缺血后处理对PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡的作用及其机制研究

目的 探讨缺血后处理对PC12细胞缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡的作用及其作用机制。方法 将PC12细胞分为3组:正常组、缺血再灌注组、缺血后处理组。缺血再灌注组予以糖氧剥夺12 h后正常培养,缺血后处理组经糖氧剥夺12 h后予以3个循环的正常培养(10 min)→糖氧剥夺(10 min),再正常培养12 h后通过Hoechst染色检测各组细胞的凋亡情况,应用Westernblot 检测各组细胞Caspase-3活化蛋白及磷酸化NF-κB/p65蛋白表达水平,采用RT-PCR检测各组细胞NF-κB及Caspase-3 mRNA表达水平。结果 Hoechst染色显示缺血后处理可降低缺血再灌注引起的细胞凋亡; 与对照组相比, 缺血再灌注组磷酸化NF-κB/p65和Cleaved caspase-3的蛋白表达水平高; 缺血后处理组磷酸化NF-κB/p65和Cleaved caspase-3的蛋白表达水平明显低于缺血再灌注组; NF-κB和Caspase-3的mRNA表达趋势与蛋白表达基本一致。结论 缺血后处理可以减轻缺血再灌注损伤引起的PC12细胞凋亡,这可能与NF-κB/p65信号通路有关。     

落新妇苷通过激活PI3K/AKT信号通路和抑制P38MAPK信号通路减轻H2O2诱导的PC12细胞损伤

目的 研究落新妇苷对H2O2诱导的氧化应激损伤的PC12细胞影响。方法 将PC12细胞分为5组:对照组、H_2O_2组及不同浓度(1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)落新妇苷组。采用CCK8实验检测各组细胞的活力; Annexin V-FITC/PI细胞凋亡实验检测各组细胞凋亡率; Western blot检测PI3K、AKT、Caspase3和P38蛋白及其磷酸化激活蛋白的表达水平。结果 与H_2O_2组相比,落新妇苷组细胞的活力显著提高,细胞凋亡率明显降低,活化的凋亡相关蛋白Cleaved Caspase3表达水平降低,PI3K/AKT途径相关蛋白p-PI3K和p-AKT的表达水平升高,P38 MAPK途径重要蛋白p-P38的表达水平降低。结论 落新妇苷对H_2O_2诱导的氧化应激损伤的PC12细胞有明显保护作用;这种保护作用可能是通过激活PI3K/AKT信号通路及抑制P38MAPK信号通路实现的。     

RND1通过p53蛋白促进PC12细胞凋亡

目的 探讨RND1对神经细胞凋亡的作用及可能的相关机制。方法 利用脂质体转染质粒,建立体外高表达RND1细胞模型,具体分组为flag-RND1组和flag组; 以流式细胞术、Q-PCR和免疫印迹等方法检测各组细胞内RND1、p53、cleaved-Caspase3蛋白表达及凋亡水平。结果 与对照组比较,flag-RND1组RND1表达水平升高,流式细胞术显示flag-RND1组细胞凋亡水平增高,同时flag-RND1组细胞内凋亡蛋白cleaved-Caspase3的表达水平较flag组升高(P<0.05); 伴随凋亡情况改变,p53蛋白表达水平降低。结论 小GTP酶蛋白家族成员RND1可能通过p53蛋白参与调节神经细胞凋亡,这可能是1个新的神经元凋亡调控位点。     

