人胚成骨细胞的分离培养及生物特性的研究

目的 观察体外条件下成骨细胞生物学特性，为研究骨代谢提供一种体外模型。方法取人胚胎颅骨骨膜，采用酶消化法获取成骨细胞体外培养并传代。观察细胞形态，生物特性，绘制生长曲线，并经碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞以及比较冻存前3～5代与冻存后成骨细胞的特点。结果体外培养的骨膜成骨细胞形态多为梭形和多角形与成纤维细胞相似，3～5代成骨细胞生长特点稳定，具有成骨能力，冻存后成骨细胞生存率、增殖能力明显受到影响。结论自骨膜获取人成骨细胞培养方法易形，可大量培养高纯度的人成骨细胞供研究使用，冻存细胞不易作为研究对象。     

骨髓基质细胞体外培养的生物学特性和成骨能力初步鉴定

目的体外分离培养狗的骨髓基质细胞（BMSCs），诱导其向成骨细胞分化，初步鉴定其成骨潜能和生物学特性。方法抽取毕格犬髂骨骨髓体外分离培养获得BMSCs，DMEM、新生牛血清培养基进行原代培养，部分传代细胞以含10mmol／L地塞米松、50μg／ml抗坏血酸和10mmol／L β-甘油磷酸钠的矿化培养液诱导其向成骨细胞增殖分化。倒置相差显微镜进行细胞形态学和细胞生长增殖观察，VonKossa法染色检测体外矿化结节形成，细胞碱性磷酸酶染色检测BMSCs的成骨活性。结果体外分离培养的BMSCs经条件培养基诱导后表现出明显的成骨活性，体外矿化（骨样）结节的Von Kossa染色阳性；传代BMSCs碱性磷酸酶染色阳性。结论体外分离培养的BMSCs中含有骨源性前体细胞．传代细胞具有较强的成骨潜能。     

1,25（OH）2D3对4种细胞碱性磷酸酶活性的影响

观察１，２５（ＯＨ）２Ｄ３对体外培养的人牙乳头细胞，牙髓细胞，牙龈细胞，成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。方法；用组织块培养法和ＡＬＰ测定法。结果：在１，２５（ＯＨ）２Ｄ３ｄ和５ｄ下人牙乳头细胞，人牙髓细胞及人成骨细胞ＡＬＰ活性增加，第７日变化不明显，而人牙龈细胞未见明显变化。     

骨膜成骨细胞培养与生物活性陶瓷复合的实验研究

目的；研究成骨细胞与生物活性陶瓷间的关系，方法：选用新西兰大白兔，取胫骨外骨膜组织，经胰蛋白酶及胶原酶分步消化，分离出成骨细胞，用ＰＲＭＩ－１６４０培养液传代培养１３代，通过对培养细胞碱性磷酸酶活性，体外矿化能力测定以及细胞超微结构观察，证实其为典型成骨细胞，将培养分别三种生物活性陶瓷，包括生物活性玻璃陶瓷（ＢＧＣ），羟基磷灰石（ＨＡ）和双相羟基磷灰石（ＨＡ／ＴＣＰ）中培养４８小时后，利用扫描电镜     

培养人齿槽骨细胞与三种吸收性生物材料复合人工骨的制备及体外评价

目的：本研究应用组织工程的原理和方法，在体外制作含有人齿槽骨细胞的细胞型人工骨并通过一系列体外评价手段评价该新型人工骨的成骨效能，为其进一步体内应用提供科学依据。方法：采用酶消化法分离３位阻生齿患者的健康齿槽骨细胞，用添加有成骨细胞诱导分化作用的βｇｌｙｃｅｒｏ磷酸和地塞米松的αＭＥＭ培养液进行细胞培养，该细胞３代继代培养后３、６、９、１２、１５、１８、２１、２８日，采用Ａｌｐａｓｅ活性测定和Ｖｏｎｋｏｓｓａ染色矿化物产生测定等成骨细胞特异性检测手段进行了培养人齿槽骨细胞的定性评价。定性后的…     

