HSV-tk基因/GCV系统治疗鼠脑胶质瘤实验研究

探索ＨＳＶ－ｔｋ基因／ＧＣＶ系统对大鼠脑胶质瘤的体内外治疗效果。方法：用ＰＡ３１７细胞包装ＳＴＫ质粒,形成产病毒细胞ＰＡ３１７ｔｋ,产生假逆转录病毒颗粒,ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度。９６孔培养板接种２４孔Ｃ６细胞,２４孔Ｃ６ｔｋ＾＋细胞,４８小时后换入含ＧＣＶ的培养液,ＧＣＶ浓度按０、０．２５ｕｇ／ｍｌ、０．５ｕｇ／ｍｌ、０．７５ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｇ     

慢病毒载体介导的基因转导治疗帕金森病

慢病毒载体是很具有临床应用前景的基因转导手段 ,本文就慢病毒载体的概况、生物学特性、发展方向及在帕金森病基因治疗的应用作一综述     

中枢神经系统基因治疗的病毒载体

重组病毒载体因其自然感染途径而成为有效的基因转移手段。迄今为止，许多病毒载体，包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、腺相关病毒、慢病毒及多种杂交型病毒载体等，已应用于中枢神经系统基因治疗的基础和临床研究。本对其主要研究进展进行了综述。     

人KiSS-1基因克隆及其慢病毒载体的构建**★

背景：慢性病毒载体技术是目前转基因中最有效和最成功的方法，技术操作简便。 目的：克隆转移抑制基因KiSS-1基因不含信号肽的表达序列，构建人KiSS-1基因的慢病毒表达载体。 设计、时间及地点：开放性实验于2006-09/2007-12在福建师范大学发育学院实验室完成。 材料：载体pNL-IRES2-EGFP由福建师范大学发育学院实验室保存。 方法：从人正常胎盘组织中提取总RNA，经反转录-聚合酶链反应得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列，并将其克隆到慢病毒载体pNL-IRES2-EGFP中，构建其表达质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1。 主要观察指标：KiSS-1目的基因片段的克隆，重组表达质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1的酶切鉴定及测序。 结果：经酶切鉴定和基因序列测定，证实重组入载体pNL-IRES2-EGFP的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。 结论：成功构建了重组质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1。     

Vasculostatin慢病毒表达载体的构建

目的构建Vasculostatin慢病毒表达载体。方法通过基因合成方法获得Vasculostatin的完整序列,将此片段定向克隆到pL enti-CMV-EF1p-eG FP载体多克隆位点区,筛选重组质粒,采用磷酸钙方法将Lenti-CMV-Vasculostatin/EF1p-eG FP与载体pC MV-VSGS与pC MV-Gag-Pol共转染293T细胞,转染后收获上清离心纯化病毒并检测病毒滴度。结果成功构建Vasculostatin的慢病毒表达载体,检测病毒的滴度为2.5×107/ml。结论 Vasculostatin慢病毒表达载体为研究Vasculostatin对血管生成的抑制作用提供工具。     

构建携带重组人胰岛素基因慢病毒表达载体及其病毒包装

背景：腺病毒载体作为脂肪组织工程转基因载体,在应用中存在转导细胞免疫排斥及炎症反应等问题。应用慢病毒作为载体转染干细胞尤其是应用含胰岛素基因的慢病毒载体转染干细胞可避免腺病毒载体的诸多问题。 目的：实验拟构建含有人重组胰岛素(insulin)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行病毒颗粒包装。 方法：应用聚合酶链反应方法获得目的基因,在目的基因上、下游分别加上BamHⅠ,AscⅠ两个酶切位点,进行T载体克隆,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得重组质粒。用限制性内切酶酶切,将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选获得慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。 结果与结论：通过聚合酶链反应获得长度为347 bp带有BamHⅠ和AscⅠ序列的目的基因。pMD18-T 载体和慢病毒表达载体pLenti6.3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6.3 -insulin-IRES-EGFP构建与预期相匹配,成功包装慢病毒颗粒。     

中枢神经系统基因治疗中病毒载体的研究进展

基因治疗关键在于选择或构建合适的载体。常用于中枢神经系统基因治疗的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒载体等。不同病毒载体有各自优势和劣势。安全性、靶向性、高效性及神经细胞特异性是目前病毒载体的研究方向。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建*

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？ 目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞。 方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度。慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞。 结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL。慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞。     

脑胶质瘤的基因治疗与病毒治疗研究进展

由于脑胶质瘤肿瘤干细胞亚群的耐药性及药物难以通过血-脑屏障和脑组织免疫抑制等特点,目前的常规治疗手段并未明显提升患者的生存时间及生活质量.因此,在分子生物学进步的支持下,对脑胶质瘤新疗法的探索仍在继续.基因治疗包括将治疗用的遗传物质传送到肿瘤细胞中,从而产生特定的抗肿瘤效应.此外,因病毒具有强烈的细胞毒性作用和易于修饰...     