过氧化氢干预下Rab30在PC12细胞中的表达及促凋亡通路

目的探讨经过氧化氢(H_2O_2)损伤干预下Rab30在PC12细胞中的表达及可能的促凋亡通路。方法将体外常规培养的PC12细胞分为正常组和H_2O_2组。采用MTT检测细胞存活率;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;Western-blot检测Rab30、JNK3、GM130、Caspase-3的蛋白表达情况。结果 H_2O_2损伤干预可导致PC12细胞的存活率显著降低(P0.05),早期凋亡率和总凋亡率均显著增高(均P0.05);JNK3、Caspase-3蛋白表达水平在PC12细胞中显著增加(P0.05),而Rab30、GM130蛋白表达显著下降(P0.05)。结论 H_2O_2在PC12细胞中的促凋亡通路可能是H_2O_2激活JNK3的表达而靶向下调Rab30,致使高尔基体结构破碎,并激活Caspase-3的活性,从而诱导PC12细胞的凋亡。     

槲皮苷对过氧化氢诱导PC12细胞损伤的保护作用

目的探讨槲皮苷对H2O2所致的PC12细胞凋亡的保护作用及机制。方法 PC12细胞培养后,MTT检测细胞存活率的方法进行H2O2损伤模型的摸索和槲皮苷药物浓度的筛选,将PC12细胞分为对照组、模型组和不同剂量槲皮苷组。用400μmol H2O2刺激PC12神经元细胞使其发生凋亡复制阿尔茨海默病(AD)模型,MTT法检测PC12细胞存活率、硫辛酰胺脱氢酶催化的INT显色反应检测乳酸脱氢酶(LDH)释放量和DAPI荧光核染色观察细胞凋亡形态学改变,Western blot方法检测Cytc和caspase-3表达的变化。结果 400μmol H2O2诱导PC12细胞损伤明显,与模型组比较,槲皮苷组PC12细胞存活率显著提高(P<0.01),凋亡率显著下降(P<0.01),LDH释放量和凋亡相关蛋白Cytc和caspase-3的表达显著减少(P<0.01)。结论槲皮苷可抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡,其机制可能与抑制细胞凋亡线粒体途径中凋亡相关蛋白Cytc和caspase-3的表达有关。     

p38 MAPK、Caspase-s介导PTH诱导PC12细胞凋亡机制的研究

目的甲状旁腺激素(PTH1-34)对PC12细胞作用和p38MAPK、Caspase-s在PTH1-34对PC12细胞凋亡中作用机制。方法应用CCK-8法测定PTH对PC12细胞生长抑制率,通过细胞形态学、乳酸脱氢酶(LDH)和流式细胞仪方法检测细胞损伤,RT-PCR测定p38 mRNA的表达,通过Western blot检测细胞中p38磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及caspase-3蛋白的变化。结果 CCK-8法测定PTH抑制PC12细胞生长;透射电镜可见细胞核呈固缩状、凋亡小体出现等典型的凋亡形态学改变;流式细胞仪可见细胞凋亡率增多;LDH渗出量增多等。PTH1-34可明显上调p38 mRNA的表达,并可明显地促进PC12细胞磷酸化p38MAPK与Caspase-3的蛋白表达。结论 PTH可诱导PC12细胞凋亡,p38MAPK和Caspase-s共同介导参与PTH致PC12细胞凋亡。     

MicRNA-124可能通过PI3K/Akt通路调节缺血脑组织细胞凋亡

目的探讨脑缺血环境下对micRNA-124表达的影响。方法采用Western blot、荧光定量PCR技术检测脑缺血后缺血皮质区不同时间点bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1、micRNA-124蛋白或基因的表达水平。结果缺血脑组织细胞micRNA-124基因表达量与调控细胞凋亡指标bax、bcl-2、caspase-3增高一致;bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1活化片段蛋白表达量逐渐升高,在随后观察的时点内持续处于高表达状态(P0.01)。结论 micRNA-124可能参与缺氧致脑组织细胞凋亡的过程,其机制可能是通过PI3K/Akt通路,激活或抑制bax、bcl-2、caspase-3、ROCK1其中一个或是多个基因调节缺氧脑组织细胞凋亡。     