骨髓基质细胞体外培养及成骨特性研究

目的 建立兔骨髓基质细胞(BMSC)向成骨细胞转化的体外培养方法，并观察其体外的成骨特性。方法 利用静置贴壁原理进行BMSC的体外培养，汇合后传代，部分细胞改用条件培养液继续培养。对培养的细胞进行形态学观察和组织学检测，并观察条件培养液对BMSC的功能影响。结果 条件培养液组细胞碱性磷酸酶(ALP)染色阳性，细胞重叠生长形成多层结构，伴有散在的矿化结节形成。条件培养液组细胞ALP染色率及活性较完全培养液组高，但增殖率相对降低。结论 培养的BMSC经诱导具有体外成骨能力。地塞米松、β甘油磷酸钠和维生素C可促使BMSC转化为成骨细胞，但抑制BMSC的增殖速度。     

人骨髓成骨细胞培养法的改良及其体外成骨能力

目的：探讨简便、易行的人达成骨细胞体外培养方法,研究骨髓基质在体外培养条件下的成骨能力。方法：抽取人骨髓组织,梯度离心后置于含１００ｍＬ／Ｌ小牛血清的ＤＭＥＭ培养液中,培养２４小时换液,稳定伟代后改用含地塞米松和β－甘油磷酸钠的条件增大２液,用倒置显微镜观察、组织化学染色、四环素荧光标记等方法进行观察。结果：传代细胞４天～５天即可传代,在条件培养液中２ＷＫ形成多层结构,并聚集成黑色结节。培养细胞Ａ     

蛇床子素对新生大鼠颅盖骨成骨细胞的作用

目的：研究蛇床子素（ｏｓｔｈｌｅ）在体外对新生大鼠颅盖骨成骨细胞增殖及成骨作用的影响。方法：酶消化法分离培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞;改良Ｇｏｍｏｒｉ钙钴法染色鉴定,＾３Ｈ－胸腺嘧啶和＾３Ｈ－脯氨酸掺入法分别测定细胞增殖和胶原合成;磷酸苯二钠法测定细胞内骨碱性磷酸酶（ＡＬＰ）活性;并以抗骨质疏松症药物依普黄酮（ｉｐｒｉｆｌａｖｏｎｅ,ＩＰ）作为阳性对照药物。结果：蛇床子素对新生大鼠颅盖骨成骨细胞的增殖、ＡＬＰ的活性和胶原合成都有促进作用。其对成骨细胞的增殖作用比ＩＰ强,但对胶原合成的促进作用弱于ＩＰ。结论：蛇床子素通过增加成骨细胞数量、促进细胞胶原蛋白及ＡＬＰ的合成而促进成骨作用。     

成人破骨细胞的体外培养

目的 建立成人破骨细胞体外培养的方法，观察成骨细胞对破骨细胞分化、增殖和功能的影响，为进一步研究补肾中药防治骨溶解和骨质疏松症提供基础。材料和方法 从成人骨髓中提取单核细胞，以1，25—(OH)2D3作为刺激因子，分3组培养：单核细胞与成骨细胞共同培养，单核细胞单独培养，单核细胞与成骨细胞条件培养液培养。生物显微镜下观察细胞的分化过程，HE染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)染色方法作组织化学观察，扫描电镜(SEM)观察骨吸收功能。结果 在单核细胞与成骨细胞共同培养组，可见单核细胞逐步融合成多核细胞；HE染色和Trap染色可见阳性多核细胞；扫描电镜观察可见骨片上有骨吸收陷窝形成。其他两组则未得到上述结果。结论 成人骨髓单核细胞在一定培养条件下能分化成熟为具有典型的破骨细胞表型的多核细胞：Trap染色阳性，具有骨吸收功能。与成骨细胞的直接接触是破骨细胞分化、增殖和发挥功能的必不可少的条件。     

人骨髓间充质干细胞体外诱导培养成骨的实验研究

目的 观察人骨髓间充质干细胞的生长特点及诱导条件下的成骨能力。方法 抽取人骨髓组织，梯度离心后，保留贴壁细胞传代，稳定传代后改用含地塞米松、β—甘油磷酸钠和维生素C的诱导培养液，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨钙素免疫组化染色等方法进行观测。结果 原代人骨髓间充质干细胞10～12d左右即可长满，并可稳定传代，传代细胞5～6d即可传代，在诱导培养液中2周形成多层结构，并聚集成细胞钙化结节。诱导培养细胞碱性磷酸酶染色，骨钙素免疫组化染色阳性。结论 人骨髓间充质干细胞经合理的体外诱导培养后，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性，可为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

