靶向鼠双微粒体2反义寡核苷酸诱导HepG2细胞凋亡

鼠双微粒体2（MDM2）基因最初是从一个含有双微粒体（DM）的自发转化的BALB／3T3DM细胞中克隆出来的一个高度扩增的癌基因，编码的蛋白可以和抑癌基因蛋白p53相互作用。MDM2在多种肿瘤细胞中高表达，在肝癌细胞HepG2中的表达是正常肝细胞的2．4倍，可能参与肝细胞癌的形成和进展，影响肝癌患者的预后。因此，本研究针对MDM2基因应用特异反义寡核苷酸（ASO）降低HepG2细胞内MDM2基因的表达，观察其对HepG2细胞生物活性的影响，以期为肝癌的反义治疗提供新的靶点和实验依据。     

反义HCCR-2转染对肝癌细胞HepG2形态的影响

目的研究HCCR-2反义基因转染对肝癌HepG2细胞株形态学的影响。方法用脂质体法将HCCR-2反义真核表达载体导入HepG2细胞,从光镜、HE染色、荧光显微镜、电镜水平观察转染前后细胞形态学的改变。结果与亲本细胞相比,光镜及HE染色下转染HCCR-2反义基因的HepG2细胞变得狭长,胞体增大,胞浆丰富,分裂相减少,核浆比下降,异型性减少;荧光显微镜下反义基因转染细胞发出绿色荧光,透射电镜下反义基因转染细胞出现凋亡。结论 HCCR-2反义基因可以促进HepG2细胞的分化。     

细胞周期素D1在大肠癌中的表达及意义

目的：探讨细胞周期素D1（CD1）与大肠癌的发生、进展及预后的关系。方法：收集24例手术切除的大肠癌标本,同时取距癌灶5cm以外的癌旁组织及10cm以外的正常组织,用原位杂交的方法检测癌组织、癌旁组织及正常组织中CD1mRNA的表达,同时结合临床病理资料进行分析。结果：24例大肠癌组织中CD1mRNA阳性9例,阳性率37．5％;癌旁组织仅有1例阳性,阳性率4．2％;正常组织未见阳性表达。癌旁组织和正常组织均与癌组织有显著性差异（P＜0．01）。CD1mRNA的表达在浸润至浆膜层组明显高于浸润至肌层组（P＜0．05）;有淋巴结转移组及晚期病变（Dukes B C D期）组亦明显高于无淋巴结转移及早期病变（Dukes A期）组（P＜0．05）。CD1mRNA的表达高低与年龄、性别、癌灶直径大小、分化程度及是否有远处转移无明显关系（P＞0．05）。结论：CD1mRNA过度表达与大肠癌的发生、发展及转移有关。     

细胞周期素D1基因多态性与胃癌关系的研究

目的 研究与肿瘤发生有关的细胞周期蛋白D1(CCND1)870A/G基因多态性与胃癌易感性的关系.方法 收集106例胃癌病例(包括胃体癌及胃窦癌)和108例非溃疡性消化不良患者的外周血白细胞,采用病例对照分子流行病学研究方法 ,以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术,进行CCND1基因型检测.结果 在病例组和对照组中CCND1 870位点野生型GG频率分别为19.8%和7.4%,携带AA基因型个体发生胃癌危险是携带GG型个体的0.28倍(P＜0.05,OR=0.281),即GG型个体更易感胃癌.分层分析表明,携带GG基因型个体分别在男性、年龄≥60岁及幽门螺杆菌感染亚组中患胃癌风险更高.结论 在中国胃癌高发区西安,CCND1 870A/G位点GG基因型人群更易感胃癌.     

