黄芪抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的 探讨黄芪对乙型肝炎病毒抗原表达的抑制作用.方法 黄芪作用于体外培养的HepG 2.2.15细胞,观察黄芪对HepG 2.2.15细胞分泌HBsAg,HBeAg的影响及药物的细胞毒性.结果 黄芪作用于HepG 2.2.15细胞12 d后,对细胞的半数毒性浓度(CD50)1 500 ng/ml,对HBsAg和HBeAg抑制的半数有效浓度(ID50)分别为115.4 μg/ml和317.2 μg/ml,黄芪对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)分别13.00,4.73.结论黄芪在体外细胞培养中对HBsAg及HBeAg的分泌有较好的抑制作用.     

狭叶五味子中化合物扁枝杉香豆素和 (-)-表儿茶酸体外抗乙型肝炎病毒活性研究

目的 研究从狭叶五味子 Schisandra lancifolia 中分离化合物扁枝杉香豆素 (phyllocoumarin) 和 (-)-表儿茶酸［(-)-epicatechin］的体外抗乙型肝炎病毒 (HBV) 活性。方法 为了筛选和确认扁枝杉香豆素和(-)-表儿茶酸体外抗 HBV 活性,以 HepG2.2.15 细胞为体外研究 HBV 模型,分别用 RPMI 1640 完全培养基稀释不同质量浓度的药物作用于细胞,培养 3 d 后收集上清,采用 MTT 法检测药物对 HepG2.2.15 细胞的生长影响和 ELISA 法检测培养上清中 HBsAg 和 HBeAg 的水平,评价扁枝杉香豆素和(-)-表儿茶酸对 HBsAg 和 HBeAg 的影响。结果 扁枝杉香豆素和(-)-表儿茶酸具有一定的体外抗 HBV 活性,其细胞毒性非常小,CC₅₀ 均大于 200 μg/mL。扁枝杉香豆素具有较强的抑制 HBsAg 和 HBeAg 分泌作用。阳性对照药物阿德福韦酯也抑制 HBV HBsAg 和 HBeAg 分泌,但在相同质量浓度 (1.6 μg/mL) 下其抑制作用较扁枝杉香豆素弱。结论 狭叶五味子中化合物扁枝杉香豆素和 (-)-表儿茶酸具有一定体外抑制 HBV HBsAg 和 HBeAg 分泌的作用,从而起到抗 HBV 作用。     

徐长卿水提物抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的初步探讨徐长卿水提物的抗乙型肝炎病毒(HBV)作用.方法通过徐长卿水提物作用于体外培养的2.2.15细胞株,观察其对2.2.15细胞株分泌HBsAg和HBeAg的影响,以初步评价其抗HBV作用. 结果徐长卿水提物作用于2.2.15细胞株12d后,对2.2.15细胞株的半数毒性浓度为62.65g/L,对HBsAg的半数抑制浓度小于0.78 g/L、对HBeAg的半数抑制浓度为10.13 g/L;对HBsAg治疗指数大于80.32,对HBeAg治疗指数为6.18.结论徐长卿水提物在体外细胞培养中对两抗原的分泌有较好的抑制作用.     

TLR7配体Loxoribine抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的 探讨TLR7配体Loxoribine对乙型肝炎病毒的抑制作用。方法 采用MTT法观察Loxoribine药物对体外培养HepG2.2.15细胞的毒性作用,ELISA及荧光定量PCR法分析药物对细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量的影响。结果 低浓度Loxoribine对体外培养的HepG2.2.15细胞生长有一定抑制作用,但随着药物浓度增高,对细胞生长并无明显毒性作用。Loxoribine可有效地抑制HepG2.2.15细胞HBV DNA的复制及HBsAg的分泌,并随着药物浓度的增加和作用时间的延长,对HBsAg抑制率增大,而对HBeAg的分泌无抑制作用。结论 Loxoribine在体外具有抗乙型肝炎病毒的作用。     

