PCR为基础的DNA甲基化检测技术进展

人类基因组中ＣｐＧ位点的普遍低甲基化导致癌基因表达增强及５’ＣｐＧ岛的高甲基化导致抑癌基因失活是细胞恶性转化的重要机制之一。为准确理解ＤＮＡ甲基化与细胞恶性转化的关系，有必要了解肿瘤ＤＮＡ中特定序列的甲基化改变，本文对国外学者运用ＰＣＲ技术检测基因组中ＤＮＡ特定序列的甲基化状态的进展作一介绍。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测DNA甲基化方法的建立

近期，表观遗传学与肿瘤发生关系的研究日益增多。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，并已成为肿瘤早期诊断的研究热点。甲基化特异性PCR（MSP）是检测DNA甲基化的常用方法之一，该方法灵敏度和特异度高，但操作繁琐，难以自动化。TaqMan荧光定量PCR法，即Methylight在MSP的基础上设计1条TaqMan探针，该方法的准确性和检测的灵敏度都很高。然而，因需要设计合成特异的探针而使其的应用受限，而且TaqMan探针昂贵。本研究建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR（FQ—PCR）检测DNA甲基化的方法，通过临床标本检测和对比试验，以证明其与Methylight的检测效能，以便为DNA甲基化检测的临床应用提供工具。     

DNA甲基化的生物学应用及检测方法进展

研究基因与蛋白质间的相互关系,是现代分子生物学研究的重要课题之一。近年来,现代分子生物学认为细胞中生物信息的表达受两种因素调控:一种是遗传调控,另一种是表观遗传调控。遗传信息提供了“生产”维持生命活动所必     

DNA甲基化检测方法的进展

DNA甲基化是重要的表观遗传学改变之一,肿瘤细胞中DNA甲基化形式包括基因组的整体水平低甲基化及特定基因的高甲基化.尤其是抑癌基因启动子区的高甲基化,可直接阻碍转录因子与启动子结合,从而使抑癌基因不能转录或转录水平降低.因此,基因启动子的异常甲基化可作为候选的肿瘤标志物.大量研究通过对肿瘤患者血清及其他体液中的凋亡肿瘤细胞的DNA甲基化检测辅助诊断肿瘤及判断预后,包括乳腺癌患者的乳头抽吸物,肺痛患者痰及支气管灌洗液,前列腺癌患者的尿液及其他多种肿瘤患者的血浆及血清[1].     

特异位点DNA甲基化常用检测技术及应用进展

DNA甲基化是表观遗传学的一种重要表现形式.具有相同序列的DNA片段,甲基化修饰会改变其遗传学特征,影响其生物学功能.DNA甲基化与疾病的发生、发展有密切联系.目前,循环肿瘤DNA(ctDNA)检测是众多肿瘤早筛技术中,被采用最多、进展最快的一种检测方法.因此,选择ctDNA甲基化检测方法作为辅助诊断技术,对癌症的早期...     

DNA甲基化分析技术

甲基化胞嘧啶 (5’ methylatedcytosine ,5mC)被称之为人类DNA的第 5种碱基。肿瘤表观基因组(cancerepigenomics)概念的提出和人类表观基因组计划 (HumanEpigeneticProject,HEP)的实施将表观遗传学研究又推向了一个新的高度[1]。了解DNA甲基化分析技术的原理、适应范围和优缺点有利于研究者根据自身不同需求和设备条件来选择有效方法达到最终目的[2 ,3]。1　DNA甲基化非特异性分析属于早期的DNA甲基化分析技术 ,其主要特征是只能分析基因组水平的 5mC比例 ,主要包括高效液相色谱、高效毛细管电泳、薄层层析、M .SssI甲基转移酶分…     

ID4基因甲基化定量PCR检测在急性白血病中的临床意义

尽管治疗的进步极大地改善了急性白血病患者的预后和生存,但时至今日多数类型的急性白血病没有特异性的生物标记,因此对于多数白血病患者,影响生存的复发这一重要因素缺少有效的预警机制。删基因启动子区甲基化广泛发生于各类型急性白血病。本研究在前期建立的甲基化定量PCR体系的基础上,用该方法检测患者骨髓样本,探讨ID4甲基化定量指标（percentageofmethylatedreference,PMR）的临床意义。采集我院门诊及住院确诊的初治、完全缓解、复发3个阶段的急性白血病患者骨髓样本及正常对照者骨髓样本。应用ID4甲基化定量PCR体系对样本进行检测。按初治、完全缓解、复发分组比较PMR值。比较相同病例不同疾病状态的PMR的动态变化。结果表明,初治组PMR最高,其次为复发组,而完全缓解组最低。初治组PMR与完全缓解组比较存在统计学差异。4例随访病例的PMR值波动与病情变化一致。在1例复发病例中,PMR升高早于骨髓细胞学检查确认复发1．7个月。结论：本研究通过1／94基因启动子区甲基定量检测的方法初步验证：甲基化水平的量化指标PMR值与急性白血病患者肿瘤细胞负荷关系密切。PMR动态监测波动与疾病变化一致,可能具有预测复发的作用,但IIM甲基化定量指标的临床价值还有待进一步研究证据的支持。     