特异性核酶对肝星状细胞细胞周期蛋白D1基因表达及激活的影响

目的研究抗细胞周期蛋白D1核酶对大鼠肝星状细胞(HSC)细胞周期蛋白D1基因表达及激活的影响。方法构建抗细胞周期蛋白D1核酶的真核表达载体,将其转染入HSC-T6细胞,同时以空白及转染pLXSN作为对照,用G418筛选出阳性细胞克隆;分别用RT-PCR和Western印迹法检测细胞周期蛋白D1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果转染核酶832的HSC细胞周期蛋白D1 mRNA和蛋白表达均受到明显抑制,分别为对照组的42．22％(P<0．01)和58．29％(P<0．01),同时α-SMA mRNA和蛋白表达与对照组相比也显著下降(P值均<0．01)。结论载体表达的特异性核酶能有效地抑制HSC的细胞周期蛋白D1的表达和激活。     

三氧化二砷对肝癌细胞株凋亡的诱导作用

目的研究三氧化二砷(As2O2)对人、鼠肝癌细胞株凋亡的诱导作用.方法用不同质量浓度(0.25,0.5,1,2,3,4 mg/L)的三氧化二砷处理体外培养的鼠7919,人HePG2肝癌细胞株,以MTT比色法、AO/EB荧光染色法、DNA凝胶电泳和免疫组化染色法检测细胞凋亡.结果不同浓度的三氧化二砷均可抑制7919,HePG2细胞生长;AO/EB荧光染色在荧光显微镜下观察肝癌细胞呈典型的凋亡形态学改变;DNA凝胶电泳呈梯形条带为凋亡的特征;免疫组化染色加药组bcl-2表达下调,bax表达上调,对照组bcl-2表达上调,bax表达下调,两株细胞结果相同.结论As2O3对两株细胞均有诱导凋亡作用.这为临床应用As2O3治疗肝癌提供了一个可供参考的实验依据.     

番茄红素上调细胞周期素依赖性激酶4和细胞周期素D1的表达促进人外周血内皮祖细胞周期进展

目的探讨番茄红素对人外周血内皮祖细胞活性、周期调控的作用及其分子机制。方法体外原代培养人外周血内皮祖细胞,采用噻唑蓝法、流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应、实时聚合酶链反应和Western blot方法检测番茄红素对内皮祖细胞活性、细胞周期分布的影响及细胞周期相关蛋白细胞周期素依赖性激酶4和细胞周期素D1的表达情况。结果噻唑蓝比色实验显示,不同浓度(0.01、0.1、1μmol/L)番茄红素能显著增加内皮祖细胞的生长能力,且呈一定的量效与时效关系;流式细胞仪分析显示,番茄红素呈浓度依赖性使内皮祖细胞的G0/G1期细胞比例减少,S期细胞比例增多;逆转录聚合酶链反应、实时聚合酶链反应和Western blot分析表明,番茄红素呈浓度依赖性使内皮祖细胞中细胞周期素依赖性激酶4和细胞周期素D1表达上调。结论番茄红素对内皮祖细胞的促进生长作用,可能与上调细胞周期素依赖性激酶4、细胞周期素D1的表达,使G0/G1期细胞比例减少有关。     

星形细胞上调基因1、β-连环素及周期素D1在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨肝细胞癌(HCC)组织中星形细胞上调基因(AEG)1、β-连环素(β-catenin)及周期素D1(Cyclin D1)的表达及临床意义。方法随机选取2013年7月-2014年12月贵州省人民医院经手术及病理证实为HCC的癌组织标本和对应癌旁组织各40例,另选取8例正常肝组织作为对照组。采用免疫组化SP法检测AEG-1、β-catenin及Cyclin D1蛋白在HCC组织、对应癌旁肝组织及正常肝组织中的表达情况,并分析其表达与HCC临床病理因素的相关性。计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法,AEG-1、β-catenin、Cyclin D1在HCC中的相关性采用Spearman等级相关分析。结果 AEG-1、β-catenin及Cyclin D1在HCC组织及癌旁肝组织中的表达均高于正常肝组织,差异均有统计学意义(χ2值分别为7.840、4.274、8.817、4.274、9.919、4.850,P值分别为0.005、0.039、0.003、0.039、0.002、0.028)。AEG-1、β-catenin、Cyclin D1的阳性表达在性别、年龄、HBs Ag、肿瘤大小方面差异无统计学意义(P值均0.05),而在病理分化程度、肝癌TNM分期及转移方面差异有统计学意义(P值均0.05)。相关性分析显示,AEG-1蛋白的表达与β-catenin、Cyclin D1蛋白的表达呈正相关(r值分别为0.420、0.741,P值均0.01)。结论 AEG-1、β-catenin及Cyclin D1在HCC的发生、发展过程中起着重要的作用;AEG-1可能通过上调Cyclin D1、β-catenin的表达和活性而促进HCC的发生和转移;联合检测三者的表达,可作为HCC基因治疗及预后评价的重要指标。     

