Hyper-IL-6融合基因重组腺病毒的构建及其在肝细胞中的表达

目的 在扩增出融合基因Hyper-IL-6的基础上,构建重组腺病毒Ad-HIL-6.用Ad-HIL-6感染人肝细胞LO2,观察细胞内Hyper-IL-6 rnRNA和蛋白的表达情况.方法 将Hyper-IL-6克隆至穿梭质粒,线性化后与腺病毒骨架质粒在BJ5183细菌内同源重组,构建重组腺病毒质粒.线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,PCR进一步证实重组腺病毒的存在.RT-PCR检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6基因的表达情况,Western blot法检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6的蛋白表达情况.结果 酶切及PCR鉴定表明同源重组成功,重组腺病毒质粒转染293细胞后可见绿色荧光,感染293细胞得到大量病毒.重组腺病毒Ad-HIL-6能在LO2细胞中表达出Hyper-IL-6基因和蛋白,条带分另q为1600bp和60KD左右.结论 重组腺病毒AdHIL-6构建成功,为以后进行基因治疗奠定基础.     

人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的:利用HEK293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素(canstatin)重组腺病毒载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法:PCR法扩增cansta-tin全长基因,克隆至pGEM-T载体,经酶切和测序证实后,亚克隆到穿梭质粒pAdS-CMV中,获得穿梭质粒pAdS-CMV/canstatin.用PasI酶单独酶切穿梭质粒pad5-CMV/canstatin和腺病毒E3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体,采用标准的磷酸钙方法共转染HEK293细胞.7～10 d后收获细胞裂解物,在HEK293细胞中扩增,病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,分光光度计检测重组病毒滴度.结果:测序证实pEGM-T/canstatin基因片段与GenBank公布的can-statin基因序列一致.重组腺病毒质粒转染293细胞后24 h观察到绿色荧光,病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为2.0×1015pt/L).结论:成功构建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒,为研究该基因在肿瘤治疗中的作用奠定了基础.     

人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用AdEasy系统构建人乳头瘤-16(HPV-16)E6 E7基因重组腺病毒,并通过Western Blot方法检测E6E7蛋白的表达.方法:将质粒pET-32a( )-E6E7扩增、酶切获得E6E7片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV的巨细胞病毒(CMV)启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-E6E7,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-E6E7,经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒Ad-E6E7;用包装后的病毒上清再次感染293细胞,提取细胞中的蛋白,通过Western Blot方法检测E6E7蛋白的表达.结果:连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAd-E6E7;经人胚肾293细胞包装,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)明显表达,氯化铯梯度离心纯化最终获得6.9×1010 pfu/L滴度的重组病毒;用该滴度的Ad-E6E7重新感染人胚肾293细胞3 d后,提取细胞蛋白,Western Blot检测,E6E7有明显表达.结论:利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6E7的重组腺病毒Ad E6E7.     

SHP-1基因重组腺病毒的构建与表达

目的 构建并鉴定人蛋白酪氨酸磷酸酶基因(SHP-1)重组腺病毒Ad-SHP1.方法 将人SHP-1 cDNA克隆于穿梭质粒pAdTrack-CMV,PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得带有SHP-1基因的重组腺病毒质粒pAd-SHP1,经PacⅠ线性化后通过Lipofectamine2000转染HEK293包装细胞,观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况.收获重组腺病毒,经PCR和Western Blotting鉴定后,扩增并纯化重组腺病毒,测定病毒滴度.结果 经测序、酶切电泳和感染后蛋白表达检测均表明成功构建重组腺病毒Ad-SHP1;病毒滴度为1.58×1010 pfu/mL.结论 成功构建带有人SHP-1 cDNA的重组腺病毒,为进一步研究结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤发生机制及肿瘤的基因治疗奠定了基础.     

HEK293T细胞扩增重组腺病毒研究

目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒,病毒滴度为5×10^6PFU/mL,扩增后的腺病毒可以感染体外培养的心肌细胞和成纤维细胞。结论HEK293T细胞可有效扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。     

小鼠雌激素受体α基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建C57BL/6小鼠雌激素受体α（Esr1）重组腺病毒表达载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠卵巢细胞扩增目的Esr1 CDS区基因片段,至pMD19-TSimple载体后测序鉴定.亚克隆Esr1CDS区基因片段至腺病毒穿梭质粒pDNR-CMV,再与骨架质粒pLP-Adeno-X-CMV在感受态大肠杆菌ElectroMAXTMDH10BTMCells中进行同源重组获得腺病毒载体质粒Adeno-Esr1,PacI酶切线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,测定感染性滴度,获得重组腺病毒Ad-Esr1.将病毒感染HEK293细胞,Western Blot检测Esr1蛋白表达.结果：测序证实提取的Esr1 CDS区基因序列完全正确;测序及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;感染性滴度为6.4×1013（pfu/L）,Western Blot检测Ad-Esr1感染的HEK293细胞能表达Esr1蛋白,而未感染的HEK293细胞蛋白不表达.结论：成功构建了C57BL/6小鼠Esr1基因重组腺病毒载体,为进一步研究Esr1在神经系统中生物学功能及对神经系统疾病的基因治疗奠定了基础.     