HSV—tk基因／GCV系统治疗脑胶质瘤时的免疫反应

目的 探讨tk基因治疗脑胶质瘤时的免疫反应与旁观者效应的关系。方法 将C6tk^ 与C6tk^-按0％tk^ ,10%tk^ ,30^tk^ 、50%tk^ 、100%tk^ 五种比例混合,接种于SD鼠右侧顶叶,7天后腹腔注射GCV（更昔洛韦）,剂量为30mg/kg/day,共10天。细胞接种3周后,处死动物,计算成瘤率,作病理检查,并作CD4^ 、CD8^ 的免疫组化染色。结果 50％及100％C6tk^ 组的在瘤率明显小于其余3组（P＜0．05）,病理检查发现50％及100％tk%^ 组有淋巴细胞及浆细胞浸润。免疫组化显示每一组之间均有差异,提示有免疫反应存在。结论 tk基因治疗脑胶质瘤时,可激起机体内的免疫反应,增强抗肿瘤作用,它是旁观者效应作用机制之一。     

反转录病毒介导的HSV-tk基因治疗大鼠脑胶质瘤的实验研究

目的：进行Ｃ６大鼠脑胶质瘤的基因治疗实验研究。方法：采用反转录病毒介导的基因转移和ＡＣＶ体内治疗方法进行研究。结果：构建了带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的反转录病毒载体ＧＩＮａＴＫ，应用脂质体转移方法将ＧＩＮａＴＫ导入反转录病毒包装细胞ＰＡ３１７，成为产病毒细胞ＰＡ３１７ＴＫ，用带有ＨＳＶ－ｔｋ基因的复制缺陷型反转录病毒感染Ｃ６细胞，命名为Ｃ６ＴＫ细胞，对ＧＣＶ和ＡＣＶ的敏感性分别高于亲本４５０倍和１０倍；成功地建立了大鼠脑胶质瘤模型，并证实转染细胞Ｃ６ＴＫ的成瘤效应未改变，存活期约为１５天；而经ＡＣＶ治疗后，含有Ｃ６ＴＫ细胞的肿瘤生长明显被抑制，大鼠生存期延长为５７．８±８．０７天，尤其是采用ＰＡ３１７ＴＫ细胞混和治疗组和原位治疗组，肿瘤基本消失，大鼠生存期显著延长，混和治疗组存活１２０天以上，原位治疗组存活至７１．４±３６．１天。ｔ检验，Ｐ值均小于０．００１。结论：ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统基因治疗大鼠脑胶质瘤疗效显著。     

Beclin1 基因慢病毒表达载体的构建和鉴定*☆

背景：Beclin1基因是哺乳动物的自噬调控基因。 目的：实验拟构建Beclin1 基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin1 基因的过表达效率。 结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin1 的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin1 基因慢病毒过表达载体。     

反转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞☆

背景：为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因。 目的：观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响。 方法：以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6预培养刺激后的BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞,实验组实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率。阴性对照组不做基因转移。阳性对照组为PA317-GCGPXSN细胞株。 结果与结论：①病毒滴度为1.9×108 CFU/L。②对照组BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞测定的荧光强度数值为0.63%,实验组为76.04%,两组相比差异有显著性意义(P < 0.01)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,结果证实细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因组中。     

自杀基因HSV-tk治疗胶质瘤的研究进展

自杀基因即通过转基因操作将某种代谢酶基因导入肿瘤细胞,表达的酶可以将无毒的化合物(前药物)转变成可杀死细胞的毒性药物,选择性的杀伤肿瘤细胞。目前人们对自杀基因单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)及其前药物系统进行了大量的临床前研究。通过旁观者效应可以杀灭未转染自杀基因的肿瘤细胞,成为治疗的关键,细胞间缝隙连接是最可能的机制。引入与HSVtk/GCV有协同作用的化学药物,采用重组的载体和目的基因及改善载体的转染方式和前药物的剂型可以有效的克服自杀基因在治疗胶质瘤的过程中存在效能不高、转染率低、载体和前药物系统毒性作用等缺点。     

