稳定表达的人自身免疫调节因子HeLa细胞的建立及鉴定

目的 :建立稳定表达人自身免疫调节因子 ( autoimmune regulator,AIRE)的细胞株。方法 :用 Fu GENE6转染试剂将含 AIRE c DNA的真核表达载体转染 He La细胞 ,经 G41 8筛选阳性克隆。继续培养 4周 ,用荧光显微镜观察、流式细胞仪 ( FACS)检测和免疫印迹法检测 AIRE基因在 He La细胞中的稳定表达情况。结果 :经荧光显微镜、流式细胞仪及免疫印迹法检测 ,证实 AIRE基因得到了稳定表达。结论 :在 Fu GENE6转染试剂的介导下 ,AIRE基因在 He La细胞内获得稳定表达     

转录组的重编写：腺苷到肌苷RNA碱基在肿瘤进展中的作用

腺苷至肌苷RNA编辑（AIRE）是指转录前体RNA在腺苷酸脱氨酶的作用下,某些位点的腺苷发生脱氨反应转变成肌苷的过程,在碱基配对时,肌苷被识别作鸟苷,导致转录组重编写。随着高通量测序技术的不断进步,大量异常的AIRE被发现可导致氨基酸编码改变、RNA剪切异常以及microRNA-mRNA重定向等过程,从而参与肿瘤的发生发展。绝大部分的AIRE位点均位于基因非编码区,解析它们的生物学功能仍存在一定的挑战。本综述旨在描述AIRE的生物学机制和AIRE位点在不同肿瘤发生发展作用的进展,为AIRE与肿瘤的研究提供思路。     

自身免疫调节因子促进THP-1细胞的自噬性凋亡

目的 探讨自身免疫调节因子(AIRE)对THP-1单核细胞凋亡的影响及其可能的分子机制.方法 将THP-1细胞以佛波醇酯(PMA)诱导分化后,进行瞬时转染.免疫荧光和Western blot法检测转染效率.通过Annexin Ⅴ-FITC、PI双染色法和流式细胞仪检测过表达AIRE的THP-1细胞凋亡率.通过间接免疫荧光染色和Western blot检测自噬蛋白LC3B的表达.结果 PMA诱导后,THP-1细胞贴壁生长,形态多样,胞质内可见空泡、吞噬细胞碎片等典型成熟分化形态.转染48 h后,THP-1细胞的AIRE蛋白呈现明显高表达.对比空载体转染和阴性对照,过表达AIRE使THP-1细胞的凋亡率上升;同时,Western blot显示LC3B-Ⅱ的蛋白水平也较空载体转染组增高,且间接免疫荧光染色提示单个细胞的阳性LC3B-Ⅱ斑点数目较空载体转染组明显增加(P＜0.05).结论 AIRE可能通过上调THP-1细胞的自噬促进其凋亡.     

