人巨细胞病毒感染对人脑血管平滑肌细胞AT受体基因表达的影响

目的:探讨血管紧张素受体1、2(AT1,AT2)及人巨细胞病毒(HCMV)感染在动脉粥样硬化过程中的作用。方法:建立HCMV感染细胞模型,采用RT-PCR等技术研究在更昔洛韦(GCV)和AT1、AT2受体拮抗剂作用下,HCMV对体外培养人脑动脉血管平滑肌细胞AT1和AT2受体基因表达的影响。结果:HCMV感染体外培养的人脑血管平滑肌细胞上调了AT1和AT2受体的基因表达,AT1和AT2受体拮抗剂及GCV能够抑制HCMV感染对人脑血管平滑肌AT1和AT2受体的激活作用。结论:HCMV感染引起人脑血管平滑肌细胞增生可能由于AT1和AT2受体基因表达的激活。     

丁基苯酞对脑出血大鼠血管内皮生长因子、血管生成素-2蛋白表达及血管新生的影响

目的 通过观察大鼠脑出血后脑组织中血管内皮生长因子（vaseular endothelial growth factor, VEGF）、血管生成素-2（angiopoietin-2,Ang-2）蛋白在不同时间点的动态表达及不同剂量丁基苯酞干 预后其与新生血管数量的变化,探讨丁基苯酞对脑出血大鼠可能的神经保护作用及机制。 方法 通过自体血注入法制备SD大鼠脑出血模型并随机分为脑出血模型组、丁基苯酞低剂量组 及丁基苯酞中剂量组,以及对照的假手术组。丁基苯酞低、中剂量组大鼠分别予以丁基苯酞10 mg/kg、 25 mg/kg灌胃给药（每日2次）,假手术组及脑出血模型组大鼠则在相同时间用同等体积大豆油代替 灌胃。分别在术后1 d、3 d、7 d、15 d评估大鼠神经功能缺损,采用免疫组化法检测各时间点CD34的表 达并进行新生血管计数及血管场面积测定,检测各时间点VEGF、Ang-2蛋白的表达,测定脑出血大鼠 血肿体积。 结果 与脑出血模型组比较,丁基苯酞中剂量组在术后各时间点,低剂量组术后7 d、15 d VEGF蛋 白表达上调;丁基苯酞低、中剂量组术后各时间点An g-2蛋白表达均上调,血管计数均增多;丁基苯酞 低剂量组术后3 d的神经功能缺损评分较低,丁基苯酞中剂量组术后3 d、7 d、15 d的神经功能缺损评 分较低,上述差异均有统计学意义。丁基苯酞低、中剂量组与脑出血模型组,在术后7 d、15 d血肿体 积差异无统计学意义。 结论 丁基苯酞可以显著减轻脑出血大鼠的神经功能缺损,其作用机制可能与上调VEGF、Ang-2蛋 白的表达,增加脑出血血肿周围新生血管密度有关,同时未增加血肿增大的风险。     

脑缺血耐受大鼠脑组织血管内皮生长因子和血管生成素-1表达的改变及其意义

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素-1(Ang-1)在短暂性脑缺血预处理(IP)诱导的脑缺血耐受大鼠脑组织表达的改变及其意义。方法将99只Wistar大鼠随机分成对照组(9只)、非IP(NIP)组(45只)和IP组(45只)。大脑中动脉线栓法建立局灶性IP模型,NIP组以假手术代替预缺血,分别在IP后1、3、7、14、21 d予以缺血2 h、再灌注22 h,对照组2次均为假手术。大鼠处死前给予神经功能缺损评分(NDS),采用TTC染色测定脑梗死体积,免疫组化染色法检测脑组织VEGF、Ang-1蛋白表达。结果对照组大鼠脑组织无梗死灶,NDS为0。IP 1、3、7 d亚组NDS和梗死体积显著小于NIP组1、3、7 d亚组(P<0.01～0.05),其中IP 3 d亚组NDS最低,梗死体积最小。对照组脑组织少量VEGF蛋白表达,IP 1、3、7 d亚组VEGF蛋白表达显著高于NIP 1、3、7 d亚组(均P<0.05),其中IP 3 d亚组VEGF蛋白表达最高。各组脑组织均有一定程度Ang-1蛋白表达,IP 7 d亚组Ang-1蛋白表达高于NIP 7 d亚组(P<0.05)。结论 IP 1～7 d内脑组织VEGF、Ang-1表达增加,对脑缺血耐受的产生具有重要作用。     

