内皮抑素对NSCLC细胞系中VEGF受体2表达的影响及其放射增敏效应机制研究

目的 研究内皮抑素对NSCLC细胞(人肺腺癌A549细胞、人肺鳞癌Calu-1细胞)中VEGF受体2(VEGFR₂)表达影响,并探索其放射增敏效应的可能机制。方法 CCK8法检测内皮抑素对细胞增殖抑制作用,计算24 h的20%药物抑制浓度(IC₂₀);采用RT-PCR及蛋白印迹法检测各组VEGFR₂、相关信号通路及HIF-1α mRNA与蛋白表达变化;克隆形成实验检测各组细胞放射敏感性,流式细胞术检测凋亡及周期分布。多样本均数比较采用单因素方差分析,组间比较采用两样本均数t检验。结果 经内皮抑素处理后,Calu-1细胞增殖活力明显下降(F=50.36,P<0.01),IC₂₀=296.5 μg/ml;VEGFR₂和HIF-1αmRNA与蛋白表达水平均受抑制(F=25.43、10.44,P值均<0.05);同时Akt、ERK1/2和p38的蛋白磷酸化水平均减低(F=2.89、0.24、1.09,P值均<0.05);其放射增敏比为1.38;凋亡率、G₂+M期阻滞增加(F=44.15、104.24,P值均<0.01)。此外,与Calu-1细胞相比,内皮抑素对A549细胞放射增敏比为1.09。结论 内皮抑素能促进VEGFR₂高表达Calu-1细胞凋亡并能增强放射敏感性,对低表达的A549细胞效果有限。     

RNA干扰VEGFR-2表达对Calu-1细胞增殖、迁移、侵袭力及放射效应影响

目的 研究VEGFR-2对肺癌细胞系Calu-1细胞增殖、迁移、侵袭及联合放射后凋亡率影响, 并探讨其可能机制。方法 siRNA敲低Calu-1细胞中的VEGFR-2基因, 借助实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测VEGFR-2表达水平的变化;将细胞分为对照组、VEGF组、VEGFR-2基因敲低组和基因敲低加VEGF组。利用CCK8法、细胞划痕实验及Transwell实验分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力变化, 利用蛋白印迹法检测VEGFR-2及下游相关信号通路蛋白表达水平变化;各组细胞联合放射后, 检测细胞凋亡。结果 RNA干扰VEGFR-2后Calu-1细胞中VEGFR-2的mRNA水平和蛋白水平均降低(P=0.001、0.000);RNA干扰VEGFR-2后Calu-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力均降低(P=0.000、0.000、0.031);RNA干扰VEGFR-2后Calu-1细胞中Akt、ERK1/2、p38的蛋白磷酸化水平均降低(P=0.336、0.986、0.553);RNA干扰VEGFR-2后联合放射后Calu-1细胞的凋亡率增加(P=0.012), RNA干扰VEGFR-2后HIF-1α蛋白表达被抑制(P=0.016)。结论 VEGFR-2基因表达敲低后显著抑制了Calu-1细胞的多项生理功能, 并提高了放射后细胞凋亡率。     

不同肺癌细胞株中VEGFR-2 mRNA表达的实验研究

目的 研究不同非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株中血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2） mRNA的表达情况。方法 采用实时荧光定量PCR法检测人肺黏液表皮样癌NCI-H292细胞株、人肺腺癌NCI-H1299细胞株、人肺腺癌A549细胞株、人肺巨细胞癌95D细胞株和人肺鳞癌Calu-1细胞株中VEGFR-2 mRNA的表达。结果 Calu-1、NCI-H292、95D、NCI-H1299和A549细胞株中VEGFR-2 mRNA表达依次为1.213±0.134、1.008±0.164、0.754±0.088、0.582±0.171和0.121±0.026,差异有统计学意义（F=31.875, P=0.000）。Calu-1与NCI-H292细胞株间VEGFR-2 mRNA表达无统计学差异（P=0.080）,NCI-H1299与95D细胞株间VEGFR-2 mRNA表达亦无统计学差异（P=0.137）,其余细胞株间差异均有统计学意义（P均＜0.05）。结论 不同NSCLC细胞株中VEGFR 2 mRNA表达量不同,可能与不同肿瘤细胞的生物学行为有关。     