移植转导自身免疫调节因子的骨髓细胞对I型糖尿病预防和治疗的实验研究

【立论依据】 I型糖尿病又称自身免疫性糖尿病,是由于自身免疫耐受机制打破、自身反应性T细胞攻击胰岛β细胞所致的自身免疫性疾病。迄今对自身免疫病的治疗方案多不理想,目前常规采用的免疫抑制手段不但降低患者免疫力,也使疾病容易复发。理想的治疗自身免疫病的策略是特异性清除自身反应性T细胞,重建对自身组织抗原的免疫耐受。而自身免疫调节因子(AIRE)恰在胸腺阴性选择中具有调控组织限制性抗原(TRAs)表达、促进自身反应T细胞的清除、参与免疫耐受诱导的功能。因此,我们设想利用基因转导手段操纵骨髓细胞中AIRE的表达,通过模拟胸腺的阴性选择,诱导免疫耐受,为I型糖尿病的防治提供新策略。 【设计思路】 本实验拟通过以自身免疫糖尿病小鼠(NOD鼠)为模型,移植表达AIRE的骨髓细胞,使其在NOD鼠体内通过调控TRAs的表达清除自身反应性T细胞,观察其诱导特异性清除对胰腺组织特异性T细胞的作用及对NOD鼠糖尿病发生的影响,探索I型糖尿病防治新方法。 【实验内容】 (1)构建编码小鼠AIRE的逆转录病毒载体,将其转导入骨髓DCs细胞。(2)将转导AIRE的骨髓DCs细胞移植至经放射线照射的NOD小鼠,获得NOD嵌合鼠。(3)采用流式细胞术检测NOD嵌合鼠胸腺和脾脏中GFP⁺细胞数量,检测NOD鼠嵌合程度。(4)采用real-time PCR法、流式细胞术检测Ins2 mRNA水平和蛋白水平表达变化,检测AIRE对TRAs的调控作用。(5)检测NOD鼠糖尿病发生时间和程度以及其病理学和胰岛素自身抗体的改变。 【材料】 NOD鼠、编码AIRE的逆转录病毒载体、real-time PCR仪、流式细胞仪、葡萄糖检测试剂盒、尿糖试纸、ELISA试剂盒等。 【可行性】 前期工作中,以胸腺阴性选择为理论依据,对AIRE的表达、分布及其在自身耐受中的作用进行了系统、深入的研究,现以基因转导和骨髓细胞移植为技术手段,切实可行。 【创新性】 本研究首次将基因操纵和骨髓细胞移植两大先进技术相结合,利用AIRE能特异性清除自身反应性T细胞的功能,探究治疗I型糖尿病的方法,为自身免疫疾病的防治提供新思路。     

AIRE通过调控Notch1表达影响CD4~+CD25~+Treg的作用及其机制

目的：研究AIRE基因是否可通过调控Notch1的表达而影响CD4+CD25+Treg细胞的诱导及功能,探讨AIRE在外周免疫耐受中的作用机制。 方法：将RAW264.7细胞分为转染组和未转染组,采用脂质体法将pEGFPC3-AIRE质粒转入RAW264.7细胞, 采用RT-PCR法检测各组AIRE mRNA的表达及Notch1 mRNA表达的变化。 将RAW264.7细胞分为转染组、转染并经Notch1抗体阻断组、 阴性对照组及未转染并经Notch1抗体阻断组,分别采用FACS法及RT-PCR法检测各组RAW264.7细胞对CD4+CD25+Treg细胞数量及Foxp3 mRNA 表达的影响。 结果： 质粒成功转入RAW264.7细胞内。 AIRE转染组较未转染组Notch1 mRNA表达增加。 AIRE转染组较未转染组CD4+CD25+Treg细胞的数量及功能相关基因Foxp3 mRNA的表达水平均增加,经Notch1抗体阻断后, AIRE转染组与未转染组CD4+CD25+Treg细胞的数量及功能均较对照组降低。 结论：AIRE可能通过上调RAW264.7细胞上Notch1的表达进而影响CD4+CD25+Treg细胞的诱导产生及功能,从而在维持外周免疫耐受方面发挥一定的作用。     

