耐头孢曲松淋球菌菌株的体外人工诱导及多重耐药现象

目的探讨体外人工诱导耐头孢曲松淋球菌的可行性,为研究淋球菌耐头孢曲松的机制提供实验菌株。方法将对头孢曲松敏感的标准株ATCC49226(MIC 0.004ug/mL)和临床株ZSSY00205(MIC 0.25ug/mL)以头孢曲松次抑菌浓度法连续传代培养,定期监测生物学和分子生物学特性,诱导耐药成功后检测耐药菌株的稳定性,并分析诱导耐药前、后菌株RAPD图谱的改变及对其它抗菌药物耐药性的改变。结果诱导后菌株ATCC49226和ZSSY00205对头孢曲松的MIC值是诱导前的125倍,诱导前、后菌株RAPD图谱未见明显改变,但头孢曲松诱导耐药后的淋球菌对青霉素、四环素、红霉素和环丙沙星的敏感性下降。结论体外头孢曲松次抑菌浓度法可诱导产生头孢曲松耐药株,淋球菌对头孢曲松产生耐药的同时,可对包括青霉素、四环素、红霉素、喹诺酮在内的多种抗菌药物产生耐药或耐药性增加,即多重耐药现象。     

penA和mtrR基因突变在体外诱导淋球菌对头孢曲松耐药作用的研究北大核心CSCD

目的探讨penA、mtrR基因突变在淋球菌对头孢曲松耐药中的作用。方法分别选取淋球菌标准菌株（ATCC-49226）、临床头孢曲松敏感菌株（2012．4052、2012．15361）及低敏菌株（2012．5616）,体外次抑菌浓度诱导对头孢曲松耐药,提取诱导前原代菌株及诱导后子代耐药菌株的DNA,对penA和mtrR基因进行扩增与测序。结果菌株2012—5616和ATCC．49226分别在诱导至第26和28代时获得最低抑菌浓度（MIC）≥1mg／L的耐药菌株,菌株2012—4052和2012．15361分别在诱导至第22和36代时获得MIC≥0．5mg／L的耐药菌株。penA基因测序结果显示,ATCC-49226菌株诱导后出现A501T和G542S突变位点,另3株菌诱导前后penA基因均未出现新的突变位点;4株突变菌株的青霉素结合蛋白2（PBP2）基因序列型都为XⅧ,未检测到penA镶嵌状结构模式。mtrR基因测序结果显示,2012—5616和ATCC-49226菌株在诱导前后均发生A39T突变,2012-4052菌株诱导后在mtrR编码区发生A39T突变。结论penA基因中的A501T和G542S突变与mtrR基因发生的A39T突变可能在头孢曲松耐药中发挥作用。     

淋球菌对阿奇霉素耐药性与mtrR/mtrC基因变异的关联分析

目的探讨mtr系统若干基因变异与淋球菌对阿奇霉素耐药性的相关性。方法对临床分离的淋球菌阿奇霉素耐药性代表株mtrR基因序列及mtrR启动子区域回文结构序列的突变进行分析,使用荧光定量PCR技术对结构基因mtrC的表达水平进行测定。结果所有中等以上耐药菌株均发生mtrR基因H105Y的变异,伴随mtrR启动子区域回文结构的缺失突变;敏感株有一株出现G45D的突变,mtrR启动子区域回文结构未检测出突变;中等以上耐药菌株与敏感菌株相比mtrC基因表达有显著差异(P<0.05)。结论mtrR基因的H105Y变异和回文序列碱基缺失与mtrC表达有负向相关关系,与淋球菌阿奇霉素耐药性显著相关。     

不同耐药淋球菌菌株IR基因突变与mtrC基因转录水平的差异性比较

目的：研究不同耐药淋球菌菌株多传递耐药（mtr）系统反向重复序列（IR）区基因突变与mtrC基因转录水平的差异性,进一步探索mtr系统介导耐药的机制。方法：采用琼脂稀释法测定抗生素对菌株的最小抑菌浓度（MIC）,PCR扩增含IR区的目的基因并对扩增产物测序,同时采用反转录（RT）-PCR检测mtrC基因mRNA表达水平的变化。结果：5株敏感株及5株仅耐青霉素菌株无IR区基因突变,16株多重耐药菌株中IR区均有碱基A／T缺失。敏感株mtrC转录水平显著低于耐药株（P〈0．05）,而耐药菌株组中IR区碱基突变组mtrC转录水平显著高于无突变组（JP〈0．05）。结论：淋球菌染色体mtrR启动子区域的IR区基因突变会引起mtrC基因转录增加,进而提高奈瑟淋球菌的耐药性。     