丹参对人成骨细胞缺血-再灌注损伤的保护作用

观察丹参对成骨细胞缺血－再灌注损伤的保护作用。方法：以人髂骨骨膜为材料进行成骨细胞的体外培养,经丹参预处理后,行模拟缺血－再灌注采用唑蓝比色法测定细胞的夏活率。结果：预处理组成骨细胞的存活率明显高于对照组。结论：丹参对人成骨细胞缺血－再灌注有明显的保护作用。     

小鼠成骨细胞体外分离培养及鉴定

目的：针对目前体外培养成骨细胞方法各异,建立一种简易的原代培养成骨细胞的方法,并研究其生物学特性。方法：本实验用新生1—3d小鼠颅盖骨,采用骨块状接种进行细胞体外培养。观察细胞形态,对其进行鉴定。结果：所培养细胞具有体内成骨细胞的生物学行为。结论：本实验原代培养成骨细胞的方法切实可行,可用于体外实验研究。     

Effect of Zinc on Bone Metabolism in Fetal Mouse Limb Culture

Objective To determine the effects of zinc-deficiency and zinc-excess on bone metabolism. Methods We developed the culture model of fetal mouse limbs (16th day) cultivated in self-made rotator with continuing flow of mixed gas for six days in vitro. The cultured limbs were examined by the techniques of 45Ca tracer and X-roentgenography. Results The right limbs cultivated had longer bone length, higher bone density than the left limbs uncultivated from the same embryo; and histologically, the right limbs had active bone cell differentiation, proliferation, increased bone trabecula, clearly calcified cartilage matrix, and osteogenic tissue. Compared with the control group,the zinc-deficient group and zinc-excess (Zn2+120 μmol/L) group contained less osteocalcin (BGP) and 45Ca content, and lower AKP activity; whereas zinc-normal (Zn2+45 μmol/L and Zn2+70 μmol/L)groups contained more BGP and 45Ca contents, and higher AKP (alkaline phosphatase) activity.Conclusion Both zinc-deficiency and zinc-excess can alter bone growth and normal metabolism.The results indicate that the culture model of fetal mouse limbs (16th day) in vitro can be used as a research model of bone growth and development.     

大鼠成骨细胞的体外培养和生物学特性的研究

目的 :建立一种成骨细胞的体外培养方法 ,并研究不同培养时期成骨细胞的生物学特性。方法 :选用成年雌性大鼠松质骨为培养细胞来源 ,组织块培养法和胰酶消化法相结合进行成骨细胞培养 ,并测定成骨细胞不同培养阶段的碱性磷酸酶 (AKP)活性和骨钙素 (OC)分泌水平。结果 :体外培养所获成骨细胞纯度高、数量多 ,且培养时间明显缩短。培养细胞近融合时 ,产生的AKP和OC处于低水平 ,融合后 3d、14dAKP和OC的产生明显增加。结论 :实验采用的改良大鼠成骨细胞培养方法较为方便、切实可行。体外培养的大鼠成骨细胞在不同生长阶段 ,其骨基质蛋白的产生发生相应变化     

小鼠卵黄囊间质干细胞向成骨细胞定向分化的实验研究

目的研究卵黄囊间质干细胞的成骨潜能。方法用０．１％的Ⅰ型胶原酶消化获得妊娠第８．５天的小鼠卵黄囊细胞;取贴壁细胞培养,并于接近融合时进行传代培养。对细胞进行形态学观察、碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ,ＡＫＰ）及Ⅰ、Ⅲ型胶原检测,传代４次后进行成骨诱导,每天观察细胞形态,并于培养７ｄ后测定ＡＫＰ、Ⅰ、Ⅲ型胶原及骨形态发生蛋白－２（ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ－２,ＢＭＰ　－２）的表达,培养８周后进行矿化检测。结果体外可获得纯化的卵黄囊间质干细胞,细胞大小形态均一,呈梭形,ＡＫＰ染色弱阳性,Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性。在体外可诱导卵黄囊间质干细胞定向分化为多形性成骨样细胞,细胞由梭形向星形转化,并形成胞浆突起,相互连接成网状,细胞ＡＫＰ染色阳性,Ⅰ型胶原阳性,Ⅲ型胶原阴性,ＢＭＰ　－２强阳性,８周后矿化区经Ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ　＇ｓ染色呈阳性反应,符合成骨细胞的生物学特征。结论经体外纯化的卵黄囊间质干细胞可诱导向成骨细胞定向分化。     