HCMV感染及AngⅡ对人脑血管平滑肌细胞SM22α表达的影响

目的探讨人巨细胞病毒（HCMV）感染和血管紧张素受体Ⅱ型（AngⅡ）对人脑动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）中SM22α表达的影响。方法采用RT-PCR等技术观察VSMCs在更昔洛韦（GCV）、AngⅡ以及AT1和AT2受体拮抗剂（valsartan与P123319）作用下其SM22α的表达。结果病毒感染5dVSMCs中SM22α基因表达量较感染3d和1d时明显上调。经AngⅡ诱导1h和6h后，VSMCs中SM22α相对表达量较未诱导组明显上调。AngⅡ＋valsartan组SM22α相对表达量高于AngⅡ诱导组，AngⅡ＋P123319组SM22α相对表达量低于AngⅡ诱导组；AngⅡ诱导12h和24h后，3组间SM22α相对表达量差异无统计学意义。结论HCMV感染可使VSMCs中SM22α基因表达上调，AngⅡ对VSMCs的早期作用可能通过AT2受体途径激活SM22α基因表达。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达*★

目的：拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体，观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。 方法：通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因，PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因，分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上，构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和 pTrack-CMV-VEGF165，经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165，经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞，收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。 结果：PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒，PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变；荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达，且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强；经多轮感染、扩增后，病毒效价可达（2.0~5.0）×1010 pfu/mL。转染48 h后，293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高（F=427.93，17.93，P < 0.05）。 结论：成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒，血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

人反义血管内皮生长因子基因载体构建及对肾细胞癌血管内皮生长因子表达的影响☆

目的： 构建反义血管内皮生长因子基因表达载体，观察其对肾癌细胞血管内皮生长因子表达的影响。 方法：实验于2006-07/2007-03在郑州大学第三附属医院实验中心完成。①实验材料：质粒 pcDNA3.1(－)，宿主菌DH5α，肾癌细胞株786-0。②实验过程：克隆人血管内皮生长因子基因，将反义血管内皮生长因子基因定向克隆于质粒pcDNA3.1(－)表达载体，酶切鉴定；转染人肾癌细胞，并分别命名为反义血管内皮生长因子组和空载体组，未转染细胞命名为对照组；G418筛选阳性克隆。③实验评估：反转录-聚合酶链反应方法检测血管内皮生长因子mRNA的表达，免疫组织化学法检测血管内皮生长因子基因的蛋白表达，流式细胞术检测细胞周期，四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长情况。 结果：①成功构建反义血管内皮生长因子基因表达载体。②反义血管内皮生长因子组血管内皮生长因子mRNA的表达受到抑制，明显低于空载体组和对照组血管内皮生长因子mRNA的表达(P < 0.01),空载体组血管内皮生长因子mRNA的表达没有受到影响。③反义血管内皮生长因子组的血管内皮生长因子蛋白表达明显降低，明显低于空载体组和对照组(P < 0.01)，空载体组和对照组血管内皮生长因子蛋白的表达差异无显著性。④反义血管内皮生长因子组细胞生长减慢，G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少,反义血管内皮生长因子组细胞生长明显减慢。 结论：成功构建血管内皮生长因子的pcDNA3.1(－)反义基因表达载体，人反义血管内皮生长因子基因可明显降低肾癌细胞血管内皮生长因子基因在转录和翻译水平的表达，抑制肾癌细胞生长，为肾癌基因治疗提供一定的实验依据。     