三氧化二砷对人食管癌细胞株EC-1的放射增敏作用

目的探讨三氧化二砷(As₂O₃)对食管癌离体肿瘤细胞EC-1的放射增敏作用,并探讨其机制。方法利用多靶单击数学模型拟合放射剂量-细胞存活曲线,观察As₂O₃对食管癌细胞株EC-1的放射增敏作用。流式细胞法观察As₂O₃对细胞周期分布及细胞凋亡的影响。结果As₂O₃对食管癌细胞株EC-1有明显的放射增敏效应,3 μmol/L As₂O₃作用48 h的放射增敏比为1.285。药物作用后G₂／M期细胞比例增加,G₀/G₁期和S期细胞比例减少;细胞凋亡指数增加,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论As2O3对食管癌细胞株EC-1有明显的放射增敏效应。放射增敏的机制可能与As₂O₃抑制EC-1细胞的修复能力、使细胞周期阻滞在G₂／M期、G₀/G₁期和S期细胞减少以及凋亡增加有关。     

塞来昔布对人脑微血管内皮细胞放射后凋亡及释放PGI2和TXA2影响

目的 探讨塞来昔布对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)放射后释放PGI₂、TXA₂及凋亡影响。方法 细胞按空白、接受X射线、塞来昔布联合X射线分为对照组、单纯照射组、联合组,采用CCK-8、克隆形成实验测定塞来昔布对HBMECs毒性及放射敏感性影响。于照后6、12、24、48 h时间点进行实验。ELISA检测培养液6-keto-PGF_1α、TXB₂含量及计算TXB2/6-keto-PGF_1α比值,AnnexinV-FITC/PI双染法测定细胞凋亡率,蛋白印迹法检测蛋白表达情况。配对t检验差异。结果30 μmol/L塞来昔布浓度下联合组未见明显放射增敏效应(SER=0.96);与对照组相比,两组TXB2/6-keto-PGF_1α比值升高(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05),Cox-2、P-JNK、Cleaved caspase-3表达增加;与单纯放射组比较,联合组TXB2/6-keto-PGF_1α比值降低(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05),Cox-2及P-JNK、Cleaved caspase-3表达降低。结论 塞来昔布能减少放射后HBMECs释放TXB₂,降低TXB2/6-keto-PGF_1α比值,抑制细胞凋亡,抗凋亡机制与抑制Cox-2及P-JNK、Cleaved caspase-3表达有关。     

YC-1改善乏氧增强人肺腺癌A549细胞放射敏感性的体外研究

目的 探讨3-(5′-羟甲基 -2′-呋喃基)-1-苯甲基吲唑(YC-1)对乏氧人肺腺癌A₅₄₉细胞的放射增敏作用。方法 用噻唑蓝比色法检测YC-1对细胞增殖活性的影响,以及YC-1对细胞作用24 h的20%药物抑制浓度(IC₂₀)。细胞克隆形成实验计算细胞存活分数,多靶单击模型拟合细胞存活曲线并计算放射增敏比(SER)。流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期。结果 YC-1对A₅₄₉细胞有增殖抑制作用,在一定剂量范围内呈时间—剂量依赖性。在常氧和乏氧培养24 h下aIC₂₀分别为16.7 μmol/L和39.2 μmol/L。乏氧加YC-1组的SER_D0=1.11,SER_Dq=1.26。在乏氧培养下,YC-1联合单次2 Gy放射能明显促进A₅₄₉细胞凋亡和G₂+M期阻滞\[(30.17±1.21)%∶(15.44±0.96)%,P=0.000和(21.56±0.47)%∶(6.16±0.16)%,P=0.000\]。结论 YC-1对乏氧的A₅₄₉细胞有放射增敏作用。     

HIF-1α基因表达沉默对肝癌细胞的放射增敏作用*

目的：探讨在乏氧条件下,HIF-1 α 在肝癌细胞中的表达,及HIF-1 α 表达沉默后对肝癌细胞的放射增敏作用。方法：利用Westernbolt方法检测不同乏氧时相HIF-1 α 在肝癌细胞Hep3b 中的表达。构建特异性的HIF-1 α慢病毒干扰载体,利用慢病毒感染肝癌细胞Hep3b,杀稻瘟菌素进行药物筛选,利用RT-PCR 和Westernblot检测干扰效果,利用克隆形成实验观察HIF-1 α 表达沉默后对肝癌细胞反射敏感性的影响。结果：在乏氧条件下,肝癌Hep3b 细胞HIF-1 α 蛋白表达增强。利用特异性的HIF-1 α 慢病毒沉默肝癌细胞HIF-1 α 的表达,Hep3b 细胞中HIF-1 α 表达降低了90% ,说明HIF-1 α 载体构建成功。HIF-1 α 表达沉默后,能明显降低放射后Hep3b 细胞的克隆形成率,其放射增敏比为2.18。结论：乏氧可以诱导肝癌细胞HIF-1 α 的表达,HIF-1 α 表达沉默对肝癌细胞具有放射增敏作用。     