头孢曲松次抑菌浓度诱导淋球菌耐药及交叉/多重耐药现象的探讨

目的:利用体外次抑菌浓度法诱导耐头孢曲松淋球菌,探讨其交叉耐药与多重耐药现象,为淋球菌耐头孢曲松机制的研究提供菌株和初步的理论基础.方法:将对头孢曲松敏感的标准株WHOA、WHOC、WHOD、WHOE及临床株ZSSY016以头孢曲松次抑菌浓度法连续传代培养,定期监测生物学特性,分析诱导前后菌株RAPD图谱的改变结果,并以琼脂稀释法检测诱导前后及诱导过程中菌株对其他抗生素耐药性的变化.结果:诱导后菌株对头孢曲松的MIC值提高了4～256倍,对青霉素、头孢呋辛的MIC值也发生了不同程度的耐药,对四环素、环丙沙星及大观霉素的耐药性变化未发生显著改变.结论:体外次抑菌浓度法可诱导耐头孢曲松淋球菌,诱导易感性存在菌株间的个体差异,耐头孢曲松机制与交叉耐药/多重耐药机制存在多样性.淋病治疗应合理足量应用抗生素,以防止体内诱导产生耐药菌株.     

耐药淋球菌差异DNA消减文库的构建及初步筛选

目的 克隆和研究耐药性淋球菌相关基因。方法 从耐药淋球菌株RSM292C4和淋球菌标准参考菌株WHO-A细胞中提取DNA,经RsaⅠ酶切后,应用抑制性消减杂交技术构建耐药性淋球菌差异DNA消减文库并进行初步筛选。结果 耐药淋球菌差异DNA消减文库经扩增获得约2500个白色克隆,随机挑取96个白色克隆,进行PCR扩增鉴定,发现克隆中插有100~600bp大小的片段。分别以RsaI酶切样本和参照DNA为探针,与随机挑取的96个白色菌落质粒作点杂交,有5个克隆仅能与样本DNA探针杂交,而不能与参照DNA探针杂交,表明它们为RSM292C4基因组DNA所特有,可能代表某些淋球菌新基因。对这5个克隆插入的DNA片段进行测序,经送基因库和淋球菌基因组部分测序基因库检索分析,发现5个片段均为未知新序列。结论 淋球菌耐药菌株DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆淋球菌耐药的新基因奠定了基础。     

深圳市头孢曲松低敏淋病奈瑟菌株耐药基因分析

了解penA、ponA、porB和mtrR突变与深圳市淋球菌对头孢曲松敏感性降低的相关性。方法 收集2009—2011年深圳市淋球菌临床分离株296株,采用琼脂稀释法筛选出头孢曲松低敏株［MIC （0.06 ~ 0.50） μg/ml］53株。将头孢曲松低敏菌株以及按照1 ∶ 1抽样原则随机抽取的53株高敏菌株,共计106株淋球菌作为试验菌株。对所有菌株penA、ponA、porB和mtrR基因进行PCR扩增以及DNA测序分析。 结果1株淋球菌的青霉素结合蛋白2（penicillin?鄄binding protein 2,PBP2,由penA基因编码）具有镶嵌样结构（MIC 0.125 0 μg/ml）,对剩余105株淋球菌PBP2的氨基酸序列分析,共得到16个不同的氨基酸模式。模式ⅩⅢ、ⅩⅧ、ⅩⅩⅩⅧ对应的头孢曲松MIC值相对较高（MIC50均为0.062 5 μg/ml）,而模式Ⅱ的头孢曲松MIC值相对较低（MIC50为0.008 0 μg/ml）。mtrR、porB以及ponA突变在头孢曲松低敏组和高敏组中的发生率,差异无统计学意义（均P > 0.05）。 结论 PBP2镶嵌样结构可能不是深圳市淋球菌对头孢曲松敏感性降低的主要原因,非镶嵌样PBP2 500 ~ 580位多个氨基酸突变产生的不同氨基酸模式联合mtrR、porB以及ponA突变在诱导淋球菌对头孢曲松敏感性降低中可能有意义。     