6-甲基香豆素对乙型肝炎病毒转录和复制的影响

目的 探讨6-甲基香豆素对乙型肝炎病毒(HBV)转录和复制的影响.方法 MTT法检测6-甲基香豆素在HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞中的细胞毒性.使用含0.1％DMSO的生理盐水(阴性对照),6-甲基香豆素(5、10、20μmol/L)及恩替卡韦(25 nmol/L,阳性对照)处理HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞6 d.RT-qPCR检测细胞中HBV DNA和HBV RNA的水平,ELISA检测细胞上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)水平.雄性HBV转基因小鼠每2天腹腔注射含0.1％DMSO的生理盐水(阴性对照),6-甲基香豆素(5 mg/kg)和恩替卡韦(0.02 mg/kg,阳性对照)1次,每6天采血及称重1次.药物处理24 d后,处死小鼠并解剖取肝脏.RT-qPCR检测小鼠血清和肝脏组织中HBV DNA水平及肝脏组织中HBV RNA水平,ELISA检测小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、HBsAg和HBeAg水平.结果 与对照组相比,6-甲基香豆素可以呈浓度依赖性的降低HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞中HBV DNA和HBV RNA及细胞分泌的HBsAg和HBeAg水平(P<0.05).6-甲基香豆素在不影响小鼠体重及AST、ALT的同时,可以显著降低HBV转基因小鼠血清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平及小鼠肝脏组织中HBV DNA和HBV RNA水平(P<0.05).结论 在HepG2.2.15细胞、HepG2-NTCP细胞和HBV转基因小鼠模型中6-甲基香豆素均具有较强的抑制HBV转录和复制的作用.     

HepG2.2.15细胞的差异性表达及对IFN-α的反应性研究

采用有限稀释法从HepG2.2.15细胞株中分离出10株单克隆细胞株.ELISA法检测其HBsAg与HBeAg表达量,根据HBsAg、HBeAg表达量的不同,筛选出最高、中等、最低3株克隆细胞株.MTT法进行干扰素(IFN)-α的细胞毒作用研究,表明IFN-α对不同克隆细胞株药物毒作用相似.ELISA法检测各克隆细胞株给IFN-α前后HBsAg、HBeAg表达量,IFN-α对HepG2.2.15细胞HBeAg的抑制作用较弱,对HBsAg、HBV DNA的抑制作用较强,且对表达量高的克隆细胞株抑制作用更强.不同HepG2.2.15细胞表达HBsAg与HBeAg存在差异性,且表达量高的细胞株对治疗浓度的IFN-α更加敏感.     

蛋清溶菌酶对乙肝病毒的抑制作用

目的:观察蛋清溶菌酶(HEWL)对人乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用。方法:以2.2.15细胞为模型,以苦参碱为阳性对照药,采用细胞病变法(CPE)和酶联免疫吸附实验(ELISA)判定溶菌酶对2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)表达水平的抑制效果。结果:HEWL对细胞的最大无毒浓度(TC0)和半数中毒浓度(TC50)均>1 000μg.mL-1,HEWL对2.2.15细胞HBsAg抑制作用的半数有效浓度(IC50)为(213.0±71.3)μg.mL-1,对细胞HBeAg无抑制作用。苦参碱对2.2.15细胞的TC0和TC50均>250μg.mL-1。苦参碱对2.2.15细胞HBsAg抑制作用IC50的为(54.2±17.1)μg.mL-1,对HBeAg无抑制作用。结论:蛋清溶菌酶对2.2.15细胞的HBsAg表达有较明显的抑制作用,对其HBeAg无抑制作用。     

复方大黄对HBV抗原分泌的抑制作用研究

目的 观察复方大黄对HBV病毒复制的抑制作用.方法 用MTT法测定复方大黄在不同浓度下对HepG2.2.15细胞的细胞毒性,ELISA法检测复方大黄对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg颗粒的影响.结果 复方大黄对HepG2.2.15细胞4d和8d的半数毒性浓度(TD50)分别为1.73和1.06(P＜0.05);对HBeAg4d和8d的治疗指数(TI)分别为2.84和5.30(P＜0.01);对HBsAg4d和8 d的治疗指数分别为0.00和0.42(P＞0.05).结论 复方大黄可抑制HepG2.2.15细胞分泌HBeAg,具有体外抗乙型肝炎病毒的作用.     