COX-2抑制剂NS-398对肝癌细胞放射增敏作用的实验研究

目的探讨环氧合酶-2（COX-2）抑制剂NS-398对肝癌细胞系HCC-9810的放射增敏作用及其机制。方法MTT实验测定NS-398对肝癌细胞系HCC-9810细胞毒性;成克隆实验检测NS- 398对HCC-9810的放射增敏作用;电镜观察细胞形态学改变;流式细胞仪（FCM）分析细胞凋亡率;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、FCM观察Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达。结果NS-398对HCC-9810细胞毒性呈现浓度、时间依赖性。10μmol/L NS-398作用24 h细胞增殖抑制率仅为3%,由D_q计算增敏比（SER）为1．29,细胞存活曲线“肩区”减小。NS-398处理HCC-9810细胞后放射诱导凋亡的敏感性增高,Bax mRNA和蛋白表达上调,呈NS-398剂量依赖性关系,而Bcl-2表达无明显变化,Bax/ BcL-2比值增高。结论NS-398对肝癌细胞系HCC-9810有放射增敏作用,且可能是通过上调Bax基因表达增强放射诱导凋亡作用及抑制亚致死损伤修复实现的。     

RNA干扰HIF-1α增强人肺腺癌SPCA-1细胞放射敏感性的研究

目的探讨RNA干扰乏氧诱导因子1（HIF-1）增强人肺腺癌SPCA-1细胞的放射敏感性。方法构建干扰HIF-1α质粒pSUPER-HIF-1α，采用荧光定量RT-PCR、Western blot方法观察有氧与乏氧状态下RNA干扰HIF-1α的变化，用成克隆实验观察乏氧时RNA干扰HIF-1α对放射的增敏作用。结果在常氧和乏氧的状态下，RNA干扰HIF-1α引起mRNA的表达水平分别下降64％和76％；在乏氧的状态下，蛋白的表达下降。转染pSUPER-HIF-1α后的细胞存活曲线的D0值为2．5Gy，转染空白质粒细胞和空白对照细胞的D0值分别为5、0Gy和5、1Gy，增敏比为2．1。结论RNA干扰HIF-1α可以增加SPCA-1细胞对放射的敏感性。     

沉默PKM2对人肺腺癌细胞系及移植瘤的放射增敏研究

目的 研究沉默丙酮酸激酶M2型(PKM2)对人肺腺癌细胞系(A549细胞)的放射敏感性及移植瘤的放射协同作用,并探索相关机制。方法 将PKM2基因干扰质粒pshRNA-PKM2稳定转染至A549细胞,同时设立空载质粒转染组和未转染组。采用蛋白印迹法检测A549细胞pshRNA-PKM2的沉默效率及微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达水平,克隆形成实验、移植瘤生长延迟法检测沉默PKM2后对A549细胞、移植瘤放射增敏效应,透射电镜观察A549细胞及移植瘤自噬形成,免疫组化法检测移植瘤中PKM2的表达水平。行Student′s t检验组间差异,裸鼠体重及移植瘤体积采用连续变量的方差分析。结果 成功获得转染pshRNA-PKM2的A549稳定细胞株。pshRNA-PKM2组可显著下调细胞和移植瘤PKM2的蛋白表达水平(P=0.001、0.000),对A549细胞的SER为1.47,移植瘤的SER为2.00。干扰PKM2可增加放射所诱导的自噬形成并增加LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值(P=0.0001)。结论 沉默PKM2调节自噬可能提高A549细胞及移植瘤的放射敏感性,其有望成为NSCLC有效放射增敏靶点,但有待进一步研究确认。     

形态学定量测定对预测鼻咽癌细胞放射敏感性的价值

目的　研究人鼻咽癌细胞形态、DNA含量及倍体与放射敏感性的异质性之间的关系 ,探讨预测肿瘤放射敏感性的可行方法。方法　应用 2种放射敏感性不同的鼻咽癌细胞系CNE 2Z亚克隆株F1、S1,通过细胞培养及裸鼠体内实验 ,用HE染色法、Feulgen染色法和图像分析仪 ,观察这 2株细胞及其裸鼠移植瘤的形态学参数、DNA含量及倍体分布。 结果　形态参数测定表明 ,F1细胞面积、细胞体积等参数小于S1(P <0 .0 1) ,核周长、核直径大于S1(P <0 .0 1) ,核质比大于S1(P <0 .0 1)。F1细胞及裸鼠移植瘤DNA含量、DI值、5C及 >5C比例均高于S1组 (P <0 .0 1)。结论　F1、S1放射敏感性的异质性与细胞分化程度、DNA含量及 >5C比例有关 ,采用计算机图像分析法定量分析 ,可以预测鼻咽癌细胞间的放射敏感性差异     