人可溶性血管内皮生长因子受体1基因克隆及真核表达载体的构建

背景：血管内皮生长因子在肿瘤新生血管的形成中发挥着关键的作用,可溶性血管内皮生长因子受体1能竞争性地抑制血管内皮生长因子诱导新生血管形成的生物学功能。 目的：克隆人可溶性血管内皮生长因子受体基因1,尝试构建可溶性血管内皮生长因子受体1基因的真核表达载体。 设计、时间及地点：基因表达载体构建实验,于2006-10/2007-11在中山大学附属第一医院外科实验室完成。 材料：人脐静脉内皮细胞、pMD-18T载体及pcDNA3载体。 方法：提取人脐静脉内皮细胞总RNA,使用反转录-聚合酶链反应的方法扩增获得到可溶性血管内皮生长因子受体1基因cDNA,并将其克隆至pMD-18T载体中,经酶切及测序证实。然后应用聚合酶链反应的方法从pMD-18T可溶性血管内皮生长因子受体1重组载体中克隆可溶性血管内皮生长因子受体1基因,再将其定向亚克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1,提取质粒进行双酶切、聚合酶链反应及测序鉴定。 主要观察指标：可溶性血管内皮生长因子受体1基因反转录-聚合酶链反应情况及pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1真核重组体的构建与鉴定结果。 结果：构建的真核表达重组体pcDNA3-可溶性血管内皮生长因子受体1经过双酶切及聚合酶链反应鉴定,证实其中含有目的可溶性血管内皮生长因子受体1基因;测序结果经比对分析,证实与预期设计的编码区cDNA一致。 结论：应用反转录-聚合酶链反应方法成功从人脐静脉内皮细胞中克隆出可溶性血管内皮生长因子受体1基因,成功构建出了可溶性血管内皮生长因子受体1基因真核表达载体。     

缺氧诱导因子-lα和血管内皮生长因子在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和微血管密度(MVD)在人脑胶质瘤中的表达情况,分析三者的关系及其意义。方法:应用免疫组化方法分析62例人脑胶质瘤中HIF-1α、VEGF、和MVD的表达情况。结果:本组HIF-1α的总阳性表达率是66.1%,它们在正常脑组织和Ⅰ-Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ肿瘤组织的阳性率分别为0%、39.3%、81.8%、100%与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。HIF-1α表达水平与胶质瘤恶性度存在相关性(P<0.01)。VEGF在HIF-1α阳性组中的阳性率(95.1%)明显高于HIF-1α阴性组中的VEGF的阳性率47.6%(P<0.01)。结论:HIF-1α和VEGF的表达与MVD存在正相关关系;VEGF与HIF-1α表达呈正相关性,二者与人脑胶质瘤的病理分级呈正相关,与脑胶质瘤新生血管生成有关。     

脑缺血恢复期骨髓间充质干细胞移植对神经功能和促血管生成素-1、2及其受体表达的影响

目的 探讨腩缺血恢复期骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对神经功能和促血管生成素(Ang)-1、Ang-2及酪氨酸激酶受体-2(Tie-2)表达的影响.方法 42只SD大鼠随机分为脑缺血对照组(对照组,12只)、BMSC移植组(15只)及假手术组(15只),各组又分为缺血后28 d、35 d、42 d 3个亚组.用线栓法制作脑缺血大鼠模型,用改良黏附物移除试验(MST)评估大鼠神经功能.在脑缺血后21 d,给BMSCs移植组大鼠尾静脉注射BMSCs,对照组大鼠注射等体积PBS.在脑缺血后28 d、35 d、42 d(移植后7 d、14 d、21 d),用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western Blotting法检测大鼠缺血周围脑组织Ang-1、Ang-2及Tie-2 mRNA和蛋白的水平.结果 BMSCs移植组大鼠各时间点亚组的MST评分均显著高于对照组(均P<0.05);BMSCs移植组及对照组各时间点亚组脑组织的Ang-1、Tie-2 mRNA和蛋白水平明显高于假手术组(P<0.05～0.01),脑缺血后28 d、35 d,BMSCs移植组脑组织Ang-1、Tie-2 mRNA及蛋白水平均明显高于对照组(均P<0.01),而脑缺血后42 d两组之间的差异无统计学意义;3组各时间点亚组脑组织Ang-2 mRNA及蛋白水平的差异均无统计学意义.结论 脑缺血恢复期BMSCs移植能改善神经功能,并使缺血周围脑组织Ang-1、Tie-2的表达水平明显增高.而对Ang-2表达无明显影响.     