REST/NRSF基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定***☆◆

背景：神经元限制性沉默因子(REST/NRSF)能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达。 目的：构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体。 方法：针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生L-shREST/NRSF慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。包装产生慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠骨髓间充质干细胞,采用 Real-time PCR方法检测靶基因在 mRNA 水平的沉默效率。 结果与结论：PCR和测序证实,构建出了REST/NRSF shRNA的慢病毒载体L-shREST/NRSF,并能稳定转染大鼠间充质干细胞,感染效率达100%。4组shRNA序列均有基因沉默效果,并以第3组shRN序列效果最为明显。结果表明,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

p53基因优化恶性胶质瘤HSV—TK／GCV治疗的体外研究

目的：研究p53基因优化恶性胶质瘤自杀基因治疗效果的可行性。方法：以腺病毒载体转导p53和HSV－TK入C6鼠胶质瘤细胞，给以不同浓度的GCV，MTT法监测细胞生存率，TUNEL法检测凋亡。结果：p53基因明显提高胶质瘤细胞对HSV－TK／GCV的敏感性，增加细胞凋亡。结论：p53和HSV－TK的联合基因治疗有望成为一种较佳的优化自杀基因治疗方案。     

骨髓间质干细胞作为基因载体治疗胶质瘤的研究进展

胶质瘤基因治疗的传统载体及神经干细胞都存在缺陷,近期研究表明骨髓间质干细胞作为胶质瘤治疗的新型载体,具有强大的迁移力、趋瘤性及低免疫原性和免疫调节功能等优点。     

miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与表达检测

目的 构建携带人miR-221 基因的miRNA 干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法.方法 合成含干扰序列的双链DNA oligo 直接连入酶切后的RNA 干扰载体上.将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR 鉴定,阳性克隆即为目的 基因RNA 干扰慢病毒载体质粒.再将目的 基因与目的 载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR 鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T 细胞,用western bolt 法检测其有效敲减靶序列.结果 重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576 的靶点干扰效果最好.结论 本实验成功构建了人miR-221 基因的RNA 干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列.     

壳聚糖作为基因载体及其改性*★

学术背景：基因治疗是近年来全球研究的热点，其最大障碍是缺乏有效的基因载体。非病毒性载体比病毒性载体具有更高的安全性，因而越来越受到人们关注。壳聚糖具有优良的生物相容性、生物可降解性、低毒以及高正电荷，是一种良好的非病毒性基因载体。带正电荷的壳聚糖能与带负电荷的DNA形成聚电解质复合物，有效复合保护质粒DNA免遭DNase酶解，使基因得以传递和表达。 目的：概述壳聚糖作基因载体及其改性研究所取得的有意义的最新研究进展。 检索策略：应用计算机检索Science Direct，Springer, Wiley数据库和中国期刊全文数据库1991-01/2007-12的有关文献，检索关键词为“壳聚糖、基因载体、DNA、进展”。共检索到425篇相关文献，其中英文文献217篇，中文文献208篇。对文献进行筛选，选取关键文章，对同一领域的文献选择近期发表或权威杂志的文献，排除重复研究的文章。最后70篇被选用。 文献评价：所选用的70篇文献中，60 篇为英文文献，10篇为中文文献；其中10篇为综述，其余均为实验研究论文。 资料综合：壳聚糖有优良的生物相容性、生物可降解性，无免疫原性，是当今最具潜力的非病毒性基因载体之一。通过优化壳聚糖的分子质量、脱乙酰度、N/P比、血清浓度和介质的 pH值等可对壳聚糖的转染效率和细胞吸收进行调控。化学改性壳聚糖，尤其是偶联配体可传递基因进入靶细胞。 结论：改性后的壳聚糖可作为潜在的优良基因载体。     

腺伴随病毒载体介导帕金森病猴基因治疗的实验研究

我们在以往的研究基础上,进一步探讨多巴胺合成酶基因的三重共转导对帕金森病灵长类模型基因治疗实验结果。