Rb94对人肺腺癌细胞系A549放射增敏作用的实验研究

目的 构建人视网膜母细胞瘤基因(Rb94)真核表达载体,观察其对人肺腺癌细胞系A549的放射增敏作用并探讨其机制.方法 构建重组表达质粒pIPES-Rb94,经脂质体转染A549细胞、G418筛选获得稳定转染的细胞系.细胞计数法绘制生长曲线、计算细胞倍增时间;实时RT-PCR检测hTERT、Bcl-2mRNA的表达;成克隆实验检测pIRES-Rb94对A549细胞放射敏感性影响,计算放射增敏比(SER);流式细胞仪分析细胞周期.结果 成功构建pIRES-Rb94质粒,转染A549细胞后获得稳定转染细胞系pIRES-Rb94-A549.与A549细胞相比,pIRES-Rb94-A549细胞倍增时间延长(31.5h:39.5 h;t=5.15,P<0.01);hTERT、Bcl-2 mRNA表达下降(0.02:1.00;t=18.99,P<0.01;0.01:1.00;t=13.73,P<0.01);G2+M期细胞增加(35.91%:4.53%;t=36.78,P=0.00),G0+G1期和S期细胞减少(47.02%:74.07%;t=11.71,P=0.00和17.07%:22.32%;t=2.30,P<0.05);由D0值计算的SER为1.30.结论 Rb94对A549细胞具有明显放射增敏作用,其机制可能是G2+M期阻滞作用以及下调hTERT、Bcl-2 mRNA表达,并可能通过调节细胞周期来影响细胞增殖.     

siRNA抑制肺腺癌细胞DNA-DPKCS表达与放射敏感性关系研究

目的 探讨稳定表达的小干扰RNA(siRNA)抑制DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-DPKCS)表达对非小细胞肺癌细胞增殖、细胞周期及放射敏感性的影响.方法 构建DNA-DPKCS-siRNA莺组质粒转染肺腺癌细胞A549.流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,成克隆实验测定细胞存活曲线.结果 建立了与A549细胞同源的DNA-DPKCS低表达细胞系549pRNA-DNA-DPKCS、阴性对照549pRNA-C细胞、空白549pSUPER细胞.与A549细胞相比549pRNA-DNA-DPKCS细胞的DNA-DPKCS mRNA(0.110:1.000;F=80.55,P<0.01)、蛋白表达水平(0.870:2.967;F=63.96,P<0.01)以及DNA-DPKCS活性(0.004:0.266;F=51.62,P<0.01)均显著降低.549pRNA-DNA-DPKCS细胞2 Gy存活分数、平均致死剂量、亚致死性损伤剂量均较A549细胞明显降低(0.25:0.76;F=996.86,P<0.01;1.42:1.62;F=17.41,P<0.05;0.06:1.00;F=68.92,P<0.01).DNA-DPKCS表达受抑后549pRNA-DNA-DPKCS细胞较A549细胞S期和G_2期细胞比例明显减少(24.5%:35.5%;F=4.83,P<0.05和10.7%:11.0%;F=32.04,P<0.01).结论 抑制DNA-DPKCS表达可提高肺腺癌细胞A549的放射敏感性,同时调控细胞周期时相分布.     

非小细胞肺癌组织中Pokemon、P14ARF及E2F1的表达及其临床意义

目的:检测Pokemon、P14ARF及E2F1蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达情况,探讨其在NSCLC发病中的作用和机制。方法:应用免疫组化方法检测NSCLC组和双正常对照组（即支气管对照组和肺泡对照组）中Pokemon、P14ARF及E2F1蛋白的表达情况,分析其与临床病理资料的关系及各指标间的相关性。结果:Pokemon蛋白在NSCLC组、肺鳞癌组、肺腺癌组中的表达均显著高于双对照组（P<0.05）,Pokemon蛋白表达与NSCLC的TNM分期相关（P<0.05）;E2F1蛋白在NSCLC组、肺鳞癌组、肺腺癌组中的表达均显著高于双对照组（P<0.05）,E2F1蛋白表达与NSCLC的TNM分期和淋巴结转移均有关（P<0.05）;P14ARF蛋白在NSCLC组、肺鳞癌组、肺腺癌组中的表达均显著低于双对照组（P<0.05）,P14ARF蛋白的表达水平与临床病理资料均无关（P>0.05）;Pokemon与P14ARF表达水平呈负相关（r=-0.57,P<0.01）,与E2F1表达水平呈正相关（r=0.37,P<0.05）,P14ARF与E2F1表达水平呈负相关（r=-0.48,P<0.01）。结论:非小细胞肺癌发病过程中,Pokemon通过拮抗P14ARF调节E2F1表达水平来发挥促癌作用。     