新加达原饮对HepG2.2.15细胞表达HBsAg的抑制作用

目的 观察新加达原饮(IXJDY)体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 采用四甲基噻唑蓝(MTT)法检测IXJDY对HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0);在TC0基础上观察不同浓度药物作用于HepG2.2.15细胞,分别在第72 h和144 h收集细胞培养上清液,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定上清液HbsAg的滴度.结果 TC50=14.22 mg·mL,TC0=8.13 mg·mL-1,新加达原饮对HepG2.2.15细胞毒性较低.无毒浓度的新加达原饮在HepG2.2.15细胞培养中可有效地抑制HBsAg的分泌,(P＜0.05,P＜ 0.01);且呈现量效和时效关系.结论 IXJDY在体外有显著的抗HBV的作用.     

针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性

目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.     

黄芪蛰虫合剂体外抗乙型肝炎病毒的作用观察

目的: 观察黄芪蛰虫合剂体外抗乙型肝炎病毒 (HBV) 的作用. 方法: 以HepG2.2.15细胞为靶细胞,分别加入不同浓度的黄芪蛰虫合剂和α干扰素. 采用ELISA法及荧光定量PCR法,测定药物对细胞培养上清HBsAg, HBeAg及细胞外HBV DNA的抑制作用. 结果: 黄芪蛰虫合剂具有一定程度的抗HBV的作用,其抑制HBsAg, HBeAg及细胞外HBV DNA的50 %抑制浓度(IC50)分别为1.35, 1.92, 2.19 g/L. 治疗指数(TI)＞3.56～5.79. α-IFN也有抑制HBV的作用,但抑制作用较弱. 结论: 黄芪蛰虫合剂具有一定的体外抗HBV作用.     

甘草甜素对HepG2.2.15细胞株HBeAg水平及TLR4表达的影响

目的 探讨甘草甜素(GL)时HepG2.2.15细胞上清HBeAg分泌,Toll样受体4(TLR 4)信号分子的表达及对细胞增殖的影响.方法 实时荧光定量PCR检测TLR4表达;直接免疫荧光流式细胞术(FCM)检测表达TLR4的阳性细胞率;ELASA检测HBV所分泌抗原;MTT检测细胞增殖活性,并与空白对照组比较.结果 给药后HBV e抗原(HBeAg)的分泌结果显示,总体均数间差异显著(P<0.05),但甘草甜素各组与对照组比较差异无统计学意义;GL各组TLR4 mRNA及流式细胞TLR4的表达总体均数间均有显著差异(P<0.01),分别与对照组相比差异有显著性(P<0.01),100μg/mL组尤其明显;MTT实验显示,200μg/mL缸以下三个剂量组均可促进细胞增殖,50μg/mL组与对照组间差异显著(P<0.05);400μg/mL、800μg/mL两组均显著抑制细胞增殖(P<0.01);而MTT结果与HBeAg水平呈显著负相关(P<0.01),与TLR4表达无相关关系(P>0.05.结论 研究表明,甘草甜素对HepG2.2.15的e抗原分泌可能具有双向作用;细胞的存活率与e抗原呈负相关;TLR4在HepG2.2.15细胞株低表达,GL可上调TLR 4表达,甘草甜素可影响先天免疫中的TLR4信号分子,有可能在体内通过免疫途径影响HBV复制和抗原分泌.     

肝康颗粒的药效学研究

目的该实验旨在观察中药复方剂肝康颗粒体外抗乙型肝炎病毒及其药效学。方法利用HepG2.2.15细胞模型,采用MTT法和细胞凋亡染色实验来检测肝康颗粒的细胞毒性,并观察其量-效关系;通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测乙肝病毒HBV中HBsAg和HBeAg的表达,并用荧光定量PCR技术定量分析HBV DNA的复制浓度。结果 MTT法检测结果发现随着浓度和时间的增加,对HepG 2.2.15细胞生长抑制作用明显增强。ELISA法测定加药后HBV病毒分泌到上清液中的HBsAg和HBeAg含量,可见随着浓度的增大,对HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用增加,并且抑制效果随着作用时间的累加也相应增强。GKKL抑制HBV病毒分泌HBsAg和HBeAg的治疗指数值TI均大于2,结果显示药物低毒高效,具有很好的安全性。实时荧光定量PCR法检测发现,与对照组相比较,肝康颗粒对HBV DNA具有显著的抑制作用,均可使细胞上清液中HBV DNA的拷贝数降低(P<0.05,P<0.01)。且随着浓度和作用时间的增加其作用逐渐增强,呈现一个明显的量效和时效反应关系。结论由此证明肝康颗粒具有降低HBsAg和HBeAg,抑制HBV DNA复制的明显作用,将为进一步药理毒理研究提供实验基础。     

