成骨细胞体外复合培养,通过扫描电镜观察猪松骨材料对成骨细胞生长、粘附的影响.结果：骨髓基质干细胞经条件培养基诱导培养后已分化为成骨细胞,与松质骨支架联合培养1d后可见细胞附着于材料表面,但数量不多,细胞呈圆球形,7d后细胞生长密集,似葡萄状粘附于脱矿猪松质骨的孔壁上,细胞呈不规则圆球形,表面有丰富的绒毛状突起,细胞间有伪足样突起相连但分布不均.细胞相互融合,可见细胞遮盖微孔间隙.结论：松质骨材料具有良好的细胞相容性,可用作骨组织工程的支架材料.     

磷酸钙骨水泥胶原支架复合P物质对大鼠骨髓间充质干细胞特性影响研究

目的    因各种原因导致的牙槽骨甚至颌骨的缺损、缺失在临床上十分常见,对患者口腔功能和美观均可造成严重影响。磷酸钙骨水泥（CPC）是公认的具有良好生物相容性的可降解骨移植材料,与Ⅰ型胶原混合后可塑性增强,孔隙率增加且弹性模量更接近于人体骨。本研究通过人工合成神经递质P物质（SP）结合于CPC胶原支架材料,体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,观察材料表面形貌及对BMSCs生物学行为的影响。方法     2015年9月至2016年1月在第四军医大学口腔医院选取4周龄雌性大鼠20只,进行BMSCs体外培养。研究材料分为3组,A组：纯CPC组;B组：CPC＋Ⅰ型胶原组;C组：CPC＋Ⅰ型胶原＋SP组。扫描电镜（SEM）观察样本表面形貌及BMSCs形态、黏附与增殖。通过测定细胞增殖对数、成骨及成脂诱导对BMSCs进行鉴定,荧光染色定量分析BMSCs的黏附与增殖,成骨诱导液培养14 d后经茜素红染色,并通过碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测细胞ALP活性。结果    原代BMSCs生长旺盛,生长曲线呈典型“S”形。成骨和成脂诱导液培养3周,行茜素红和油红O染色,镜下可见钙化结节及脂滴形成,BMSCs多向分化能力良好。SEM下B、C 组可见胶原与CPC联结紧密,胶原表面呈条索样间隙,表面BMSCs细胞与胶原附着数量多,突触长并彼此相联,细胞伸展良好。荧光显微镜下观察,C组表面活性细胞比例高于A、B 组。成骨诱导14 d后茜素红染色,肉眼观C组颜色较深,ALP检测C组BMSCs的ALP表达高于A、B 2组（P＜0.05）。结论    本研究构建的SP加载的CPC胶原复合材料支架对SD大鼠BMSCs的黏附、增殖和成骨分化均具有促进作用,为今后临床牙槽外科修复重建工作提供了新的思路方法和研究基础。     

静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜诱导骨髓间充质细胞成骨分化的研究

目的：观察静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对骨髓间充质细胞（BMSCs）粘附、增殖和成骨分化的影响。方法：通过静电纺丝技术制备聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜,将第4代BMSCs接种于纤维膜,扫描电镜、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色、MTT检测BMSCs粘附、分化及增殖能力。结果：在静电纺丝技术制备的聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜表面,BMSCs的黏附和增殖增强,呈现明显升高的ALP活性,并形成矿化结节,提示具有向成骨细胞方向分化的倾向。结论：静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对BMSCs的细胞相容性较好,适合BMSCs的黏附生长,具有诱导其向成骨细胞分化的潜能,有望成为一种新型牙周组织工程支架材料。     