淋球菌多重耐药调控子的研究进展

多重可传递的耐药mta基因系统决定着淋球菌对各种结构各异的疏水制剂（HAs) 包括抗生素，胆盐及脂肪酸等的耐受水平。此mtr基因系统是由1个调节基因mtrR，3个结构基因mtrC,mtrD,mtrE组成。在转录水平上将mtr系统分为两种机制，一种是mtrR依赖调节机制，另一种是非mtrR依赖调节机制。前者是由于mtrR基因突变所致，后者是由于在mtrR和mtrC之间的启动区基因突变所致。这两种机制所引起的对HAs的耐药水平不同，前者的最小抑菌浓度（MIC）低，后者的MIC高。     

正确认识和应对耐头孢曲松淋球菌

现阶段所称的"耐头孢曲松淋球菌"是指临床上出现的、由染色体基因突变而形成的对目前最有效的淋病治疗一线药物头孢曲松产生耐药的淋病奈瑟菌的新变种,代表性菌株是首次发现于日本的H041以及后来出现在法国的F89。目前,淋球菌对头孢曲松敏感性下降的趋势已很明显,并且多重耐药和交叉耐药情况比较普遍。尽管如此,国内外耐头孢曲松淋球菌菌株仍是散发出现,尚未形成大范围流行。淋球菌对头孢曲松耐药主要是由染色体基因突变介导,涉及的基因包括penA、penB和mtrR等,其中镶嵌型penA基因起主要作用,但迄今关于淋球菌对头孢曲松耐药机制的认识仍然不够全面。应对"耐头孢曲松淋球菌",应坚持预防为主、遵循合理用药的原则、加强淋球菌对头孢曲松耐药的监测以及注意淋病治疗新药的研发。     

淋病奈瑟菌对头孢曲松耐药性及敏感性降低机制的研究进展

头孢曲松为目前治疗淋病的首选药物之一,国内外淋球菌耐药监测均发现淋球菌对头孢曲松敏感性降低,并已发现少数散发的头孢曲松耐药株。淋球菌对头孢曲松敏感性降低主要由染色体介导,目前大多数研究主要关注三个方面：一是抗生素作用靶位点的改变,影响抗生素与淋球菌的结合产生耐药;二是细菌细胞膜孔蛋白的改变,导致膜通透性降低产生耐药;三是外排系统的改变,导致细菌外排作用增强产生耐药。涉及的基因有penA、ponA、porB和mtrR等。     

淋球菌对头孢曲松和头孢克肟耐药现状及耐药机制研究进展

世界各地不断分离出对头孢曲松和头孢克肟敏感性下降的淋球菌菌珠.penA、mtrR、DorB1b和ponA基因是与淋球菌对头孢菌素敏感性下降的主要相关基因.研究表明,镶嵌状penA基因导致淋球菌对头孢克肟敏感性降低,并可能导致淋球菌对头孢曲松敏感性下降.mtrR、porB1b和ponA基因突变与淋球菌对头孢克肟和头孢曲松敏感性下降有明确关系,镶嵌状penA、mtrR、porB1b和ponA基因多态性可能共同导致淋球菌对头孢曲松和头孢克肟的敏感性明显降低.     

淋病奈瑟菌mtrC膜蛋白基因的克隆和表达

目的 构建淋病奈瑟菌膜蛋白mtrC表达质粒,探讨淋病奈瑟菌耐药的检测和耐药机制.方法 从淋病奈瑟菌标准株中扩增淋病奈瑟菌膜蛋白mtrC基因片段.酶切后插入pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-mtrC.通过质粒双酶切和DNA测序证实该重组质粒构建正确.重组质粒转化入大肠杆菌DE3中.经IPTG诱导表达蛋白.结果 经酶切鉴定和测序分析,质粒构建正确.核苷酸序列与GeneBank(U14993)公布的序列相比较,同源性达到99.5%.通过IPTG诱导,SDS—PAGE可检测到约48500大小的融合蛋白,与预测分子量相同.结论 淋病奈瑟菌膜蛋白mtrC原核表达质粒构建和表达成功,为研究其mtrC外排系统的耐药机制打下基础.     