DNA甲基化分析技术的研究进展

近年来,在肿瘤表观遗传学研究领域,DNA甲基化受到越来越多的关注.原因可能是DNA的分子结构相对稳定,提取及保存更为容易,在不同的组织标本中均能被有效检出.然而,要将其真正应用于临床,还亟需发展一种兼具灵敏性、特异性及可操作性的检测手段.目前一般认为有两种甲基化检测思路[1]:即甲基化分型和甲基化组学.前者通常是对单个基因或较少基因进行检测,后者则是对全基因组进行甲基化分析,又叫甲基化谱.本文围绕这两类检测技术及其在临床检验方面的应用价值进行综述.1 甲基化分型1.1 甲基化特异的聚合酶链反应(MSP) MSP的原理是将重亚硫酸盐处理后的DNA作为模板,在基因启动子5’端富含胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点的甲基化多发区域设计两对引物,一对针对甲基化的模板,另一对针对未甲基化的模板,通过凝胶电泳法,判定哪一对引物能有效扩增出目标基因,以此作为甲基化与否的标准.此法简单且易于操作,是目前应用最为广泛的甲基化定性分析手段.     

DNA甲基化定量检测的新方法:甲基化敏感性高分辨率熔解分析

DNA甲基化被认为是新一代的肿瘤标志,其对肿瘤风险评估、早期诊断以及肿瘤预后都有极其重要的诊断价值,MS-HRM方法 是一种新的定量检测甲基化的方法 ,它是基于亚硫酸盐对DNA进行修饰后具有不同的碱基构成,导致甲基化和非甲基化模板扩增后的产物热稳定性不同而进行检测.本文阐述了该方法 在肿瘤和遗传性疾病检测中的应用及优点,并对其在临床分子检测中的应用前景进行了展望.     

DNA甲基化在白血病中临床研究进展

越来越多研究表明DNA甲基化状态异常尤其是抑癌基因的高甲基化失表达在白血病的发生发展、诊断、检测微小残留病(minimal residual disease,MRD)、预测病情以及指导治疗方面都有重要作用[1]。近年来DNA甲基化谱研究的进展以及尝试利用去甲基化药物辅助治疗白血病越来越引人注目     

DNA甲基化在抑郁症研究中的进展

抑郁症是一种以情绪低落、兴趣减退为主要特征的精神障碍,严重危害人类健康和增加社会经济负担。主流观点认为抑郁症是基因与环境交互作用的结果,表观遗传完美地将两者联系在一起。DNA甲基化是最主要的表观遗传修饰之一,也是抑郁症中研究最多的表观遗传机制。本文对常见DNA甲基/去甲基化酶与抑郁症的关系,候选基因DNA甲基化与DNA甲基化组学在抑郁症中的表达模式以及DNA甲基化与抗抑郁治疗的研究进展进行综述,以期为抑郁症的诊断与治疗提供参考。     

DNA甲基化异常与白血病

甲基化修饰是脊椎动物唯一的ＤＮＡ自然修饰方式,在基因表达的调控,基因结构的稳定等方面有重要作用,与肿瘤的发生发展关系密切。白血病中的甲基化异常主要为某些基因的ＣｐＧ岛发生甲基化,致使基因表达封闭,影响细胞的正常功能。     

DNA甲基化在卵巢癌研究中的进展

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的健康。由于缺少有效的早期诊断方法,其死亡率一直居妇科肿瘤之首。随着对卵巢癌发病机制的深入研究,人们认识到肿瘤的发生不仅与遗传学机制有关,表观遗传异常也是肿瘤发     