endostatin基因重组腺病毒的构建及在人肺腺癌细胞的表达

目的 利用AdEasy系统构建鼠内皮抑素(ES)基因重组腺病毒Ad.ES,并观察其在人肺腺癌细胞SPCA-1的表达.方法 采用酶切、连接和转化等方法,将质粒pcDNA3.ES中的ES片段插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV.ES,经Pme Ⅰ酶切线性化后与含腺病毒基因骨架的质粒载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内进行同源重组得到腺病毒质粒pAd.ES,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后,转染人胚肾293细胞包装成腺病毒颗粒Ad.ES,将病毒上清反复感染293细胞获得高滴度病毒,应用氯化铯(CsCl)梯度离心的方法纯化病毒,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白(GFP)标签测定重组腺病毒的功能滴度.用2 MOI重组腺病毒Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h,流式细胞仪检测GFP表达阳性率,ELISA法测定细胞培养上清液中ES的含量.结果 双酶切证实重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV.ES质粒构建正确,卡那霉素抗性筛选和Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d,约20%的细胞表达GEP,回收病毒重复感染293细胞,CsCl梯度离心纯化最终获得约5.6×1010TU/mL滴度的重组病毒.Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h后,细胞GFP阳性率为93%,细胞培养上清液中ES的含量较Ad.GFP感染组和阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论 应用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和ES的重组腺病毒,Ad.ES体外感染人肺腺癌细胞SPCA-1可显著提高ES表达,为进一步研究抗血管生成治疗肺癌奠定了基础.     

编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体.为进一步研究其蛋白功能提供工具.方法:穿梭质粒pAdTrack-CMV-PGC1α线性化后与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183菌中完成同源重组,筛选并提取重组正确的腺病毒质粒,PacI线性化,脂质体转染293细胞包装出成熟的具有感染活力的腺病毒颗粒,TCID50法测定病毒滴度,Western bloting检测PGC1α蛋白在293细胞的表达.结果:测序及酶切鉴定表明目的基因正确插人穿梭质粒,读码框未发生移位.重组腺病毒扩增后滴度约3×1010TCID50/ml,能在293细胞中表达PGC1α蛋白.结论:利用细菌内同源重组的方法成功构建了编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体,并观察到其蛋白表达.     

促血管生成素-2过表达重组腺病毒载体的构建

目的 构建小鼠促血管生成素-2(Ang-2)基因过表达重组腺病毒载体.方法 化学合成小鼠Ang-2编码序列,经PCR扩增、鉴定后连接至穿梭质粒.将含目的基因的重组质粒转化DH5α感受态细胞,所得阳性转化子经电泳分析并测序鉴定.将携带目的基因的穿梭质粒与辅助包装质粒共转染人胚肾细胞系HEK293细胞,反复冻融获取重组腺病毒,终点稀释法测定病毒滴度,重组腺病毒转染HEK293细胞并提取蛋白,采用免疫印迹法分析Ang-2蛋白的表达.结果 PCR产物电泳分析可见大小约1.5 kp的特征性条带,基因序列显示测序结果与GenBank提供的Ang-2序列一致,经 HEK293细胞包装后腺病毒滴度为1×108.8 pfu/ml,免疫印迹法分析可见大小57 kD特征性条带,即重组腺病毒可成功表达Ang-2蛋白.结论 Ang-2基因重组腺病毒载体可成功构建.     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的 利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒.方法 从pcDNA3-DeltaNp73α-HA中酶切出DeltaNp73α基因,并插入pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒;pAdTrack-CMV-DeltaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli.BJ5183菌株内同源重组.筛选正确的重组质粒,PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒;并在293T细胞中反复扩增;增强离心法转染树突状细胞,Western blot检测目的蛋白的表达.结果 经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒;Western blot检测出预期相对分子质量为67×103的特异条带.结论 成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组病毒.     

G6PD和G6PD/6PGD在全自动生化分析仪上检测的实验研究

目的在全自动生化分析仪上，应用速率法检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的活性和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）／6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）比值，并建立相应参考范围。方法在7600全自动生化分析仪上采用速率法对82例健康的全血样本进行总G6PD和6PGD检测。结果总G6PD、6PGD、G6PD和G6PD／6PGD的参考范围分别为17．86±4．84、11．45±3．06、6．41±2．96和0．56±0．24。结论应用全自动生化分析仪检测G6PD和G6PD／6PGD，与传统手工法相比，快捷、准确、简便，又能减少试剂用量，降低成本，适用人群的大规模的筛查。     