华支睾吸虫合并HBV感染对肝星状细胞和巨噬细胞作用的体外研究

目的华支睾吸虫合并HBV感染对肝星状细胞和巨噬细胞的作用。方法以华支睾吸虫分泌排泄蛋白(CsESP)(10μg/mL)合并HepG2.2.15细胞(5×10~5个)共孵育人肝星状细胞(LX-2),同时设10μg/mL CsESP、5×10~5个HepG2.2.15单独处理组和PBS组。荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组肝纤维化相关指标α-平滑肌蛋白(α-SMA)、胶原蛋白Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ的转录水平;利用CsESP(10μg/mL)合并乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)(5μg/mL)共同刺激巨噬细胞RAW264.7细胞,同时设10μg/mL CsESP、5μg/mL HBeAg单独处理组和PBS组,qRT-PCR法检测各组一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素6(IL-6)、NLRP3炎症小体、白细胞介素-1β(IL-1β)的表达情况,同时使用流式细胞术检测其凋亡水平变化。结果 qRT-PCR法检测结果显示,CsESP合并HepG2.2.15处理组中LX-2细胞α-SMA和Collagen-Ⅰ的m RNA水平与CsESP或HepG2.2.15单独处理组相比显著上升,差异有统计学意义(P0.05),而Collagen-Ⅲ表达变化不明显。CsESP与HBeAg共处理诱导RAW264.7细胞中NLRP3、IL-1β、IL-6、TGF-β、TNF-α和iNOS的mRNA水平与CsESP或HBeAg单独刺激组相比显著上升,差异有统计学意义(P0.05)。CsESP与HBeAg共处理组凋亡细胞比率为16.35%,明显高于CsESP、HBeAg单独处理组的6.03%和12.52%,差异有统计学意义(P0.05)。结论华支睾吸虫合并HBV感染体外可促进肝星状细胞的激活,并可促进巨噬细胞炎症因子的释放及细胞凋亡,可能促进肝脏炎症、肝纤维化的进展。     

苦参碱脂质体抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的评价苦参碱脂质体的体外抗乙型肝炎病毒(HBV)作用。方法通过苦参碱脂质体、苦参碱作用于体外培养的2.2.15细胞,观察和比较二者对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响及药物的细胞毒性,初步评价苦参碱脂质体的抗HBV作用。结果苦参碱脂质体、苦参碱作用于2.2.15细胞11 d后,对细胞的半数毒性浓度(TC50)分别为7.29mg/ml和1.33rage/ml,对HBsAg和HBeAg抑制的半数有效浓度(IC50)分别为0.078 mg/ml、3.35mg/ml、<0.078mg/ml和>10mg/ml,苦参碱脂质体对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)分别为93.46和2.17,高于苦参碱的治疗指数。结论苦参碱脂质体在体外细胞培养中对HBsAg和HBeAg的分泌有较好的抑制作用,可以提高苦参碱的抗HBV作用。     

华支睾吸虫severin蛋白体外对HBV复制的影响

目的探索华支睾吸虫severin(Cs severin)蛋白体外对乙肝患者外周血单核细胞(PBMC)乙肝病毒(HBV)复制水平的影响及对干扰素-α(IFN-α)清除HepG2.2.15细胞内HBV的影响。方法采用逆转录荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测不同浓度(0、60、80、100μg/mL)Cs severin作用乙肝患者PBMC 48 h后HBV DNA拷贝数;采用RTqPCR法检测不同浓度(0、60、80、100μg/mL)Cs severin作用HepG2.2.15细胞以及不同浓度(0、60、80、100μg/mL)Cs severin与IFN-α同时作用下的HBV DNA拷贝数;RT-qPCR检测HepG2.2.15细胞中STAT1 mRNA水平。结果 Cs severin单独作用时不影响PBMC的HBV DNA拷贝,组间差异无统计学意义(P0.05)。在HepG2.2.15细胞中,Cs severin的存在增强了IFN-α清除HBV的作用,且在60～100μg/mL范围内,随着Cs severin浓度的升高,HBV DNA拷贝数下降(P0.05)。STAT1 mRNA水平在Cs severin存在的情况下高于对照组,各组间差异有统计学意义(P0.05)。且随着Cs severin浓度的提高,STAT1 mRNA水平也随之上升。结论 Cs severin不能直接影响HBV复制水平,但可能通过影响STAT1基因的表达而提高IFN-α清除HBV的能力。     