人ZEB1基因真核表达载体的构建及其对肝癌细胞株HepG2增殖凋亡的影响

目的：探讨ZEB1基因与肝癌的关系,进一步揭示ZEBl基因在肝癌发生发展过程中的作用。方法：利用基因重组技术构建pCI-neo-ZEB1真核表达载体：脂质体介导转染技术转染肝癌细胞系HepG2。采用WesternBlot技术检测重组质粒的转染效率,CCK8比色法测定重组质粒转染对HepG2细胞体外增殖能力的影响,流式细胞术检测重组质粒转染后HepG2细胞凋亡率。结果：重组质粒经Nhel和Xbal双酶切、测序与ZEBl基因序列一致;利用脂质体介导将pCI-neo-ZEB1重组质粒转染HepG2细胞株,经WesternBlot技术检测ZEB1基因在蛋白水平稳定高表达;与对照组比较,人HepG2细胞株转染pCI-neo-ZEB1真核表达载体后细胞增殖能力增强,细胞凋亡率明显降低。结论：成功构建重组质粒Pci-neo-ZEB1并转入肝癌细胞株HepG2后,细胞增殖能力增强,凋亡减少。     

重组腺病毒载体携带多药耐药基因1反义RNA靶向逆转肝癌细胞多药耐药

目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA的重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 分别构建携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr及携带AFP启动子和增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP,将Adeno-EGFP转染人正常肝细胞L02(AFP-),人官颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测增强绿色荧光蛋白基因在各细胞的转录水平;将Adeno-asmdr转染HepG2R细胞,Western blot检测不同时间P-gp170的表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法检测HepG2R细胞凋亡,流式细胞术检测HepG2R细胞在不同药物作用下细胞周期、凋亡率.结果 增强绿色荧光蛋白基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著转录,而在L02细胞和HeLa细胞,其转录减少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性.Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,HepG2R细胞P-gp170表达明显减弱,HepG2R细胞凋亡增加,HepG2R细胞对多种化疗药物的耐受能力明显下降,细胞出现显著的周期阻滞,大量细胞被阻滞于S期和G0/M期,凋亡细胞比例增加.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,并可有效降低mdrl基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞多药耐药的逆转作用.     

肝癌细胞p53、p16及细胞周期蛋白D1表达的时间生物学对比

目的对比肝癌细胞中p53、p16和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达强度的时段特征.方法按年周期3个时段采集肝癌组织标本,每1个时段20例,均为肝细胞型肝癌及Edmondson-Steinet分级控制在Ⅱ～Ⅲ级内,用免疫组织化学S-P法进行p53、p16和Cyclin D1蛋白表达实验,表达强度按等级数据用秩和检验方法进行时段对比.结果p16表达出现时段差异有显著性(H=10.334,P＜0.05),即4～7月份为表达高峰期.结论肝细胞癌变及其生长的基因调控的时间生物学机制,p16可能起到重要作用.     

