PCR为基础的DNA甲基化检测技术进展

人类基因组中ＣｐＧ位点的普遍低甲基化导致癌基因表达增强及５’ＣｐＧ岛的高甲基化导致抑癌基因失活是细胞恶性转化的重要机制之一。为准确理解ＤＮＡ甲基化与细胞恶性转化的关系，有必要了解肿瘤ＤＮＡ中特定序列的甲基化改变，本文对国外学者运用ＰＣＲ技术检测基因组中ＤＮＡ特定序列的甲基化状态的进展作一介绍。     

DNA甲基化异常与皮肤肿瘤

DNA甲基化（DNA methylation）异常主要指基因组中CpG岛发生甲基化修饰,引起基因表达异常。近几年的研究表明,DNA甲基化异常与肿瘤的发生关系密切。其主要的致癌机制为：抑癌基因启动子区被异常甲基化导致基因表达沉默进而导致肿瘤的发生;细胞周期调控基因甲基化异常致使细胞调控周期紊乱使得肿瘤细胞增殖过速;肿瘤侵袭相关基因甲基化异常致使肿瘤扩散转移以及DNA损伤修复基因异常甲基化使得肿瘤的发生机率增加。     

甲基化CpG结合蛋白2在肿瘤发生中的作用研究

表观遗传学主要从基因组修饰的角度来研究基因表达的调控机制,其中最具代表性的就是DNA甲基化,这也是目前胚胎学、肿瘤生物学关注热点。在哺乳动物中,DNA甲基化主要发生在二核苷酸胞嘧啶（CpG）第五位碳原子上,即5-甲基胞嘧啶（5-mC）。甲基化的CpG岛可产生阳性信号导致相关基因沉默。在不同组织或细胞不同发育阶段,基因组DNA上各CpG位点甲基化状态差异构成了基因组DNA甲基化谱,异常DNA甲基化会导致肿瘤发生。     

DNA甲基转移酶3A基因突变在恶性血液病中的作用

DNA甲基转移酶(DNMT) 3A为负责催化DNA从头甲基化的甲基转移酶类,DNMT3A基因突变将导致细胞基因组DNA异常甲基化,包括基因组DNA总体甲基化水平减低及部分基因启动子区CpG岛甲基化水平增高状态,从而导致肿瘤的发生.近年来,多项研究结果显示,DNMT3A基因突变率在急性髓细胞白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)等恶性血液病中较高,并可作为新的预后不良指标,在指导恶性血液病的临床治疗、判断预后中发挥作用.笔者就DNMT3A基因突变在多种恶性血液病中作用的相关研究进展进行综述.     

结直肠癌BRAF基因突变与CpG岛甲基化的相关性研究进展

结直肠癌在恶性肿瘤发病率中排名前三位,其致死率居高不下.其中原癌基因和抑癌基因发生经典遗传学和表观遗传学改变是肿瘤发生的重要分子机制.而CpG岛甲基化是表观遗传学重要改变方式之一,其主要表现为基因组中的启动子区CpG岛发生DNA甲基化,如果这种甲基化发生在抑癌基因上,会使抑癌基因功能失活,从而诱发肿瘤.基因组广泛发生C...     

CpG岛甲基化异常的致癌作用

真核生物染色体DNA甲基化(DNA methylation)是基因表达调控的方式之一.DNA复制后,由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)催化S-腺苷蛋氨酸的甲基转移到DNA分子中形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine),从而生成甲基化DNA.高等真核细胞通常是对DNA分子上5′-CpG-3′序列的胞嘧啶进行甲基化修饰.CpG二核苷酸在人类基因组中占10%,其中70%～80%呈甲基化状态,可称为甲基化CpG位点.非甲基化CpG二核苷酸区域仅占基因组的1%～2%,这些CpG二核苷酸以较大密度分布于基因5′端,称为CpG岛.CpG岛一般为0.5～2 Kb长,通常位于基因的5′端启动区,也可延伸至基因的外显子区[1].     