高压氧对大鼠脊髓损伤后血管内皮生长因子表达的影响

目的通过观察高压氧对成年大鼠脊髓损伤后不同时期血管内皮生长因子（VEGF）表达变化的影响,探讨高压氧对脊髓损伤的治疗作用机制。方法雌性SD大鼠55只,体质量250-300g。随机分为脊髓损伤组（对照组）、脊髓损伤＋高压氧治疗组各25只（n=5）,假手术组5只。采用改良A llen＇s法制作T8脊髓打击伤动物模型,各组分别于伤后1 d、1 w、2 w、4 w和8 w进行行为学观察,运动功能评分方法（BBB）评分后损伤部位取材,免疫组化染色及图像分析检测组织中VEGF的表达。结果假手术组的评分21分,治疗组和对照组与假手术组比较在各时间点评分明显降低,治疗组在各时间段BBB评分明显高于对照组（P〈0.05）。假手术组显示除脊髓中央管周围可见到极少量VEGF表达外,其它部位几乎不表达;对照组脊髓损伤1 d VEGF在大鼠脊髓损伤区及损伤周边区高表达,主要出现在软脊膜和脊髓灰、白质血管壁上的血管内皮细胞胞浆内,脊髓灰、白质内的神经胶质细胞和巨噬细胞胞浆内也出现表达,一般脊髓白质中更为多见,1 w后下调,而治疗组1 d至2 wVEGF的表达较对照组明显增加,差异有显著性（P〈0.05）,4 w、8 w时各组比较无统计学差异。结论急性脊髓损伤可上调VEGF在脊髓血管内皮细胞、胶质细胞和巨噬细胞内的表达,高压氧可能通过促进VEGF表达,促进血管内皮细胞生长从而对脊髓损伤起到治疗作用。     

PTTG和VEGF在垂体腺瘤中的表达及其与微血管形成的关系

目的探讨垂体瘤转化基因（PTTG）和血管内皮生长因子（VEGF）在垂体瘤中的表达及其与肿瘤血管形成的关系，为进一步研究垂体瘤的抗血管治疗提供理论依据。方法利用免疫组化方法检测48例垂体瘤组织中PTTG、VEGF及微血管密度（MVD）的表达，并分析PTTG、VEGF的相关性以及与MVD和垂体腺瘤侵袭性的关系。结果PTTG和VEGF在垂体腺瘤中的阳性表达率分别为66．7％（32/48）和79．2％（38/48），PTTG和／或VEGF阳性表达的垂体腺瘤组织中的MVD值均显著高于PTTG和VEGF阴性者（P〈0．05），PTTG的表达与VEGF的表达呈明显正相关（P〈0．05）；PTTG、VEGF的表达与垂体腺瘤的侵袭性有关（P〈0．05）。结论PTTG、VEGF对肿瘤血管形成起重要作用，可能通过PTTG—VEGF调节旁路途径促进垂体腺瘤的肿瘤血管形成；PTTG、VEGF的表达可作为判断垂体腺瘤侵袭性的一项生物学指标，对判断预后也有一定的意义。     