母源性／胎源性基因组 DNA 中的甲基化特异性鉴定及其在唐氏综合征诊断 中的 价值

目的：研究3号染色体上 RASSF1A 基因、21号染色体上的 AIRE 基因在母源性／胎源性基因组DNA 中的甲基化特异性及产前诊断价值。方法收集30例孕妇（早、中、晚孕期各10例）外周血及胎儿组织,离心分离血浆和血细胞;所有血细胞和胎儿组织基因组 DNA 样本经过甲基化修饰后进行目的基因 PCR,即同时进行3号染色体 RASSF1A、21号染色体 AIRE 基因的甲基化引物和非甲基化引物的扩增;30例血浆基因组 DNA 甲基化修饰后进行 RASSF1A、AIRE 基因的甲基化引物扩增;1例唐氏综合征胎儿和 1例正常胎儿母血浆基因组DNA 甲基化修饰后,进行 AIRE 和 RASSF1A 基因的甲基化引物扩增,电泳后的目的条带进行 Gel －pro analyzer 软件光密度值分析。结果30例胎儿组织标本和30例母血细胞标本,均提取出基因组 DNA。胎盘组织 AIRE、RASSF1A 基因甲基化引物扩增出目的条带;母血细胞 AIRE、RASSF1A 基因非甲基化引物扩增出目的条带。RASSF1A、AIRE 基因存在母源性／胎源性的甲基化差异（P ＜0．05）;此差异性不受年龄、孕产史、妊娠阶段等妊娠状态的影响（均 P ＞0．05）。在保证30例血浆标本存在基因组 DNA 的前提下,进行 AIRE、RASSF1A 基因的 MS －PCR 扩增,阳性率分别为73％、77％。通过3号染色体上 RASSF1A 基因的对比消除误差因素影响,唐氏综合征胎儿和正常胎儿母血浆游离胎儿 DNA 进行21号染色体上的 AIRE 基因浓度对比,的确存在3∶2的数量关系。结论人类3、21号染色体上存在母源性／胎源性甲基化表观遗传学差异（即母体是非甲基化的而胎儿阶段是甲基化的修饰状态）,并且不受妊娠阶段、年龄和孕产史等妊娠状态的影响,是一种很好的胎儿遗传学标记;利用母源性／胎源性甲基化差异可以进行母血浆中胎儿 DNA 的鉴定,甲基化引物扩增出来的目的基因一定是胎儿基因,可以保证胎儿 DNA 的纯度和可信度;待检测标本的母血浆基因组 DNA 和正常胎儿母血浆基因组 DNA 甲基化修饰后,进行 AIRE 基因甲基化引物扩增,两者的 AIRE 基因定量对比代表着21号染色体数量之间的对比,可以作为一种无创性产前诊断唐氏综合征的确诊方法进行下一步探讨。     

Upregulation of phagocytic clearance of apoptotic cells by autoimmune regulator

To investigate the effect of autoimmune regulator （AIRE） on phagocytic clearance of apoptotic cells, a recombinant expression vector containing full-length human AIRE cDNA was transfected into 16HBE cells. After incubation with transfected 16HBE cells, engulfment of apoptotic HL-60 cells induced by camptothecin was detected by myeloperoxidase （MPO） staining. The change in the expression of Rac 1 in transfected 16HBE cells was determined by RT-PCR and Western blotting. The results showed that the phagocytosis percentage of the experimental group, the mock trans- fection group and the negative control group （non-apoptotic cells） was （25.50±3.67）%, （6.25±1.58）% and （1.0±0.67）%, respectively. Moreover, the expressions of Rac 1 mRNA and protein were up-regulated in AIRE-transfected 16HBE cells, suggesting that AIRE may function as a regulator in the phagocytic clearance of apoptotic cells by promoting the expression of Rac 1.     

AIRE3000智能妇科消融仪治疗宫颈炎临床研究

目的:观察AIRE3000智能妇科消融仪治疗宫颈炎的疗效。方法:回顾性总结2007年10月~2010年5月我院应用AIRE3000智能妇科消融仪治疗宫颈炎共340例。结果:340例中痊愈334例,占98.2%,好转6例,占1.8%,总有效率100%。结论:该法疗效肯定,1次性治愈率高,是目前治疗宫颈炎最为理想的方法。     

自身免疫调节因子对CD4+CD25+Treg细胞的影响

目的：观察自身免疫调节因子（AIRE）对CD4+CD25+Treg细胞的影响,探讨其在外周免疫耐受中的作用及机制。方法：pEGFPC3-AIRE质粒通过脂质体介导转染RAW264.7细胞;通过流式细胞术检测CD4+CD25+Treg细胞的数量;采用半定量RT-PCR法检测Foxp3和转化生长因子β（TGF-β）mRNA的表达;采用ELISA法检测TGF-β1水平。结果：AIRE转染的RAW264.7细胞可直接或间接诱导CD4+CD25+Treg细胞的产生及Foxp3 mRNA表达增强(P<0.05)。结论：表达在外周抗原提呈细胞（APCs）上的AIRE可直接和（或）间接影响CD4+CD25+Treg细胞的诱导产生及功能,从而可能在外周免疫耐受中发挥重要作用。     

Non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21 by dosage ratio of fetal chromosome-specific epigenetic markers in maternal plasma

This study examined the methylation difference in AIRE and RASSF1A between maternal and placental DNA,and the implication of this difference in the identification of free fetal DNA in maternal plasma a...