DNA甲基转移酶1、3b基因在肾癌的表达

肾细胞癌是我国泌尿系统常见的肿瘤之一。肿瘤的发生与抑癌基因的失活有关,研究发现,抑癌基因甲基化是其失活的重要机制之一。甲基化并不使基因序列发生改变,而是使抑癌基因转录失活,表达受抑制,导致肿瘤形成。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（Dnmt）催化,将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类Dnmt在CpG岛甲基化过程中至少有Dnmtl、Dnmt3a和Dnmt3b参与。Dnmtl和Dnmt3b是DNA甲基化的关键酶,其表达直接影响着DNA甲基化状态。本研究采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Dnmtl、Dnmt3bmRNA在肾细胞癌组织及正常肾组织中的表达,并探讨其表达的临床意义。     

亚硫酸氢盐测序法检测上皮钙黏蛋白甲基化的优化探讨

目的探讨改进的亚硫酸氢盐测序法在上皮钙黏蛋白甲基化检测中的可行性。方法提取雄性F344大鼠肾脏组织基因组DNA,亚硫酸氢盐化学转化,通过PCR扩增上皮钙黏蛋白基因启动子区特定的序列,以蓝白克隆斑筛选和测序。结果雄性F344大鼠肾脏上皮钙黏蛋白基因启动子区CpG岛的26个CpG位点均未发生甲基化。结论改进后亚硫酸氢盐测序法能明显减少非特异性扩增,提高PCR效率,更适于基因甲基化状态的检测。     

急性白血病患者p15与p16基因甲基化检测及mRNA表达水平的定量分析

近年研究发现肿瘤细胞中存在DNA甲基化分布异常。即在肿瘤细胞中同时还存在基因组某些区域，特别是在一些抑癌基因的启动子区域高甲基化现象。抑癌基因启动子及转录起始区高甲基化可能也是导致抑癌基因失活和细胞恶性转化的机制之一。抑癌基因p15(CDK2B)和p16(CDK2A)均位于人类9号染色体短臂(9p21)，编码两种细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制性蛋白，参与细胞增殖与分化的调节。为探讨p15与p16在白血病细胞的甲基化状态及与表达水平的关系，我们应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术检测40例初诊急性白血病(AL)患p15和p16甲基化状态，同时用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-QPCR)技术检测p15和p16基因mRNA表达水平。     

DNA甲基化标志物在分子诊断与治疗中的价值

DNA甲基化是指基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳原子上共价结合一个甲基基团,其主要参与基因的表达调控。DNA甲基化异常与肿瘤等疾病密切相关。抑癌基因启动子区甲基化是肿瘤发生发展的重要事件。DNA甲基化,不仅可作为肿瘤分子诊断的标志物,同时也可作为分子治疗的靶标。     

DNA甲基化与膀胱癌研究进展

DNA甲基化（DNA methylation）是在DNA序列不变的情况下,控制基因表达,维护染色体的完整性和调节DNA重组及某些特定基因组区域的转录活性,是恶性肿瘤普遍存在的分子生物学改变。肿瘤相关基因启动子CpG岛甲基化状态异常广泛见于肿瘤,有望作为临床肿瘤诊断的分子标记。膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤,而膀胱癌与DNA甲基化关系近年来已成为膀胱癌研究热点之一。     

直接测序与克隆测序检测不育男性H19基因甲基化印记的比较

目的 建立亚硫酸氢盐修饰后测序技术,比较直接测序与克隆测序在不育男性精子印记基因DNA甲基化状态检测中的差别.方法 对样本进行精液分析和精子形态学分析,密度梯度离心法制备精液.提取精液基因组DNA并行亚硫酸氢盐处理,行半巢式PCR,将纯化后PCR产物与pCR 2.1-TOPO 载体连接及转化,分别对PCR产物及阳性克隆菌液进行测序.结果 PCR产物直接测序,前半部分序列丢失约40bp,1号CpG位点甲基化状态信息丢失.每例标本只有-个测序结果,会出现CpG位点的部分甲基化状态.挑取15个克隆进行测序,序列无丢失,18个CpG位点甲基化状态信息均完整.15个克隆CpG位点甲基化状态有所不同,显示出此样本的平均甲基化状态.结论 克隆测序不会造成序列丢失,CpG位点甲基化状态信息完整,克隆测序能较好地反应样本的平均甲基化状态.     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应（PCR），并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7，提取基因组DNA，利用亚硫酸氢盐测序法，用常规、降落及改进PCR分别扩增，比较扩增效果，PCR产物纯化回收后，TA克隆入载体pGEM-T，转化大肠杆菌（E．coli DH5α），筛选阳性克降，经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒，测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比，扩增效率增高，二聚体及非特异性扩增减少；测序结果显示，MCF-7细胞基因组DNA中，RASSFIA基因启动子CpG岛是高甲基化的，E-cadherin基因启动子CpG岛末呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性，更适用于基因甲基化状态的检测，并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。     

