骨髓基质细胞的培养和保存方法

目的：建立大量生产骨髓基质细胞的培养和保存方法。为组织工程骨的培养提供种子细胞。方法：从4～5月龄新西兰大白兔胫骨上端髓腔抽吸骨髓，接种、培养及液氮冻存。通过显微镜观察其生物学表现，测定碱性磷酸酶，鉴定其生物学特征。结果：在培养过程中，未分化的骨髓基质细胞选择性粘贴于培养皿底，形态为成纤维细胞样，并呈集落生长。培养值至9-10天时，贴壁细胞单层融合。传代后的细胞形成集落的趋势明显下降，但细胞形态仍表现为成纤维细胞样，复苏细胞贴壁时间延迟，但增殖速度和形成没有改变。可测出碱性磷酸酶活性。结论：成功地建立了骨髓基质细胞的培养和冻存方法。     

丹酚酸B诱导体外培养大鼠骨髓基质细胞向心肌样细胞分化的研究

[目的]探讨大鼠骨髓基质细胞的体外培养及丹酚酸B(SalvianolicacidB)诱导其向心肌样细胞分化的可能。犤方法犦取大鼠股骨及胫骨干骨髓基质细胞(MSCs)培养,保留贴壁细胞进行传代;免疫细胞化学行肌动蛋白抗原、肌钙蛋白T抗原染色;观察丹酚酸B对骨髓基质细胞向心肌细胞分化的影响。犤结果犦大鼠骨髓基质细胞在形态上呈贴壁集落生长,具有成纤维细胞样外观。丹酚酸B加入5-氮胞苷诱导组后细胞死亡较少,长方形、多角形细胞明显增多。犤结论犦丹酚酸B能够促进体外诱导骨髓基质细胞向心肌样细胞的分化。     

兔骨髓基质细胞在诱导条件下的成骨特性

目的 观察兔骨髓基质细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法 使用密度梯度离心分离兔骨髓基质细胞进行培养，保留贴壁细胞传代，观察在培养液中添加地塞米松，维生素C，β－甘油磷酸钠条件下骨髓基质细胞生长及成骨分化情况。结果 骨髓基质细胞呈成纤维细胞样表现，增殖能力强。诱导条件下第2代细胞的碱性磷酸酶活性明显增高，10－12d达到最高峰，并且出现矿化结节。结论 使用本实验方法，获得的骨髓基质细胞成骨能力肯定，增殖能力强，可作为骨组织工程的种子细胞。     

丹酚酸B诱导体外培养大鼠骨髓基质细胞向心肌样细胞分化的研究*

[目的]探讨大鼠骨髓基质细胞的体外培养及丹酚酸B(Salvianolic acid B)诱导其向心肌样细胞分化的可能.[方法]取大鼠股骨及胫骨干骨髓基质细胞(MSCs)培养,保留贴壁细胞进行传代;免疫细胞化学行肌动蛋白抗原、肌钙蛋白T抗原染色;观察丹酚酸B对骨髓基质细胞向心肌细胞分化的影响.[结果]大鼠骨髓基质细胞在形态上呈贴壁集落生长,具有成纤维细胞样外观.丹酚酸B加入5-氮胞苷诱导组后细胞死亡较少,长方形、多角形细胞明显增多.[结论]丹酚酸B能够促进体外诱导骨髓基质细胞向心肌样细胞的分化.     

犬骨髓基质千细胞向软骨样细胞诱导分化的条件研究

目的研究犬骨髓基质干细胞在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的最佳条件。方法从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF．B1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。结果原代培养的基质干细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF．131）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。结论犬骨髓基质干细胞在体外培养在碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF—β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养诱导为心肌样细胞的实验研究

目的 研究大鼠骨髓基质细胞体外培养及向心肌样细胞转化的条件。方法 取成年大鼠胫骨干骨髓基质细胞进行培养，保留附壁细胞传代，观察在培养液中添加诱导剂5－氮胞苷条件下骨髓基质细胞的生长和分化。结果 在形态上，大鼠骨基质细胞贴壁呈集落生长，有成纤维细胞样外观。5－氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，在诱导后4周转化率接近30％。结论 骨髓基质细胞能够在体外被诱导分化为心肌样细胞，是自体心肌细胞一种良好的供体来源。     

大鼠骨髓基质细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性

目的 研究大鼠骨髓基质细胞(rMSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法 使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓基质细胞进行培养,保留贴壁细胞传代,观察、测试在培养液中添加成骨诱导剂地塞米松（Dex)10^-8mol/L、β-甘油磷酸钠（β-GP）10mmol/L,抗坏血酸（AA）50μg/ml条件下骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果 形态学观察表明,rMSCs贴壁细胞呈集落生长,有成纤维细胞样外观,利用MTT法和流式细胞术（FCM）测定增殖的结果表明,传代次数增加,rMSCs的增殖活性升高。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞的增殖,而且对多次传代细胞促增殖作用明显。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞成骨、在诱导3周时即出现明显的钙化结节。组织化学染色结果显示,非诱导条件下MSCs的碱性磷酸酶（ALP）水平会随传代而升高,传3代rMSCs的ALP的表达较弱,诱导一周后ALP的表达明显升高,超过未加诱导剂的传一代大鼠成骨细胞（OB）的ALP表达。结论 本实验表明所培养的rMSCs仍处于低分化水平,具有骨祖细胞的特性。     