不同方法诱导的骨髓基质细胞用于修复山羊髁突软骨缺失的实验研究

目的:比较用诱导因子诱导及用部分成体软骨细胞诱导的骨髓基质细胞(BMSCs)复合生物材料修复山羊颞下颌关节髁突软骨全层缺失的效果.方法:取山羊6只,分为2个实验组及1个对照组,每组2只.实验Ⅰ组植入经诱导因子(TGF-131、IGF-1、地塞米松)诱导的BMSCs与支架(PIuronic F-127溶胶)复合物,实验Ⅱ组植入软骨细胞-BMSCs(按3:7比例混合)的细胞-支架复合物,对照组仅植入支架材料.于术后8周取材,进行颞下颌关节软骨面缺失修复的大体观察、修复组织的HE染色、Ⅱ型胶原分泌的免疫组化染色.结果:术后8周实验Ⅱ组髁突软骨缺失区由软骨样组织修复.HE染色及免疫组化染色结果均提示修复组织为成熟的软骨组织.而实验Ⅰ组及材料对照组缺损区仅由少量的纤维性组织修复,不能形成成熟的软骨组织.结论:骨髓基质细胞在自体软骨细胞基质的诱导下,可以修复山羊髁突软骨面全层缺失,二维培养诱导后的BMSCs在山羊髁突软骨缺失区难以达到修复作用.     

新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架体外细胞相容性的实验研究

目的　评价新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料的体外细胞相容性。方法　SD大鼠骨髓基质细胞 (BMSCs)经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架(实验组)、普通多孔羟基磷灰石陶瓷支架(对照组)体外复合培养。扫描电镜观察BMSCs在材料上的生长及生理功能表达情况;测定细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素的含量;流式细胞仪检测细胞的凋亡及周期、倍体,比较细胞的粘附能力、增殖活力及成骨活性。结果　BMSCs经体外诱导形成钙结节,Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。两组材料上皆有细胞附着生长,但实验组细胞的粘附能力、增殖活力及成骨活性均强于对照组。结论　SD大鼠BM- SCs与新型多孔纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料有良好的细胞相容性。     

Bio-Oss胶原结合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:研究Bio-Oss胶原作为骨组织工程支架材料的可行性。方法:抽取成年小型猪骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞(BMSCs),经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况,并进行I型胶原、骨钙素的免疫细胞化学检测。将培养的第3代细胞接种于Bio-Oss胶原,进行超微结构观察,并将Bio-Oss胶原/BMSCs复合物植入裸鼠背部皮下,4、8周后进行组织学检测。结果:当接种密度为0.8×106/ml时,细胞与支架材料之间有最大附着量;VonKossa染色可见钙结节形成;I型胶原、骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示,8周时复合物内有新骨形成。结论:Bio-Oss胶原/BMSCs复合物显示成骨活性,Bio-Oss胶原可用作骨组织工程支架材料。     

人牙髓干细胞在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物支架上粘附与增殖的研究

目的：研究成人牙髓干细胞（HDPSCs）在聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）支架上粘附与增殖的情况。方法：采用酶消化法分离、培养人牙髓干细胞,免疫组化法及体外诱导分化对细胞进行鉴定。将人牙髓干细胞与PLGA支架材料进行复合培养,扫描电镜（SEM）观察支架材料形态,细胞粘附、增殖及基质分泌情况;细胞计数检测其增殖力。结果：细胞接种2、5、10d,扫描电镜及细胞计数均显示HDPSCs与PLGA支架材料粘附紧密,生长状态良好,细胞明显增殖（P〈0.05）,有丰富的细胞外基质形成。结论：PLGA是一种适宜人牙髓干细胞粘附与增殖的支架材料。     

骨髓间充质干细胞复合脱细胞软骨和富血小板血浆的体内成骨实验

目的:研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)和富血小板血浆(PRP)复合物中加入脱细胞软骨碎块(DCM)后的成骨能力.方法:全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs;采集兔新鲜动脉血制备PRP;剪取新鲜兔耳碎化后用化学法脱细胞制备DCM,将BM-SCs与PRP和DCM混合后注射到裸鼠皮下,8周后取材观察成骨情况.结果:体外实验显示本实验分离培养的BMSCs有较强的成骨、成脂分化能力,软骨碎块脱细胞效果理想,8周裸鼠体内结果取材苏木精-伊红染色(HE)和改良Massons染色显示类骨质和骨质较多,甲苯胺蓝(TB)染色显示剩余软骨成分较少.结论:BMSCs-PRP-DCM复合物诱导软骨内成骨.