嘌呤霉素敏感的氨肽酶对β-淀粉样蛋白诱导的细胞凋亡的影响

目的 探讨嘌呤霉素敏感的氨肽酶(PSA)对β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)诱导的SH-SY5Y细胞、PC12细胞凋亡的影响. 方法 采用MTT法检测Aβ25-35对SH-SY5Y、PC12细胞生长的影响;Hoechst染色检测Aβ25-35对SH-SY5Y、PC12细胞核形态的影响;进一步采用脂质体转染法在SH-SY5Y细胞中瞬时转染PSA-siRNA,在PC12细胞中瞬时转染PSA重组质粒,加入Aβ25-35作用24h后收集细胞,进行流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blotting检测PSA、caspase-3蛋白的表达变化;酶标仪检测caspase-3活性. 结果 Aβ25-35抑制SH-SY5Y、PC12细胞增殖,细胞核发生凋亡的形态学改变,流式检测细胞凋亡率增加;在SH-SY5Y细胞中,沉默PSA表达能使Aβ25-35诱导的细胞凋亡率升高,促进caspase-3酶原激活,caspase-3活性升高.反之,PC12细胞中过表达的PSA能使Aβ25-35诱导的细胞凋亡率下降,抑制caspase-3酶原激活,caspase-3活性降低. 结论 Aβ25-35能抑制神经细胞生长,引起神经细胞凋亡;PSA能抑制Aβ25-35诱导的神经细胞凋亡,对神经元具有保护作用,其机制可能与抑制caspase-3通路的激活有关.     

MALAT1对Aβ1-42诱导PC12细胞损伤及PI3K/Akt通路的影响研究

目的探讨肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)对β-淀粉样蛋白1-42片段(Aβ1-42)诱导肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路的影响。方法体外培养PC12细胞,并随机分为正常对照组(正常生长PC细胞)、模型组(Aβ1-42诱导PC细胞损伤)、sh-MALAT1组(Aβ1-42组基础上转染MALAT1干扰序列)、sh-对照组(Aβ1-42组基础上转染MALAT1对照序列)。采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测各组PC12细胞MALAT1表达水平,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测PC12细胞增殖,采用流式细胞仪及AnnexinV-FITC/PI法体外检测PC12细胞凋亡,采用免疫印迹(WB)检测PC12细胞PI3K/Akt通路相关p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白及其下游凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3/caspase3、B细胞淋巴瘤-2基因相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白表达。结果与正常对照组比较,模型组、sh-对照组组PC12细胞存活率、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2蛋白水平低(均P0.05),MALAT1表达水平、PC12细胞凋亡率、Bax、Cleaved-caspase3/caspase3蛋白表达水平高(均P0.05);与模型组、sh-对照组比较,sh-MALAT1组MALAT1表达水平、细胞存活率及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2蛋白水平高(均P0.05),Bax、Cleaved-caspase3/caspase3蛋白表达水平低(均P0.05)。结论下调MALAT1表达可能通过激活PI3K/Akt通路,上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax、Cleaved-caspase3/caspase3蛋白表达抑制Aβ1-42诱导的PC12损伤,发挥保护作用。     

丹参川芎嗪注射液对Aβ损伤的PC12细胞保护作用及机制研究

目的 探讨丹参川芎嗪注射液对Aβ损伤的PC12细胞可能的保护作用及机制。方法 将PC12细胞分为5组:空白对照组(未加任何处理药物)、Aβ诱导组(20 μmol/L Aβ处理组)和预处理组(分别加入浓度为5 ml/L、10 ml/L、20 ml/L的丹参川芎嗪注射液孵育24 h后加20 μmol/L Aβ),通过CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,Hoechst 33258染色观察PC12细胞核的改变,荧光分光光度计测定LDH、SOD、GSH及caspase-3活性水平,免疫组织化学方法观察细胞色素C(Cyt-C)蛋白释放水平,Western Blot检测Bcl-2的表达水平。结果 丹参川芎嗪注射液(5、10、20 ml/L)预处理对Aβ诱导的PC12细胞损伤有较好的保护作用,其保护作用随着药物浓度的增加而增强。它能增加Aβ损伤的PC12细胞增殖活力,减少Aβ诱导的PC12细胞凋亡,降低细胞核凝聚现象,抑制Aβ损伤的PC12细胞LDH释放,增强SOD和GSH活性,促进Cyt-C在细胞内表达,降低caspase-3活性,促进Bcl-2的表达。结论 丹参川芎嗪注射液对Aβ诱导的PC12细胞损伤具有与线粒体通路相关的保护作用,其保护作用与它抑制细胞凋亡、抗氧化应激、维持线粒体正常功能、抑制caspase-3的激活、促进抗凋亡因子Bcl-2的表达有关。     