天疱疮对IL—6与TNF—α血清含量的影响

目的：探讨白细胞介素－６（ＩＬ－６）、肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α）及细胞免疫在天疱疮发病机理中的作用,以及其血清浓度与病情的关系。方法：用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测了２６例建党寻常型天疱疮（ＰＶ）和１４例红斑型天疱疮（ＰＥ）治疗前以及８例皮损损消退后血清ＩＬ－６与ＴＮＦ－α水平。结果：天疱疮患者治疗前血清中ＩＬ－６与ＴＮＦ－α含量显著高于对照组（均Ｐ〈０．０１）;两种细胞因子血浓度均与皮损面积呈     

6β—乙酰氧基去甲托烷对家兔瞳孔直径的影响

目的：通过实验了解不同旋光结构的6β－乙酰氧基去甲托烷（6β－AN）对家兔瞳孔直径的影响,为其临床治疗青光眼提供有效的光学活性结构。方法：测量兔眼瞳孔直径的变化,确定6β－AN具有活性的旋光形式。结果：左旋6β－AN（L＝6β－AN）滴眼后有明显的缩瞳作用,且随浓度强度和持续时间都增加,右旋6β－AN（d-6β－AN）滴眼基本无缩瞳作用。结论：L－6β－AN有缩瞳作用,d-6β-AN无缩瞳作用。     

浅论IPv6

IPv6 (Internet Protocol Version 6)是第六版互联网协议,它是由IETF(The Internet Engineering Task Force)制定.IPv6的出现旨在解决IPv4的缺陷.     

IL-6及其mIL-6R、sIL-6R在子宫内膜异位症患者腹腔液中的表达及意义

目的 探讨子宫内膜异位症（内异症）患者腹腔液白细胞介素6（IL-6）及其膜结合受体（mIL-6R）、可溶性受体（sIL-6R）在内异症发病机制中的意义.方法 47例经腹腔镜手术的内异症患者根据r-AFS分期分为A组（Ⅰ～Ⅱ期：19例）和B组Ⅲ～Ⅳ期：28例）,以22例同期腹腔镜手术的卵巢良性囊肿、子宫畸形患者为对照组,CD126-PE荧光抗体标记mIL-6R,流式细胞法检测腹腔液中CD126＋细胞的表达;同时应用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测腹腔液中IL-6及sIL-6R的含量.结果 A组和B组腹腔液中IL-6及mIL-6R的表达显著高于对照组（均P〈0.05）,两者的升高保持一致性,但无明显的直线相关关系,而B组患者腹腔液中sIL-6R含量显著高于A组和对照组（均P〈0.05）.结论 内异症患者腹腔液中升高的IL-6可能首先通过与同样表达增强的mIL-6R结合而影响疾病发生与发展;同时内异症患者腹腔液sIL-6R含量显著升高,协同参与了内异症的发展,并且可能与疾病的严重程度相关;而内异症患者腹腔液中大量mIL-6R的水解脱落可能是显著升高的sIL-6R主要的产生来源.     

反义IL-6寡核苷酸对实验性系膜增生性肾炎IL-6、IL-6mRNA表达的影响

[目的]观察反义IL-6寡核苷酸经左肾动脉注入系膜增殖性肾小球肾炎SD大鼠后对肾小球系膜区IL-6 mRNA及蛋白水平的影响。[方法]30只SD大鼠接受葡萄球菌内毒素静脉注射、牛血清白蛋白隔日口服、完全弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂皮下注射,并加做肝左叶切除术,制作系膜增生性肾小球肾炎动物模型。经FAM标记的反义寡核苷酸肾小球定位后,将IL-6反义、正义、及错义寡核苷酸由左肾动脉注入肾脏,并用右肾作对照,分别作常规组织病理,免疫组织化学及原位杂交检测。[结果]FAM标记的IL-6反义寡核苷酸经左肾动脉注入后1h,系膜区可检测到少量表达,6 h后肾系膜区表达明显增加。反义寡核苷酸治疗组的SD大鼠IL-6。IL-6 mRNA表达被显著抑制(P<0.01),但IL-6正义及错义寡核苷酸对IL-6、IL-6 mRNA表达无明显影响(P>0.05)。3组蛋白尿及病理改变均无显著差异(P>0.05)。[结论]脂质体介导的反义寡核苷酸(IL-6)能在肾小球表达。IL-6反义寡核苷酸治疗显著抑制系膜增生性肾炎SD大鼠IL-6、IL-6 mRNA表达,但IL-6正义、及错义寡核苷酸无此作用。     

HPLC法测定维生素B6乳膏中维生素B6的含量

目的 建立高效液相色谱法测定维生素B6乳膏中维生素B6的含量.方法 采用Purospher STAR RP-18e色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）;流动相为0.04％戊烷磺酸钠溶液（用冰醋酸调节pH值至3.0）-甲醇（85：15）;柱温为30℃;流速为1.0 mL·min^-1;检测波长为291 nm.结果 维生素B6在0.021 6～0.216 mg·mL^-1（r=0.999 8）的浓度范围内呈良好的线性关系;维生素B6的平均加样回收率为98.57％ （RSD =0.72％）.结论 该方法简便、准确,结果稳定,可为维生素B6乳膏的质量评价提供依据.