人骨髓基质细胞株培养上清对造血干细胞增殖作用的研究

应用ＳＶ－４０导入法建立了人骨髓基质细胞株ＳＣ５－７，然后收集其培养上清，测定其中三种造血因子含量，并将这种培养上清添加至造血干细胞的液体培养基内，每周一次取出培养的细胞，进行计数。同时移至甲基纤维素培养基内继续培养，１４日后，在倒置显微镜下观察并计数各种造血干细胞集落形成的数量。结果：１．人骨髓基质细胞株ＳＣ５－７的培养上清中含有较高浓度的Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ和Ｍ－ＣＳＦ。２．添加ＳＣ５－７     

Both Juxtacrine and Paracrine Signaling Indispensable in Spermatogonial Stem Cell Cultures

Objective To prove that juxtacrine and paracrine signaling are essential in the culture of spermatogonial stem cells （SSCs） with Sertoli cell feeder layer in vitro. Methods Mice aged 7 d were chosen to harvest testes. A two-step enzyme digestion method was applied in testis suspension. The SSCs and Sertoli cells were separated by adherence distinguishing methods and biologically identified by immunofluorescence and Oil Red 0 staining methods. Flow cytometry was used to analyze purity of SSCs. Three groups were constructed according to different culture conditions. SSC and Sertoli cell co-culture group, SSC conditional culture group and SSC routine culture group. The conditional medium was collected from supernate of culture Sertoli cell in vitro and double-concentrated with DMEM/F12 and fetal bovine serum in a proportion of 4.5 ： 4.5 ： 1. The routine medium was DMEM/F12 containing 10% fetal bovine serum. Adherence rates were measured by Trypan blue staining. Absorbance of SSCs of each group was measured by MTT assay and proliferation curves shown to demonstrate proliferative features of SSCs. Proliferative features and colony formation were observed by inverted microscope. With 24 h difference in adherence rates, proliferations were compared and analyzed.Results The adherence rate of co-culture group was greater than that in the others（P〈0.05）, with insignificant difference in conditional culture group and routine group （P〉0. 05）. SSCs of co-culture group showed stable proliferation immediately following inoculation..4 stable colony formed within 7-10 d and maintained for 30 d. SSCs in conditional culture group and routine group decreased rapidly following transient proliferation. Conclusion The actions of SSCs in Sertoli cell cultures in vitro depended on both juxtacrine and paracrine signaling, Sertoli cell paraerine signaling was unable to promote SSC adherence and proliferation alone.     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

胶原涂层煅烧骨—成骨细胞复合物的体内成骨作用

目的：观察胶原涂层煅烧骨－成骨细胞复合物入体内后成骨性能，探讨治疗骨缺损的新方法。方法：以牛松质骨制成煅烧骨（TBC），并涂以胶原制成胶原涂层煅烧骨（TBCc），培养兔骨膜成骨细胞（POB），构建复合物TBCc-POB; 将该复合物移植到BALB／c裸小鼠背部右侧皮下，4周取材；同时将该复合物植入兔背部右侧肌袋内，8周取材。两种动物均在对侧相应部位植入单纯TBCc作为对照，并在相应时间内取组织块常规处理后光镜、电镜观察。结果：植入材料在皮下及肌袋处均有成骨 细胞大量生长、增殖，并有软骨组织、骨组织形成， 而对照组则没有。结论：将TBCc-POB材料植入体内后，成骨细胞能够存活并产生软骨组织和骨组织。     

人Tenon’s囊成纤维细胞的离体培养及生长特性观察

目的离体培养人Tenon’s囊成纤维细胞,观察其生长特性。方法将人Tenon’s囊成纤维细胞进行离体培养及生长抑制实验,采用含10％胎牛血清的DMEM培养基,细胞计数法及MTT法描述细胞生长曲线。并通过免疫组织化学法对细胞进行鉴定。站果人Tenon’s囊成纤维细胞离体培养48h至7d处于对数生长期。细胞角蛋白染色阴性,波蛋白染色阳性。结论人Tenon’s囊成纤维细胞在体外易于生长,是细胞离体实验研究的良好材料。