氧糖剥夺再灌注引起的SH-SY5Y细胞凋亡与NF-κBp65和COX-2蛋白表达的关系

目的探讨氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后SH-SY5Y细胞凋亡情况及NF-κB信号通路NF-κBp65、COX-2蛋白的表达。方法将SH-SY5Y细胞分为正常对照组、氧糖剥夺4 h/再灌注24 h组(OGD/R)组。利用流式细胞术分别检测各组细胞凋亡率,蛋白印记法(Western blot)检测p65和COX-2的蛋白表达情况。结果与正常对照组比较,OGD/R组细胞凋亡率明显增高(P0.05),p65和COX-2的蛋白表达也明显增高(P0.05)。结论氧糖剥夺4 h/再灌注24 h能够促进细胞凋亡,其机制可能是通过NF-κBp65对COX-2调控的信号通路来实现。     

刺五加多糖对H2O2诱导的大鼠海马神经元凋亡的保护作用

目的研究刺五加多糖（ASPS）对H2O2诱导的海马神经元凋亡的影响及其机制。方法采用H2O2诱导大鼠海马神经元凋亡。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记法检测细胞凋亡率、免疫组化法检测caspase-3蛋白的表达、逆转录PCR法检测caspase-3 mRNA的表达。结果H2O2作用后,海马神经元凋亡率、caspase-3蛋白和mRNA表达水平均显著增高（P〈0.05）;给予ASPS干预后,均显著下降（P〈0.05）;而且,随ASPS剂量增加,作用效果显著增强（P〈0.05）。结论ASPS具有抑制氧化应激损伤诱导神经细胞凋亡作用,其机制与下调caspase-3 mRNA的表达有关。     

脓毒症大鼠模型脑胰岛素生长因子1表达的变化及影响

目的：探讨脓毒症大鼠模型胰岛素生长因子1（IGF-1）表达的变化及影响。方法采用盲肠结扎穿孔法（CLP）制作脓毒症大鼠模型,应用免疫荧光染色观察皮层IGF-1阳性细胞, western blot法检测IGF-1和caspase-3蛋白表达,TUNEL染色观察脑神经元凋亡。在脓毒症模型基础上,给予侧脑室定位注射IGF-1或生理盐水,相同方法检测caspase-3蛋白表达及脑神经元凋亡。结果与假手术组相比,脓毒症组大鼠皮层IGF-1阳性细胞数明显减少,caspase-3表达增高,IGF-1表达减低,神经元凋亡增加（均P＜0．05）。侧脑室注射IGF-1后,caspase-3表达和神经元凋亡较假手术组无明显变化;而侧脑室给予生理盐水大鼠caspase-3表达和神经元凋亡与脓毒症组相似。结论脓毒症大鼠的脑皮层IGF-1表达明显减低,细胞凋亡增多。给予外源性IGF-1后,细胞凋亡减少。提示IGF-1可能通过抑制caspase-3的上调对脓毒症大鼠起到脑保护作用。     