High occurrence of simultaneous mutations in target enzymes and MtrRCDE efflux system in quinolone-resistant Neisseria gonorrhoeae

BACKGROUND: Emergence of multidrug-resistant Neisseria gonorrhoeae resulting from new genetic mutations is a serious threat to controlling gonorrhea. GOAL: To determine 1) antimicrobial susceptibilities and the corresponding genetic mutations and 2) the role of MtrRCDE efflux system in gonococcal resistance to fluoroquinolones. STUDY DESIGN: Antimicrobial susceptibility testing and sequence analysis of gyrA, parC, and mtrR loci of 131 N. gonorrhoeae isolates from Japan. RESULTS: The proportion of N. gonorrhoeae strains resistant and intermediate-resistant to antimicrobials was 25.2% and 48.9% for ciprofloxacin, 25.2% and 30.5% for ofloxacin, 12.2% and 53.4% for penicillin; and 17.6% and 51.1% for tetracycline, respectively. Strains were categorized into 22 mutation profiles, with GyrA-S91F/ParC-D86N/MtrR-G45D being the most predominant profile. The frequency of mutation in gyrA, parC, mtrR, and the mtrR promoter was 71%, 47.3%, 77.1%, and 23.7%, respectively. Seventy-one percent of strains carried mutations in both gyrA and mtrR. CONCLUSION: This study reports simultaneous mutations in fluoroquinolone target enzymes and the MtrRCDE efflux system as a fluoroquinolone-resistant mechanism in N. gonorrhoeae.     

Analysis of the antibiotic sensitivity of Neisseria gonorrhoeae in Guangzhou, Peoples Republic of China

BACKGROUND: Sexually transmitted diseases began to re-emerge in China in the mid 1980s. During the last one and a half decades, Neisseria gonorrhoeae infection has become one of the three most common sexually transmitted diseases in China. At present, resistant strains of N. gonorrhoeae are increasing each year. This study was undertaken to better understand the sensitivity of five antibiotics to N. gonorrhoeae isolates in Guangzhou, China. GOAL: To determine the frequency and diversity of antibiotic resistance, particularly to penicillin and tetracycline, on gonococcal strains in Guangzhou. STUDY DESIGN: Strains of N. gonorrhoeae isolates from 203 patients with uncomplicated urethral gonococcal infections from Guangzhou, China were reviewed from September 1997 to August 1998. All strains were characterized with five different antimicrobials for sensitivity, including penicillin, tetracycline, spectinomycin, ciprofloxacin, and ceftriaxone. RESULTS: Penicillin resistance was present in 121 of 203 isolated strains (59.6%). The plasmid-mediated strains and chromosome-mediated strains among the penicillin-resistant strains that were resistance to penicillin were 5.8% and 94.2%, respectively. Plasmid-mediated strains resistant to penicillin and tetracycline were each 3.4%. Most isolated strains were resistant to ciprofloxacin, accounting for 60.6%. All strains were sensitive to spectinomycin and ceftriaxone. CONCLUSION: N. gonorrhoeae isolates exhibited a high rate of resistance to penicillin and ciprofloxacin. Spectinomycin highly effective for penicillin-producing N. gonorrhoeae, tetracycline-resistant N. gonorrhoeae and the highly resistant strains of ciprofloxacin.     

淋病奈瑟菌耐药性的分子基础初探

目的：研究染色体介导淋病奈瑟菌耐药的机制。方法：应用抑制性消减杂交技术构建和筛选耐药淋病奈瑟菌差异DNA消减文库。结果：从削减文库中随机挑取的96个克隆，发现其中有47个克隆仅能与tester DNA探针杂交，而不能与driver DNA探针杂交。结论：这些克隆中载有特异基因片段，它们为RSM292C4基因组DNA所特有，可能代表某些淋病奈瑟菌新基因。