巨噬细胞移动抑制因子和细胞周期蛋白D1的表达与肝细胞癌生长和转移的关系

目的研究巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4）、磷酸化视网膜母细胞瘤易感基因产物蛋白（phospho—Rb）在HeC组织中的表达及其与癌细胞生长和转移的关系。方法应用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测93份HCC组织中MIF、Cyclin D1、CDK4和phospho—Rb的表达，分析它们的表达与HCC临床病理特征的关系。结果93份HCC组织中MIF、Cyclin D1、CDK4和phospho—Rb的表达率分别为71％、41％、82％和14％，MIF和Cyclin D1阳性表达率与正常肝脏组织表达率之间的差异有统计学意义（P〈0．01），CDK4和phospho—Rb阳性表达率与正常肝脏组织表达率之间的差异无统计学意义（P〉0．05）。在≥3．5cm的肿瘤中MIF表达率为79％，明显高于在〈3．5cm肿瘤中的表达率48％（P〈0．01）；有转移的肝癌组织中Cyclin D1阳性率为62％，明显高于无转移组织中的阳性率35％，差异有统计学意义（P〈0．05）。MIF表达强弱与Cyclin D1的表达呈正相关关系（P〈0，01）。CDK4和phospho—Rb的表达与肿瘤大小及是否转移的关系无统计学意义。结论MIF和Cyclin D1在HCC发展进程中可能促进肿瘤的生长和转移。     

Reversing effect of Tanshinone on malignant phenotypes of human hepatocarcinoma cell line

ＲｅｖｅｒｓｉｎｇｅｆｅｃｔｏｆＴａｎｓｈｉｎｏｎｅｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｉｎｅＹＵＡＮＳｈｕＬａｎＨＵＡＮＧＲｅｎＭｉｎ,ＷＡＮＧＸｉｕＪｉｅ,ＳＯＮＧＹｉａｎｄＨＵＡ...     

Reversing effect of Tanshinone on malignant phenotypes of human hepatocarcinoma cell line

AIM To study the reversing effect of Chinese drug tanshinone on malignant phenotype of cancer cells.METHODS Human hepatocarcinoma cell line (SMMC-7721) was treated in vitro with 0.5mg/L tanshinone for 4 days, and variation in cell differentiation was detected.RESULTS The morphology of cancer cells was tended toward well differentiation and cell growth was markedly inhibited. BrdU uptake assay and immunohistochemical stain of PCNA showed that the BrdU labeling rate and PCNA positive rate were lower than the controls, but no difference was found statistically as compared with all transretinoic acid. Flow cytometric assay demonstrated that S phase cells decreased and G0/G1 phase cells increased. Expression of c-myc oncogene protein decreased but the c-fos oncogene protein markedly increased.CONCLUSION Tanshinone could reverse the inducing differentiation in human hepatocarcinoma cells (SMMC-7721). It may become a new prospective inducer of cell differentiation to treat cancers.     

let-7c对HCCLM3细胞增殖的影响

目的 用瞬时转染的方法 研究let-7c对人肝癌细胞HCCLM3增殖的影响并探讨其机制.方法 用脂质体2000将miRNA转染人人肝癌细胞HCCLM3,设let-7c组转染let-7c,设对照组转染阴性对照miRNA,设空白组不做任何转染.用细胞计数试剂盒CCK-8检测转染后细胞生长增殖的变化,用流式细胞术检测各组细胞周期分布的差异.用Western blot和实时荧光PCR检测转染后细胞周期蛋白(cyclin) D1及其mRNA表达的变化.多组数据的两两比较采用LSD法.结果 let-7c组细胞在转染后48、72h时的吸光度值分别为0.70±0.05、0.77±0.09,低于空白组的0.97±0.10、1.21±0.12和对照组的0.91±0.07、1.12±0.09,各组比较,F值分别为14.431、21.146,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.转染后72h,let-7c使癌细胞处在G1期的细胞比例增加.空白组、对照组、let-7c组G1期的细胞比例分别为43.53％±0.86％、44.82％±0.77％、54.52％％±0.13％,各组比较,F=240.739,P＜0.01,差异有统计学意义.let-7c能抑制cyclin D1及其mRNA的表达,空白组、对照组、let-7c组cyclin D1的表达水平分别为0.48±0.09、0.47±0.06、0.23±0.06,各组比较,F=11.316,P＜0.01,差异有统计学意义; mRNA的相对表达量分别为1.03％±0.29％、1.01％±0.11％、0.63％±0.14％,各组比较,F=6.315,P＜0.05,差异有统计学意义.结论 let-7c能抑制HCCLM3细胞的增殖,并使细胞停留在G1期的细胞比例增加.导致这种现象的机制可能为let-7c抑制cyclin Dl及其mRNA的表达.