Caspase-3在H2O2诱导神经细胞凋亡中的作用

目的研究caspase-3在H2O2诱发神经细胞凋亡中的作用,以探讨氧化应激损伤诱导神经细胞凋亡的机制。方法用海马神经细胞原代培养技术,采用1mmol/L H2O2诱导建立细胞氧化损伤模型,并观察细胞形态学变化,采用TUNEL法检测H2O2诱导大鼠海马神经元凋亡率;采用RT-PCR法检测caspase-3 mRNA的表达。结果形态学观察结果显示模型组比海马组细胞损伤程度较严重;与对照组比较,模型组细胞凋亡率及caspase-3 mRNA的表达显著增高（P〈0.01）。结论本结果提示,caspase-3可能参与了氧化应激损伤诱导的神经细胞凋亡过程。     

磷酸化蛋白酪氨酸激酶及信号转导子和转录激活子在谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡中的表达研究

目的探讨谷氨酸诱导PC12细胞凋亡后磷酸化蛋白酪氨酸激酶2（P-JAK2）、磷酸化信号转导子与转录激活子3（P-STAT3）表达的变化及意义。方法采用谷氨酸诱导PC12细胞发生凋亡，实验分为6组，分别为正常对照组、500μmol／L谷氨酸作用5、10、20、30、60min组，应用流式细胞仪观察PC12细胞凋亡．Western blot定量观测PC12细胞P-JAK2与P-STAT3蛋白表达的变化。结果对照组PC12细胞的凋亡率为（2．71±0．32）％；经500μmol／L谷氨酸作用PC12细胞20min，凋亡率增加到（61．20±4．60）％，与对照组相比差异有显著性意义（P=0．000）；Westem blot检测结果表明P-JAK 25 min在胞浆中开始表达，20min达最高峰，是5min组（3．52±0．20）倍（P=0．002）；P-STAT35min表达增强，30min达高峰，为5min组的（4．76±0．17）倍（P=0．000）。结论细胞损伤激活了JAK／STAT信号转导通路，该通路参与了神经细胞凋亡的过程。     

TLR4参与缺血后处理对缺血再灌注损伤致细胞凋亡的保护作用

目的探讨TLR4是否参与缺血后处理对PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡的保护作用及其作用机制。方法将PC12细胞分为4组：正常组、缺血再灌注组、缺血后处理组及缺血后处理＋脂多糖组,通过流式细胞术Annexin-FITC和PI双染法检测各组PC12细胞凋亡率,Western blotting检测各组细胞TLR4及Caspase-3表达水平,通过RT-PCR测定各组TLR4mRNA水平。结果缺血后处理可以降低缺血再灌注组细胞TLR4蛋白表达、mRNA水平及凋亡率,脂多糖可以逆转其下降趋势。结论TLR4可能参与了缺血后处理对PC12细胞缺血再灌注损伤致细胞凋亡的保护作用。     

促红细胞生成素对1-甲基-4-苯基吡啶损伤的PC12细胞的保护作用

目的探讨促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP^＋）诱导的PC12细胞,变性损伤的保护作用及机制。方法用MPP^＋处理PC12细胞制作帕金森病细胞模型,采用四甲基偶氮哗监泫检测暴露于不同浓度EPO后细胞的活性;流式细胞术与DNA断端原位标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL）检测各组的细胞凋亡率;免疫印迹法检测不同处理组PC12细胞Bcl-2和Bax的表达,并采用荧光法观察不同处理组PC12细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）与线粒体膜电位水平以及caspase-3活性的变化。结果MPP^＋可以使PC12细胞存活率下降,凋亡率增高;同时PC12细胞内ROS增多,线粒体膜电位下降。MPP^＋还可以明显地提高Bax／Bcl-2比值并激活caspase-3。而EPO可以抑制这些由MPP^＋引发的改变,并在1U／mL时发挥最大保护作用。结论EPO可抑制MPP^＋诱导的PC12绌胞死亡,其作用机制可能其自身抗氧化和抗凋亡的特性有关。     