非诱导条件下犬骨髓基质细胞的生物学特性

目的 研究体外培养骨髓基质细胞(BMSC)的生长特点和非诱导条件下的成骨特性。方法 采用犬来源BMSC体外扩增培养，观察非诱导条件下BMSC生长变化和成骨分化。结果 形态学观察表明，BMSC贴壁细胞呈集落生长，有成纤维细胞样外观，未加入成骨诱导剂，细胞形态发生变化，钙沉积出现，碱性磷酸酶(ALP)表达。3代内扩增的BMSC有成骨活性，但原代细胞成骨活性优于传代后细胞。结论 体外培养BMSC能大量扩增，具有自然向成骨细胞分化的能力，是骨组织工程理想的种子细胞。本实验所培养的BMSC具有骨祖细胞特性。     

犬骨髓基质干细胞分离培养与向软骨样细胞诱导分化的研究

【目的】探讨犬骨髓基质干细胞的提取、分离和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的可能。【方法】从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF-β1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。【结果】原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子（TGF-β1）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。【结论】犬骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好和持续扩增,在碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子（TGF-β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

犬骨髓基质干细胞分离培养与向软骨样细胞 诱导分化的研究

 【目的】 探讨犬骨髓基质干细胞的提取。分离和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的可能。【方法】 从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子-B1(TGF-B1)对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。【结果】 原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落融合周期约6 ~ 9 d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-B1)诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性。阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。【结论】 犬骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好和持续扩增,在碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-B1)作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

大鼠骨髓基质细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性

目的　研究大鼠骨髓基质细胞 (r MSCs)的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。方法　使用密度梯度法分离成年大鼠骨髓基质细胞进行培养 ,保留贴壁细胞传代 ,观察、测试在培养液中添加成骨诱导剂地塞米松 (Dex) 10 - 8mol/ L、β-甘油磷酸钠 (β- GP) 10 mm ol/ L,抗坏血酸 (AA) 5 0 μg/ ml条件下骨髓基质细胞的生长变化和成骨分化。结果　形态学观察表明 ,r MSCs贴壁细胞呈集落生长 ,有成纤维细胞样外观。利用 MTT法和流式细胞术 (FCM)测定增殖的结果表明 ,传代次数增加 ,r MSCs的增殖活性升高。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞的增殖 ,而且对多次传代细胞促增殖作用明显。成骨诱导剂促进骨髓基质细胞成骨 ,在诱导 3周时即出现明显的钙化结节。组织化学染色结果显示 ,非诱导条件下 MSCs的碱性磷酸酶 (AL P)水平会随传代而升高。传 3代 r MSCs的 AL P的表达较弱 ,诱导一周后 AL P的表达明显升高 ,超过未加诱导剂的传一代大鼠成骨细胞 (OB)的 AL P表达。结论　本实验表明所培养的 r MSCs仍处于低分化水平 ,具有骨祖细胞的特性。     

1,25—VitD3在骨髓基质细胞体外培养中的作用

用条件培养液对骨髓基质细胞进行体外培养，通过倒置显微镜观察，组织化学染色，分析１，２５－ＶｉｔＤ３促进骨髓基质细胞形成成纤维细胞集落的作用，结果表明：１，２５－ＶｉｔＤ３有明显促骨髓基质细胞增殖作用，但主要表现在体外培养中的非贴壁细胞组份（Ｐ〈０．０１），对贴壁细胞组份无明显增殖作用（Ｐ〉０．０５）。     

儿童骨髓基质细胞体外培养

目的 探讨儿童骨髓基质细胞体外培养条件,为儿童骨组织工程研究选择种子细胞。方法 将儿童髂骨内骨髓分别采用密度梯度离心法和全骨髓法培养,待细胞长满培养瓶后传代,选取正常生长骨髓基质细胞第3代绘制生长曲线并测定细胞内骨钙素(OCN)及培养液中碱性磷酸酶(ALP)含量。培养期间用倒置相差显微镜观察细胞形态。结果 原代儿童骨髓基质细胞呈长梭形、三角形或多角形,存在有集落样生长特性,传代后细胞形态无明显变化,且生长、增殖稳定,细胞内OCN及培养液中ALP含量在1周左右达到高峰。结论 采用密度梯度离心法和全骨髓法获得儿童骨髓基质细胞,经培养、传代后,可以得到大量稳定增殖的骨组织工程种子细胞。     