非小细胞肺癌组织中VEGFR-3的表达及临床意义

目的:探讨血管内皮生长因子受体-3(vascular endothelial growth factor,VEGFR-3)在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)组织中表达及其与临床病理特征的关系。方法:应用免疫组织化学方法检测60例NSCLC和15例正常肺组织中VEGFR-3的表达。结果:VEGFR-3在NSCLC中的阳性表达率70%(42/60)高于正常肺组织13%(2/15),P=0·000;与患者的年龄、性别、分化程度以及组织类型之间比较差异无统计学意义,P>0·05。VEGFR-3的阳性率随着肺癌TNM分期增加而增高;在有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组,P=0·003。结论:VEG-FR-3表达与NSCLC的TNM分期及淋巴结转移密切相关,可作为评估NSCLC转移潜力和判断预后的指标。     

17AAG-cypate聚合物胶束对肺癌A549细胞放射敏感性影响

目的 研究17AAG-cypate胶束对人非小细胞肺癌A549细胞的放射增敏作用,并简析其可能机制。方法 单击多靶模型拟合实验方程分析17AAG-M和17AAG-cypate-M的放射增敏作用。MTT实验检测17AAG-cypate-M在激光和X射线照射下对A549细胞存活率的影响。β-半乳糖苷酶染色实验观察药物对细胞衰老产生的影响。γ-H₂AX免疫荧光染色实验分析不同处理条件对DNA损伤修复的影响。蛋白印迹法实验检测p-Erk1/2和p-Akt蛋白的表达情况。配对t检验差异。结果 与单纯X射线照射组相比D₀下降,SER>1,说明17AAG-cypate-M具有放射增敏作用。与17AAG-M组相比,17AAG-cypate-M组对A549细胞活力抑制程度升高(P=0.0012),且引发了更明显的DNA损伤修复延迟(P=0.0017)。同时,17AAG-cypate-M对p-Erk1/2和p-Akt表达水平的抑制程度高于17AAG-M。结论 与17AAG-M相比,17AAG-cypate-M对A549细胞的放射增敏作用更加明显,其放射增敏机制可能为引发细胞的衰老,延迟DNA损伤修复,抑制p-Erk1/2和p-Akt表达等。     

The balance of VEGF-C and VEGFR-3 mRNA is a predictor of lymph node metastasis in non-small cell lung cancer

A positive association between vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) expression and lymph node metastasis has been reported in several cancers. However, the relationship of VEGF-C and lymph node metastasis in some cancers, including non-small cell lung cancer (NSCLC), is controversial. We evaluated the VEGF-C and vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) expression in NSCLC samples from patients who had undergone surgery between 1998 and 2002 using real-time quantitative RT-PCR and immunohistochemical staining. We failed to find a positive association between VEGF-C and VEGFR-3 mRNA expression and lymph node metastasis in NSCLC. An immunohistological study demonstrated that VEGF-C was expressed not only in cancer cells, but also in macrophages in NSCLC, and that VEGFR-3 was expressed in cancer cells, macrophages, type II pneumocytes and lymph vessels. The VEGF-C/VEGFR-3 ratio of the node-positive group was significantly higher than that of the node-negative group. Immunohistochemical staining showed that VEGFR-3 was mainly expressed in cancer cells. The immunoreactivity of VEGF-C and VEGFR-3 was roughly correlated to the mRNA levels of VEGF-C and VEGFR-3 in real-time PCR. VEGF-C mRNA alone has no positive association with lymph node metastasis in NSCLC. The VEGF-C/VEGFR-3 ratio was positively associated with lymph node metastasis in NSCLC. This suggests that VEGF-C promotes lymph node metastasis while being influenced by the strength of the VEGF-C autocrine loop, and the VEGF-C/VEGFR-3 ratio can be a useful predictor of lymph node metastasis in NSCLC.     

甲磺酸阿帕替尼治疗晚期非小细胞肺癌的研究现状

甲磺酸阿帕替尼,一种小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI),作用于血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2),强效抑制内皮细胞新生血管生成。阿帕替尼是在中国获得批准的第一代口服抗血管生成药物,用于晚期胃癌标准化疗失败的后续治疗。目前阿帕替尼单药或者联合其他治疗在晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的临床研究正在积极开展,多数均显示一定生存获益。本文详细介绍近年阿帕替尼在晚期NSCLC中的研究现状,为后期临床应用提供参考。