2002/原花青素对β-淀粉样肽（25-35）诱导去血清培养PC12细胞细胞周期分布的影响

目的 探讨原花青素 (Procyanidins,PC) 对β-淀粉样肽（25-35）[βamyloid peptide -(25-35),Aβ25-35] 诱导去血清培养PC12细胞的凋亡及细胞周期分布的影响。方法 流式细胞仪检测细胞周期分布情况及细胞凋亡率;RT-PCR 检测 p53基因 mRNA 表达;Western blot检测 P53蛋白表达。 结果 30mg/L PC预处理 PC12 细胞 1 h ,可降低Aβ25-35引起的去血清培养PC12细胞凋亡率,逆转Aβ25-35引起的去血清培养PC12细胞的细胞周期S期阻滞,降低 p53 mRNA及P53蛋白表达。 结论 PC可对抗Aβ25-35 诱导的去血清培养 PC12 细胞的凋亡及细胞周期S期阻滞,其机制可能与下调p53基因表达有关。     

促红细胞生成素对1-甲基-4-苯基吡啶损伤的PC12细胞的保护作用(英文)

目的探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的PC12细胞变性损伤的保护作用及机制。方法用MPP+处理PC12细胞制作帕金森病细胞模型,采用四甲基偶氮唑蓝法检测暴露于不同浓度EPO后细胞的活性;流式细胞术与DNA断端原位标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPnick end labeling, TUNEL)检测各组的细胞凋亡率;免疫印迹法检测不同处理组PC12细胞Bcl-2和Bax的表达,并采用荧光法观察不同处理组PC12细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)与线粒体膜电位水平以及caspase-3活性的变化。结果 MPP+可以使PC12细胞存活率下降,凋亡率增高;同时PC12细胞内ROS增多,线粒体膜电位下降。MPP+还可以明显地提高Bax/Bcl-2比值并激活caspase-3。而EPO可以抑制这些由MPP+引发的改变,并在1 U/mL时发挥最大保护作用。结论 EPO可抑制MPP+诱导的PC12细胞死亡,其作用机制可能与其自身抗氧化和抗凋亡的特性有关。     

14-3-3蛋白过表达减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子对PC12细胞的毒性(英文)

目的研究14-3-3蛋白过表达对1-甲基-4苯基吡啶离子(MPP )诱导的PC12细胞死亡的影响作用及其可能的机制。方法构建pcDNA3.1( )-14-3-3 真核表达质粒,用脂质体2000转染PC12细胞;Western blot技术检测PC12细胞中14-3-3蛋白、Bcl-2 蛋白, 和BAD蛋白的表达;然后分别用MTT法、酶标仪及流式细胞仪检测PC12细胞的活力、caspase的活性及PC12细胞的凋亡率。结果(1)将pcDNA3.1( )-14-3-3质粒转染PC12细胞3周后,14-3-3蛋白的表达显著增加;(2)MPP 诱导PC12细胞存活率的下降是剂量依赖性的,当MPP 的浓度达100 μmol/L时,PC12细胞的存活率丧失约50%;(3)caspase 的活性随着MPP 浓度的增加而增高,当MPP 浓度到达100 μmol/L时caspase的活性也到达最大值,而当MPP 浓度超过100 μmol/L时,caspase的活性急剧下降;(4)用100 μmol/L 的MPP 处理PC12细胞24 h后,PC12细胞的凋亡率为26.5%,14-3-3蛋白的过表达使PC12细胞的凋亡率下降到8.6%;(5)用100 μmol/L MPP 处理PC12细胞后,Bcl-2蛋白的表达趋于下调而BAD蛋白的表达上调,14-3-3蛋白的过表达能显著的增加Bcl-2蛋白的表达而使BAD蛋白的表达下调。结论14-3-3蛋白过表达通过上调Bcl-2蛋白的表达并下调BAD蛋白的表达,减少了MPP 诱导的PC12细胞的凋亡,从而发挥对PC12细胞的保护作用。这些结果可能为PD的治疗提供新的药物靶点。