应用PCR技术检测喉肿瘤组织中HPV DNA

目的 探讨乳头瘤状病毒在喉癌发病中的作用。方法 采用PCR技术对70例喉癌、24例乳头状瘤、114例声带息肉标本应用HPV16型及HPV6，11型探针进行DNA检测。结果 70例喉癌组织中HPV16型DNA阳性22例，阳性率31．42％。在HPV6／11型DNA检测中，24例喉乳头状瘤组织中，阳性18例，阳性率75．7％，均高于其他两组，经统计处理，差异有显著性P＜0．05。结论 经研究证实高危HPV16型DNA与喉癌发病有密切关系，低危HPV6／11型DNA是成人乳头状瘤的主要致病因素。HPV感染可能在喉癌发生过程中发挥一定作用。     

限制性酶切扫描技术测定DNA甲基化组的方法建立

目的优化试验条件，建立用于DNA甲基化组测定的限制性酶切扫描技术（RLGS）。方法选取冰冻胃癌组织及其周围非癌组织各2份，提取基因组大分子DNA（〉50000bp），用甲基化敏感的限制性内切酶Not Ⅰ等对DNA进行多重酶切、同位素”P标记、二维电泳、扫描分析，并且根据已有的位点DNA序列数据库，确定所得扫描图谱上位点所对应的序列信息。结果成功得到RLGS扫描图；有效点平均在1200个左右，标本质量较好的图谱平均可获得有效点1800个左右，与国外实验室的平均水平相当，经过比对可找出放射自显影信号强度减弱或增强的点，结果可重复，并能在Not Ⅰ-EcoR V克隆文库中找到这些点所对应的序列信息。结论成功建立了RLGS技术平台，并能够稳定工作。     

急性白血病细胞中ID4基因甲基化的PCR定量检测系统的建立及其特异性和敏感性

ID4基因启动子区甲基化发生率在急性白血病中极高,甲基化程度与急性白血病关系密切。因缺少合适的研究方法,其具体的甲基化量化水平与疾病的关系,人们一直缺乏认识。本研究旨在建立ID4甲基化定量PCR体系,同时验证该方法的特异性及敏感性,并初步尝试在初治急性白血病骨髓样本中评估ID4的甲基化水平。首先构建质粒并建立体系标准曲线,分别使用MSP和定量MSP对细胞系样本进行检测,以传统MSP的结果为对照,验证新方法的特异性;按不同比例将甲基化阴性和阳性细胞混合,用甲基化定量PCR扩增验证新方法敏感性。结果表明,本研究成功建立了符合绝对定量要求的标准曲线;通过细胞系验证,MSP结果与定量MSP结果完全一致;同时在甲基化阴性细胞背景下,定量MSP可以稳定的检测到1：10-5水平的ID4甲基化阳性细胞。在急性白血病骨髓样本检测中,定量MSP甲基化阳性检出率高于MSP。结论：本研究成功建立了完整的ID4基因甲基化定量PCR体系,该方法特异性好、敏感性高。     

DNA甲基化修饰与脑胶质瘤

脑胶质瘤是中枢神经系统常见肿瘤之一，其发生机制仍然不清楚，随着肿瘤分子生物学研究的进展，目前认为多种基因的甲基化修饰在肿瘤的起源和发生中起到重要的作用，多种基因的过甲基化表达失活是肿瘤细胞周期性调控能力失活的重要原因之一。     

原位PCR技术检测肾组织乙肝病毒DNA的临床价值

目的：探讨原位PCR技术检测肾组织乙肝病毒DNA的可靠性。方法：将肾活检确诊为乙肝病毒相关性肾炎患者59例与血清单纯HBsAb阳性且肾组织未查到HBsAg病人152例的肾组织PCR检查结果，按照诊断试验的研究方法进行比较。结果：PCR检测肾组织HBV DNA的假阳性率53．29％，假阴性率49．15％，诊断符合率47．87％。结论：原位PCR检测肾组织中HBV DNA有较高的假阳性率和假阴性率，结果不可靠。     

白血病DNA去甲基化治疗

近几年的大量研究证明,ＤＮＡ甲基化异常在白血病的发生发展中起生要作用,白血病的去甲基化治疗是建于白血病甲基化研究基础上,其作用机理不同与柔红霉素和阿糖胞苷等传统化疗药物的新治疗方法,它对复发及耐药白血病有一定疗效。本文将去甲基化治疗概念,作用,代表性药物和临床应用给予综述。     

DNA甲基化与肿瘤

DNA甲越化是真核细胞DNA正常的修饰方式，它由DNA甲基化酶催化发生。DNA甲基化后核苷酸顺序未变，而基因表达受影响，异常甲基化是肿瘤发生的重要原因。DNA甲基化作为表遗传（epigeneties）机制之一，在肿瘤发生发展机制的研究及肿瘤的诊断与治疗中越来越受到重视。