天花粉提取物对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

目的:探讨天花粉水提取物、醇提取物对HepG2.2.15细胞的增殖及培养细胞上清中HBsAg与HBeAg表达的影响。方法:用MTT方法检测HepG2.2.15细胞的存活率,以酶联免疫法(ELISA)检测HepG2.2.15细胞上清液HBsAg和HBeAg的表达量。结果:天花粉水提取物和醇提取物处理HepG2.2.15细胞后HBsAg和HBeAg的表达均呈时间依赖性和浓度依赖性抑制,但天花粉水提物的治疗指数明显优于醇提物。结论:天花粉水提物较醇提物有更好的抗HBV活性。     

环孢素和他克莫司在体外对乙型肝炎病毒复制影响的对比研究

目的比较分析环孢素和他克莫司(FK506)在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法采用HBV DNA永久转染人肝癌细胞系HepG2.2.15细胞为体外实验模型,经四甲基偶氮唑蓝(MTT)试验确定环孢素及FK506对HepG2.2.15细胞生长无抑制作用的药物安全浓度后,将不同安全浓度的环孢素(0.6~20.0μg/ml)或FK506(5~100ng/ml)作用于该细胞系,每24小时换相应浓度新鲜含药培养基,药物作用4d后收集培养上清液和培养细胞待测。采用酶联免疫吸附试验检测上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)水平,采用狭缝印迹杂交法半定量分析细胞内HBV DNA水平,综合评价环孢素和FK506对HBV病毒复制的影响。结果MTT结果显示环孢素的药物作用安全浓度为0~40.0μg/ml,FK506的安全浓度为0~400ng/ml。在安全浓度范围内,随着环孢素作用浓度的增加,其对HBsAg和HBeAg的抑制率逐渐上升,细胞内HBV DNA复制水平下降;当1.3、2.5及5.0μg/ml环孢素作用4d时,对HBsAg的抑制率分别为16.5%±9.4%、21.5%±8.9%和33.1%±5.3%,对HBeAg的抑制率分别为7.8%±2.2%、11.0%±2.3%和20.8%±1.5%,HBV DNA的表达量仅为对照组的56.1%±16.5%、41.7%±10.9%和39.5%±9.5%。在安全浓度范围内,FK506对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的表达分泌,以及细胞内HBV DNA复制无明显抑制作用。结论环孢素在体外能呈剂量依赖性地抑制HBV复制;而FK506则无此作用。     

Adefovir抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的在体外细胞培养研究中,观察Adefovir抗HBV的作用.方法以乙型肝炎病毒(HBV)DNA转染的细胞株2.2.15细胞为靶细胞,给药后通过检测细胞培养液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA,对Adefovir抗HBV效果进行评价.在2.2.15细胞培养基中分别加入不同浓度的药物,培养数天后检测上清液中HBsAg和HBeAg滴度,细胞DNA抽提液检测HBV DNA;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法检测药物对细胞的毒性.结果 Adefovir加入细胞培养12d,最大无毒浓度为20μg/ml,对HBsAg抑制率为52.44%,对HBeAg抑制率为54.87%,对HBV DNA抑制率为45.68%,并有剂量依赖效应.结论 Adefovir在体外细胞培养的实验中有抗HBV病毒作用.     

siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究

目的:观察针对HBV X的siRNA表达载体pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物对HepG2.2.15细胞转染效果及其对HBVM表达的影响。方法:以pGenesil-siAFP表达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组,用不同配比浓度pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜下观察并计算转染阳性细胞百分率,筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后24h、48h、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中HBsAg和HBeAg。结果:pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物8μL∶2.5μg剂量配比组的平均转染率达到了(55.1±4.3)%,且不影响细胞活性;转染后48h和72h后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg抑制作用显著(P<0.05)。结论:8μL:2.5μg剂量配比组的pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比,能有效抑制HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg。