G145R突变后HBsAg"a"决定簇合成肽的免疫学特性分析

目的研究G145R突变后乙肝表面抗原(HBsAg)"a"决定簇合成肽的免疫学特性改变情况. 方法首先合成2条短肽P1-wt和P2-145R,分别代表野毒株和G145R突变后HBsAg"a"决定簇合成肽.然后用β-巯基乙醇(2-ME)变性试验以及用乙肝疫苗标准品制备的小鼠多抗血清研究2条合成肽的空间构象以及抗原性异同.最后用等量合成肽免疫小鼠,用酶免疫法、竞争抑制试验和Western blot试验等研究G145R突变后"a"决定簇合成肽的免疫原性改变.结果合成肽P1-wt和P2-145R用2-ME温和变性后,PAGE结果表现为相对分子质量(Mr)为4×103左右的单一条带,而变性前2条合成肽均表现为Mr是从4×103到30×103的弥漫条带,主带位置在5×103和10×103,分别相当于二聚体和四聚体位置;用HBsAg的多克隆抗体(anti-HBs)检测合成肽的抗原性,结果在固定抗原量的前提下,在抗体1∶32 000稀释时仍可检测到P1-wt的阳性结果,而当同一抗体稀释到1∶8000时,P2-145R检测结果即为阴性.合成肽P2-145R免疫小鼠产生的抗体与P1-wt合成肽的反应滴度比与P2-145R合成肽本身的反应低4～8倍. 结论针对HBsAg"a"决定簇合成肽可自发形成一定的空间构象,G145R突变株的HBsAg"a"决定簇的抗原性和免疫原性与野毒株相比发生了明显改变,为正确评价G145R变异株的流行危害以及现行疫苗的保护效果提供了实验依据.     

乙型肝炎病毒S基因“a”决定簇基因序列的多态性

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物直接序列分析，测定３０例乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）阳性中国人感染的乙型肝炎病毒Ｓ基因“ａ”决定簇序列，其中ａｄｗ２１例，ａｄｒ８例，ａｙｗ１例。在１２１到１４７共２７个氨基酸中，１２１，１２３～１２５，１２７～１２８，１３０～１３３，１３５～１４２，１４４～１４５和１４７高度保守，而第１２６位可为丙氨酸、异亮氨酸或苏氨酸，１４３位可为丙氨酸、天冬酰胺或苏氨酸，１２９为谷氨酸，１３６为酪氨酸各１例。２例ＨＢｓＡｇ阴性病人在第１２３～１２４间插入２～３个氨基酸，可能是用现行试剂不能检出血清中ＨＢｓＡｇ的原因。研究结果说明了中国人感染的ＨＢＶ“ａ”决定簇序列的多态性，可为进一步研究ＨＢＶ的Ｓ基因变异提供参照。     

兔抗人细胞色素P450 4A11合成肽抗体的制备与鉴定

目的：制备兔抗人细胞色素P450 4A11（CYP4A11）抗体，并对其特性进行初步鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP4A11蛋白的序列，根据亲水性结构、柔韧区、抗原指数及表面概率结构等指标选择多肽序列、合成CYP4A11多肽，与载体蛋白钥孔戚血蓝素（KLH）偶联，免疫大耳白兔制备抗CYP4A11抗体。辛酸一硫酸铵法纯化抗体，对纯化的抗体进行ELISA、Western blot、免疫组化等鉴定。结果：获得抗CYP4A11合成肽的抗体。该抗体效价为1：32000。可与CYP4A11合成肽及天然CYP4A11出现特异性反应，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量（Mr）为53000，可识别正常肝脏的CYP4A11。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP4A11合成肽抗体可应用于ELISA、Westernblot、免疫组化等实验。     

SARS冠状病毒S蛋白表位合成肽抗原性的研究

目的　研究SARS病毒合成肽疫苗。方法　根据目前已知SARS病毒的基因组序列及其编码的蛋白质 ,选择了SARS病毒编码的spike蛋白抗原表位蛋白质序列 ,运用计算机抗原表位预测技术 ,筛选抗原表位 ,以合成肽抗原表位。通过对SARS病人血清进行筛选确定与血清高交叉反应的 3个短肽 ,再合成多重抗原肽 (multipleantigenicpeptide ,MAP) ,与KLH偶联后免疫小鼠。结果　筛选的 3条与SARS病人血清反应强的肽 ,免疫小鼠均产生了高效价的抗体。结论　以合成肽为免疫原研究SARS病毒肽疫苗有着广阔前景。     

合成肽制备乙型肝炎病毒前S_1抗体

根据乙型肝炎病毒前S_1蛋白中的第21～47氨基酸决定簇人工合成肽P21～47。将P21～47与破伤风类毒素偶联成免疫原,免疫家兔获得了抗体。该抗体不仅可与P 21～47反应,还可与乙型肝炎病毒的PreS_1抗原发生反应。鉴于PreS_1与乙型肝炎病毒吸附于靶细胞表面受体有关,本抗体不仅可用于检测PreS_1抗原,还可研究病毒与受体间相互关系。     

丁型肝炎病毒抗原肽的合成及应用

本研究设计并用固相法合成了丁型肝炎病毒与蛋白上的二个抗原肽,肽的纯度达到高压液相鉴定均.两种复肽均具有丁肝病毒抗原活性,在抗HDVELISA检测中有应用价值,混合包被的效果更佳.     

HBsAg、HBsAb共存乙型肝炎患者S基因"a"决定簇变异检测分析

目的:研究HBsAg、HBsAb共存慢性乙型肝炎患者HBV S基因“a”决定簇变异情况及对HBsAg抗原性的影响。方法:对7例HBsAg、HBsAb同时阳性慢性乙型肝炎患者的8份血清,采用竞争PCR微流芯片法定量检测HBV DNA;用套式PCR法扩增HBV S基因,对PCR产物进行直接测序,比较S基因的核苷酸和推导出的氨基酸序列的差异,采用ELISA/MEIA法检测HBVM;以15例HBsAg、HBeAg/HBeAb、HBcAb阳性乙肝疫苗免疫失败儿童、9例终末期乙肝患者肝移植术后接受HBIG、拉米夫定治疗患者作为对照。结果:7例患者HBsAb含量均低于80mIU/ml,其中2例HBVDNA定量阳性者未出现“a”决定簇变异,4例HBVDNA定量阴性者中2例氨基酸发生变异(126,131),1例HBV DNA定量由阳性转为阴性者由无变异转为氨基酸126位点变异;9例肝移植术后痊愈患者HBsAb含量均高于150mIU/ml,HBV DNA定量均为阴性,未发现“a”决定簇变异;15例免疫失败儿童14例HBV DNA定性阳性,2例出现“a”决定簇145位点、1例126位点、1例134位点氨基酸变异。结论:部分HBsAg、HBsAb共存慢性乙肝患者、乙肝疫苗免疫失败儿童体内存在S基因“a”决定簇变异;“a”决定簇变异可改变HBsAg抗原性、逃避低含量抗HBs的中和作用;“a”决定簇变异对HBV的复制可能有一定影响;肝移值治愈乙肝患者未发现“a”决定簇变异。     

兔抗人细胞色素P450 1A2多克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备兔抗人细胞色素P4501A2（CYP1A2）抗体及其特性鉴定。方法：利用生物信息学方法分析CYP1A2蛋白的序列，根据亲水性、抗原性、柔韧性及表面性等指标选择多肽序列，合成CYP1A2多肽，与载体蛋白钥孔戚血蓝素（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联，免疫日本大耳白兔制备抗CYP1A2抗体。辛酸-硫酸铵法纯化抗体，间接ELISA法测定抗体的效价及相对亲和力常数，Western blot鉴定其特异性，免疫组化进行定位。结果：获得针对小分子CYP1A2的抗体。该抗体效价为1∶16000；相对亲和力常数在10^5-10^6/M，具有实用价值；可与CYP1A2合成肽及天然CYP1A2出现特异性反应；可识别正常人肝脏组织CYP1A2；Western blot的结果显示，该抗体识别的相应抗原的相对分子质量为58000。结论：合成的多肽-KLH复合物具有免疫原性，可用于制备相应的抗体。制备的兔抗CYP1A2合成肽抗体可应用于酶联免疫吸附试验、免疫印迹、免疫组化实验。     

乙肝病毒核心区与"a"决定簇嵌合基因的体外表达及抗原性分析

目的评价乙肝病毒核心区与"a"决定簇嵌合基因表达产物的抗原性.方法应用基因工程技术将编码截短的乙型肝炎病毒核心抗原的主要免疫显性区替换为表面抗原"a"决定簇的基因片段,将嵌合基因装入原核表达载体pRESET-B内,在体外进行诱导表达,纯化目的蛋白并检测其抗原性.同时将嵌合基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3内,瞬时转染 BHK细胞并采用间接免疫荧光法检测融合蛋白表达情况.结果诱导并纯化得到了分子量为28 ku的蛋白,经检测证实该蛋白具有一定的HBsAg抗原性和较弱的HBcAg抗原性.真核表达质粒可在 BHK细胞内表达,可检出良好的HBsAg抗原性及较弱的HBcAg抗原性.结论该嵌合质粒表达产物具有良好的HBsAg抗原性及较弱的HBcAg抗原性.     

乙肝疫苗免疫失败儿童病毒S基因"a"决定簇变异研究

目的 探讨江苏常州地区乙型肝炎疫苗免疫失败儿童病毒S基因“a”决定簇的变异情况。方法 对15例乙肝疫苗接种后血清表面抗原(HBsAg)阳性的儿童,采用聚合酶链反应方法(PCR)扩增其血清中HBV DNA S基因区。并对PCR产物直接标记测序。结果 15例HBsAg阳性儿童有14例血清HBV DNA阳性,其中有4例出现了S基因“a”决定簇的变异,变异率为28．6％,第126位的异亮氨酸（Ile)被苏氨酸(Thr)替代1例,第134位苯丙氨酸(Phe)被异亮氨酸替代1例。第145位甘氨酸(Gly)被丙氨酸(Pha)替代2例。结论乙型肝炎疫苗免疫失败儿童中存在s基因“a”抗原决定簇变异,江苏常州地区存在HBVS基因“a”决定簇变异的新类型。     

Antibody response to two synthetic peptides corresponding to residues 45–68 and 69–79 of the major protein of hepatitis B surface antigen

Peptides corresponding to amino acid residues 48–65 and 69–79 of the major polypeptide component of hepatitis B surface antigen (HBsAg) were synthesized and conjugated to protein (bovine serum albumin and keyhole limpet hemocyanin) and fully synthetic (polyglutaraldehyde and cross-linked liposomes) carriers. The peptide-liposome conjugates appeared the most consistent in eliciting antibodies to HBsAg. Results of competition assays between each of the free synthetic peptides and HBsAg for antibodies suggested that the synthetic analogues and the corresponding segments on intact HBsAg are structurally closely related.     

血清乙肝病毒大蛋白在HBeAg阴性和低水平HBV-DNA乙肝患者中的检测意义

为了探讨血清乙肝病毒大蛋白在HBeAg阴性与低水平HBV-DNA乙肝患者中的检测意义。对162例HBV感染者及47名健康对照血清采用酶联免疫吸附试验检测乙肝病毒大蛋白、乙肝病毒前S1抗原、病毒前S2抗原及乙肝病毒标志物;FQ-PCR定量检测HBV-DNA。结果显示:162例HBV感染者血清中,HBV-LP浓度与HBV-DNA拷贝数间具有良好的正相关性(rs=0.64,P<0.001),不同HBV-DNA拷贝数组别间HBV-LP浓度存在差异显著性(P<0.01);HBV-LP与HBV-DNA、HBeAg、HBVpreS2、HBVpreS1间均关联显著(P<0.01)。HBV-LP与HBV-DNA、HBeAg、HBVpreS2、HBVpreS1间阳性率均存在差异显著性(P<0.05),HBV-LP阳性率为84.57%,较HBV-DNA、HBeAg、HBVpreS2、HB-VpreS1均敏感。其中HBeAg阴性组中HBV-LP与HBVpreS1、HBVpreS2、HBV-DNA间阳性率均存在差异显著性(P<0.05),HBV-LP阳性率为76.77%(76/99),较HBV-DNA,HBVpreS2,HBVpreS1均高(P<0.01);DNA阴性组中HBV-LP与HBVpreS2、HBVpreS1、HBeAg间阳性率均存在差异显著性(P<0.05),HBV-LP阳性率为73.33%,较HB-VpreS2、HBVpreS1、HBeAg均高。血清HBV-LP浓度是反映血清HBeAg阴性和低水平DNA的HBV感染者体内病毒复制、疾病进程、疗效与预后判断的新的敏感监测指标。     

HBV基因型与HBx基因变异的研究

目的分析慢性HBV感染者血清中HBV基因型和HBx基因多态性,探讨HBx基因变异与HBV基因型的关系。方法采用型特异性引物PCR法对110份慢性HBV感染者血清中HBV基因型进行检测。采用巢式PCR、单链构象多态性与异源双链分析、以及基因测序和生物信息学方法分析HBx基因突变。结果在110份慢性HBV感染者血清中,检出B型、C型和混合型B＋C,分别占57份（56.8%）、49份（44.6%）和4份（3.6%）。与参考序列相比,B型与C型HBx基因都存在点突变,且C型点突变数明显多于B型（t=-12.599,P〈0.05）。结论慢性HBV感染者HBx基因突变与HBV基因型密切相关。     

HBc二聚体组装核衣壳相关功能域突变对HBV复制的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)二聚体组装相关功能域突变对核心颗粒组装及HBV复制的影响.方法 基于HBc空间结构,PCR定点诱变二聚体组装核衣壳相关功能域重要氨基酸位点,以pcDNA3.1为载体构建4个突变体表达质粒pHBc14-18M、pHBc120-135M、pHBc23-39M和pHBc122-139M.将突变质粒与HBc缺失的含1.2拷贝HBV基因质粒pHBV1.2-core-共转染HepG2细胞,通过Northern blot检测HBV前基因组(pgRNA),Southern blot检测复制中间体,非变性琼脂糖凝胶电泳(native agarose gel electrophoresis)及Western blot检测细胞核心颗粒观察突变质粒自身形成核衣壳情况.将突变质粒与含有1.2拷贝HBV基因质粒pHBV1.2共转染HepG2细胞观测突变质粒对野生型HBc组装及HBV复制的影响.结果 突变质粒与pHBV1.2-core-质粒共转染HepG2细胞,pHBc14-18M、pHBc120-135M和pHBc122-139M突变能够组成核衣壳样结构.pHBc23-39M不能形成核衣壳样结构.Northern blot结果显示所有突变质粒组均未见pgRNA条带,Southern blot检测复制中间体也未见条带.将突变质粒与pHBV1.2共转染HepG2细胞,pHBc14-18M、pHBc120-135M和pHBc122-139M组HBV复制中间体及上清中病毒颗粒明显减少,而pHBc23-39M组无减少.结论 HBc23-39位氨基酸突变可阻止二聚体多聚化,不能形成核衣壳样结构,且不能与野生HBc二聚体相互作用.HBc14-18、120-135、122-139区域的氨基酸突变,能够形成核衣壳样结构但不支持HBV DNA复制,并且能与野生HBc二聚体相互作用,形成杂合体,干扰野生型HBV DNA的复制.     

免疫疗法治疗慢性乙肝病毒感染者疗效观察

目的 探讨抗HBe阳性的HBV慢性感染者前C区变异株的发生率及治疗方法。方法 选择抗HBe阳性的HBV慢性感染者，应用DNA序列分析方法检测其前C区的变异的发生率，然后用免疫疗法(左旋咪唑搽剂 乙肝疫苗 潘生丁)治疗，观察其对HBV前C区变异株患者的疗效，并以HBeAg阳性患者为对照。结果 (1)抗HBe阳性的HBV慢性感染者前C区变异发生率为10／12；10例均为A1896终止变异，其中5例与野生株混合，6例伴BCP变异。(2)本试验的免疫疗法对前C区变异株的疗效(5，7)优于HBeAg阳性者(2，11)的疗效。结论 (1)本研究对象中抗HBe阳性的HBV慢性感染者前C区变异发生率较高；(2)本研究所试用的免疫疗法对前C区变异株的疗效优于对HBeAg阳性者的疗效。但均因例数太少难于肯定，需进行更大样本的研究。     

Monoclonal antibodies to hepatitis B surface antigen (HBsAg) with anti-alpha specificity recognize a synthetic peptide analogue (S135-155) with unmodified lysine (141)

A synthetic peptide corresponding to residues 135-155 (S135-155) of the major protein component of HBsAg was conjugated to beta-galactosidase. This conjugate reacted with monoclonal anti-HBs antibodies having anti-alpha group specificity. The reaction was inhibited by: HBsAg of either subtype ad or ay; by unconjugated S135-155 or a shorter peptide S140-155, but not by unrelated peptides. Modification of lysine residues of either HBsAg or S135-155 reduced this inhibitory effect. These results indicate that Lys 141 is essential for maintaining the antigenicity of one of the epitopes responsible for the common alpha specificity of HBsAg and that studies involving the use of synthetic peptides and modifications of distinct amino acid residues in the native protein or in the peptide may help in characterizing epitopes of viral antigens in general.