乳腺癌相关基因过甲基化的研究进展

抑癌基因失活包括基因内突变、染色体丢失和启动子甲基化。DNA甲基化是目前抑癌基因的研究热点之一，是肿瘤发生的早期事件。甲基化表型早于恶性表型的出现。并且每种肿瘤具有独特的甲基化谱，检测乳腺癌抑癌基因过甲基化有助于早期发现有癌变倾向的乳腺细胞，对早期诊断和逆转因甲基化失活的抑癌基因，从而在一定程度上逆转具有恶性倾向的肿瘤有一定意义。     

细菌CpG DNA的免疫激活作用研究进展

细菌基因组DNA中以较高的频率出现非甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG DNA)，免疫活性细胞的Toll样受体-9(TLR9)可以识别CpG DNA并激活NF-κB途径，活化免疫活性细胞，引起以Th1型为主的免疫应答，在诱导天然免疫、疫苗佐剂、抗肿瘤、促进造血、防治过敏性疾病等方面得到广泛应用。     

恶性血液病细胞株中IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态的初探

本研究探讨基因IEX-1启动子区CpG岛甲基化状态的改变及其与恶性血液病发生的相关性.应用MSP的方法检测9种恶性血液病细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态,并把经M.sssI酶处理过的正常人外周血单个核细胞中IEX-1 CpG岛甲基化状态作为阳性对照,把正常人外周血单个核细胞中IEX-1 CpG岛甲基化状态作为阴性对照.结果显示:在NB4、Molt4.、Raji细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛呈高甲基化状态;在CA46、CEM、U937、K562、HL-60、Jurkat细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛呈部分甲基化状态;在正常人外周血单个核细胞中IEX-1基因启动子区CpG岛呈非甲基化状态;经M.sssI酶处理过的正常人外周血单个核细胞中IEX-1基因启动子CpG岛呈高甲基化状态.结论:IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态的改变与恶性血液病有一定的相关性.     

恶性血液病去甲基化治疗的研究进展

DNA甲基化是一种在DNA序列不变情况下的DNA生物修饰方式。一般来说,基因表达水平与DNA甲基化呈负相关,异常CpG岛的甲基化可诱导基因沉默。去甲基化治疗就是用药物清除启动区的甲基,使因高甲基化而关闭的抑癌基因重新表达,达到治疗肿瘤的目的。去甲基化治疗作为一种新的治疗途径可能对防止恶性血液病化疗耐药及复发有一定作用。本文对DNA甲基化的机制、DNA甲基化异常与恶性血液病的关系、DNA去甲基化治疗的机理以及恶性血液病（急性、慢性白血病、淋巴瘤以及骨髓增生异常综合征）去甲基化治疗的研究进展进行了综述。     

乳腺癌相关基因过甲基化的研究进展

抑癌基因失活包括基因内突变、染色体丢失和启动子甲基化。DNA甲基化是目前抑癌基因的研究热点之一,是肿瘤发生的早期事件。甲基化表型早于恶性表型的出现,并且每种肿瘤具有独特的甲基化谱,检测乳腺癌抑癌基因过甲基化有助于早期发现有癌变倾向的乳腺细胞,对早期诊断和逆转因甲基化失活的抑癌基因,从而在一定程度上逆转具有恶性倾向的肿瘤有一定意义。     

改进的PCR在抑癌基因启动子CpG岛甲基化检测中的应用

目的改进聚合酶链反应(PCR),并检验改进后的方法在甲基化检测中的可行性。方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,提取基因组DNA,利用亚硫酸氢盐测序法,用常规、降落及改进PCR分别扩增,比较扩增效果,PCR产物纯化回收后,TA克隆入载体pGEM-T,转化大肠杆菌(E.coliDH5α),筛选阳性克隆,经PCR扩增鉴定后获得阳性重组质粒,测序比对。结果改进后PCR与常规、降落PCR相比,扩增效率增高,二聚体及非特异性扩增减少;测序结果显示,MCF-7细胞基因组DNA中,RASSF lA基因启动子CpG岛是高甲基化的,E-cadherin基因启动子CpG岛未呈现高甲基化状态。结论改进后方法提高了以PCR为基础的甲基化分析的可行性,更适用于基因甲基化状态的检测,并为扩增富含CG的基因启动子区域提供参考。     

甲基化CpG结合蛋白(MeCPs)在肿瘤表遗传学研究中的进展

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，近年来大量的研究表明：肿瘤的发生不但存在遗传学上的改变，而且存在表遗传学的改变。表遗传学的改变主要包括DNA甲基化和组蛋白修饰。在哺乳动物中，DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶催化下，以孓腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基化供体，将甲基转移到特定碱基的过程。在人类，DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC），以甲基CpG（mCpG）形式出现。研究表明：DNA甲基化与基因表达沉默密切相关。