血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶9及其抑制剂在脑膜瘤中的表达

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及其抑制剂TIMP-1与脑膜瘤的生物学特性和侵袭性的关系。方法采用免疫组化S-P法测定手术切除的45例不同组织学类型脑膜瘤标本中VEGF、MMP-9及TIMP-1的蛋白表达。结果VEGF、MMP-9和TIMP-1在良性脑膜瘤中的阳性表达率分别为40%、36%、52%;在恶性脑膜瘤中的阳性表达率分别为70%、75%、55%。VEGF和MMP-9在恶性和良性脑膜瘤中的表达存在显著性差异(P<0.01),且二者在脑膜瘤中的表达呈正相关。结论VEGF、MMP-9与脑膜瘤的生物学特性相关,二者可能相互协同促进脑膜瘤的侵袭;MMP-9/TIMP-1的失衡与脑膜瘤的恶性程度和侵袭能力相关。     

VEGF调节成年大鼠脑室管膜下区和海马齿状回bHLH基因表达的实验研究

目的:探讨外源性VEGF调控成年大鼠脑室管膜下区(SVZ)和海马齿状回(DG)内bHLH基因家族成员Hes5和Mash1表达促进神经发生的机制。方法:建立成年大鼠脑室内VEGF(10μg/ml)或生理盐水持续注药3天模型,于注药开始后3至14天间不同时间点,RT-PCR检测大鼠SVZ和DG内Hes5和Mash1基因表达的动态改变。结果:VEGF组与生理盐水组比较,SVZ内Hes5表达于3d短暂上调,5d和7d下降低于正常;Mash1表达于5d和7d明显上调;两者均在14d恢复正常;DG内Hes5表达于注药开始后3d和5d下降低于正常,7d恢复正常;Mash1表达于3d、5d和7d上调,14d恢复正常。结论:VEGF可通过抑制Hes5基因表达,上调Mash1表达,促进成年大鼠脑内神经发生。     

缺血预处理对脑缺血大鼠血管内皮生长因子表达及微血管密度变化的影响

目的 观察局灶性缺血预处理诱导脑缺血耐受大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达及微血管密度（MVD）的变化。方法 将99只Wistar大鼠随机分成对照组9只、非缺血预处理（non-ischemic preconditioning,NIP）组45只、缺血预处理（ischemic preconditioning,IP）组45只,后两组按照再灌注时间随机分成1 d,3 d,7 d,14 d,21 d,5个亚组,每亚组9只大鼠。对IP组采用线栓法阻塞大鼠大脑中动脉建立局灶性IP模型,分别在IP后1 d,3 d,7 d,14 d,21 d对大鼠进行再次缺血2 h再灌注22 h,然后取脑检查。测定脑梗死体积,免疫组化检测MVD变化,原位杂交法检测VEGF信使核糖核酸（messenger RNA,mRNA）表达。结果 ①组间比较：对照组无梗死灶,未见有VEGF mRNA表达,IP组1 d,3 d,7 d亚组梗死体积较NIP组相应亚组明显减小（P均为0.001）。IP组1 d,3 d,7 d亚组VEGF mRNA较NIP组相应亚组表达明显增高（P分别为0.002、0.001、0.001）,IP组3 d,7 d亚组MVD较NIP组相应亚组表达明显增高（P分别为0.012、0.001）。②组内比较：IP组3 d亚组梗死体积减小最为明显,明显小于同组内其他亚组（与1 d、7 d、14 d、21 d亚组相比,P分别为0.001、0.042、0.001、0.001）;7 d亚组微血管在缺血灶周边区分布最为密集,MVD明显高于同组内其他亚组（与1 d、3 d、14 d、21 d亚组相比,P分别为0.001、0.003、0.004、0.001）;VEGF mRNA在IP后1 d表达即开始升高,高峰出现在IP后3 d,持续至7 d,且IP组3 d亚组VEGFmRNA表达明显高于同组内其他亚组（与1 d、7 d、14 d、21 d亚组相比,P分别为0.001、0.038、0.007、0.005）。③VEGF mRNA表达与MVD变化呈一定正相关性（r =0.472,P =0.017）。结论 VEGF mRNA及MVD在缺血预处理诱导大鼠脑缺血耐受的相应时间点内表达有所增加,VEGF及微血管形成可能在脑缺血耐受中发挥了重要作用。