1,25-VitD_3在骨髓基质细胞体外培养中的作用

用条件培养液对骨髓基质细胞进行体外培养，通过倒置显微镜观察、组织化学染色，分析1，25－VitD3促进骨髓基质细胞形成成纤维样细胞集落的作用。结果表明：1，25－VitD3有明显促骨髓基质细胞增殖作用，但主要表现在体外培养中的非贴壁细胞组份（P＜0.01）。对贴壁细胞组份无明显增殖作用（P＞0.05）。     

人胚成骨细胞的分离培养及生物特性的研究

目的 观察体外条件下成骨细胞生物学特性，为研究骨代谢提供一种体外模型。方法取人胚胎颅骨骨膜，采用酶消化法获取成骨细胞体外培养并传代。观察细胞形态，生物特性，绘制生长曲线，并经碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞以及比较冻存前3～5代与冻存后成骨细胞的特点。结果体外培养的骨膜成骨细胞形态多为梭形和多角形与成纤维细胞相似，3～5代成骨细胞生长特点稳定，具有成骨能力，冻存后成骨细胞生存率、增殖能力明显受到影响。结论自骨膜获取人成骨细胞培养方法易形，可大量培养高纯度的人成骨细胞供研究使用，冻存细胞不易作为研究对象。     

骨髓基质细胞体外成骨的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞体外培养的成骨能力,为细胞移植修复骨缺损提供一条新途径。方法 取新西兰大白兔股骨大转子处骨髓,进行体外培养,纯化,10－14天后进行转代。培养后的细胞经倒置显微镜,透射地镜,钙染色,碱性磷酸酶染色等方法进行观察。结果 培养纯化后的细胞呈梭形,多角形,电镜显示具有分泌功能旺盛的结构,碱性磷酸酶染色强阳性,培养3－4周后,能形成钙结节。细胞在体外能多次传代,维持成骨表型。结论 骨髓基质细胞在体外培养纯化后,骨与成骨细胞相似的形态结构和生物学特性,能形成钙化的骨样组织。     

小鼠骨髓基质细胞形态及其对造血的调控

应用体外骨髓基质细胞贴壁培养的方法,观察了小鼠骨髓贴壁细胞的形态及其对造血的调控作用。结果表明,两类大小、形态、吞噬功能及组化染色有所差异的基质细胞群体分别具有巨噬细胞和成纤维细胞样特征。贴壁细胞对粒—单系祖细胞的增殖表现为明显的刺激作用,而对多能造血干细胞无明显调控。提示骨髓基质细胞在造血祖细胞阶段的分化增殖过程中具有一定作用。     

冻存骨髓基质细胞体外成骨潜能的实验研究

目的 观察冻存骨髓基质细胞（BMSC）的体外生长特点及诱导与非诱导条件下的成骨能力。方法 取冻存11个月犬BMSC复苏后进行体外扩增培养，传代培养中加入10^-8mol／L地塞米松、50mg／L Vit C和10mmol／L β-甘油磷酸钠进行诱导分化，观察细胞形态、细胞诱导前后增殖情况、细胞碱性磷酸酶（ALP）含量以及形成矿化结节能力的改变。结果 冻存BMSC复苏后呈成纤维样表现，增殖力强。在诱导液的作用下冻存BMSC增殖性能降低，ALP活性增加，诱导5d后可见矿化结节。结论 冻存BMSC增殖能力强，经诱导后表现出明显的成骨活性，可作为骨组织工程的种子细胞。     

病理性瘢痕成纤维细胞模型的建立

目的建立病理性瘢痕成纤维细胞体外模型，为观察其生物学行为、研究病理性瘢痕发生机理奠定基础。方法以病理性瘢痕和正常皮肤为标本，组织块培养法原代培养成纤维细胞．经传2-3代后冻存、复苏细胞，观察细胞游出、增殖、复苏后活力情况等。结果7-12天左右，病理性瘢痕成纤维细胞游出，3周左右可以首次传代，收集2-3代细胞经冷冻、复苏后细胞活力佳，性状稳定，为合适的病理性瘢痕成纤维细胞模型。结论组织块培养法结合细胞冻存，可以成功建立病理性瘢痕成纤维细胞模型。     

人骨髓基质细胞的分离、培养及成骨鉴定

目的建立一种体外分离培养人骨髓基质细胞 (HumanBoneMarrowStromalCells ,hBMSCs)的方法。方法 :从髂棘 (髂前或髂后 )抽取骨髓液 5～ 8ml,经密度离心后的骨髓单核细胞 ,以 10 6/ml浓度接种培养 ,贴壁细胞接近长满后 ,进行传代培养 ,每传一代约 5～ 7d。培养期间进行碱性磷酸酶的检测和钙染色。结果 :原代培养和传代培养的细胞均为贴壁、形态不一的细胞。两种细胞在体外可向成骨方向转化。结论 :人骨髓基质细胞在体外长期培养后仍具有成骨能力 ,为骨髓中间充质干细胞 ,掌握其培养方法为其广泛应用奠定基础。