人胰岛素样生长因子前体基因的重组、表达及其蛋白纯化

目的：构建含有人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor-1，hIGF-1）前体编码全长cDNA的重组载体，使其在E-coli BL21（DE3）中表达，并对此表达菌株所表达的重组蛋白进行纯化，同时探讨其抗原性及应用价值。方法：采用PCR法，扩增编码hIGF-1前体cDNA的片段，通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a（＋）／hIGF-1重组载体，然后将其转化入BL21（DE3）中，经IPrG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化，并用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果：重组质粒pET32a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。BL21（DE3）表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示．其表达量占细菌总蛋白量的25％左右．该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90％以上。Western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带，表明此重组蛋白具有免疫学特异性。结论：pET32a（＋）／hIGF-1重组载体构建成功，并能够高效表达。     

大鼠肝再生增强因子编码区的cDNA克隆和原核表达

目的：克隆大鼠肝再生增强因子（ＡＬＲ）编码区ｃＤＮＡ并进行原核表达。方法：提取新生大鼠肝脏总ＲＮＡ为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，再以我们设计的ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增获取大鼠肝再生增强因子编码区双链ｃＤＮＡ；以基因重组技术构建大鼠ＡＬＲ的原核表达质粒，然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌内以ＩＰＴＧ诱导表达。结果：成功克隆出大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ，其序列与以前报道的完全一致；构建的大鼠ＡＬＲ原核表达重组质粒在大肠杆菌内高效表达ｒＡＬＲ融合蛋白，其表达量占菌体蛋白３０％。结论：大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ的克隆及其在大肠杆菌的高效表达为ＡＬＲ的深入研究奠定了基础。     

血管内皮生长因子在大肠杆菌中表达?提纯及功能测定

目的:利用细菌表达系统合成大量重组血管内皮生长因子(VEGF)蛋白.方法:将VEGF165 cDNA克隆于表达载体PET-32a( )后转染BL-21株表达重组VEGF蛋白,用分离His蛋白的层析柱提纯重组VEGF蛋白.结果:重组VEGF蛋白经氨基酸序列测定证实.Western blot测定发现His蛋白.功能测定发现重组VEGF蛋白可阻断细胞表面Neuropilin-1的表达.结论:上述表达系统制备大量具有生物活性的重组VEGF蛋白     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1) 基因的克隆及原核表达

目的克隆十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因并在大肠杆菌中表达。方法运用3′RACE及RT-PCR技术分别扩增Ad-FAR-1 cDNA部分片段,获得序列经拼接后利用在线BLAST程序检索GenBank中相似的核酸序列及推导的氨基酸序列;设计引物,将Ad-FAR-1成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,构建重组表达质粒并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆到Ad-FAR-1全长cDNA序列并构建了pET32a/Ad-FAR-1原核表达重组质粒,Ad-FAR-1融合蛋白在大肠中得到了高效表达。结论成功获得并表达了十二指肠钩虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白(Ad-FAR-1)基因,为进一步研究该蛋白的特性与功能奠定了基础。     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达与纯化

目的：表达和纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC，研究福氏志贺菌的致病机制。方法：将含有ipaC基因的pET32a-i-paC表达质粒载体转化大肠杆菌BL21（λDE3），在异丙基硫代－β－D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达，对诱导后的表达产物进行SDS－PAGE鉴定，并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统来纯化目的蛋白。结果：诱导后的表达产物经SDS－PAGE发现有一相对分子质量约为63000的条带，其含量约占总蛋白量的11％，以350mmol/L咪唑洗脱液洗脱，目的蛋白纯度可达90％以上，结论：pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后，可稳定，高效地表达目的蛋白，QIA－expressionistTM蛋白纯化系统是一种简便，高效的纯化系统，可获得高纯度的目的蛋白。     

人脂联素球状结构域的表达、纯化和功能鉴定

目的表达和纯化人脂联素（adiponectin,APN）球状结构域并观察其生物学活性.方法用PCR方法复制人脂联素球状结构域（globular domain of adiponectin,gAPN）的cDNA,并克隆于pET28a（＋）原核表达载体中.将重组表达质粒pET28a（＋）-gAPN转化大肠埃希菌BL21（DE3）,37℃培养至A600达到0.6时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白的表达.细菌经超声破菌,得到粗提的包涵体洗涤变性后经镍柱亲和层析柱一步纯化,获得纯化的gAPN重组蛋白,复性后冻干保存.然后,用链佐星（streptozocin,STZ）诱导的小鼠高血糖模型检测其生物活性.结果IPTG诱导后有Mr约为17 000大小的目的蛋白表达,免疫印迹结果进一步表明,其具有人gAPN的抗原性.表达蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%以上,表达产物经变性、纯化、复性,可获得纯度90%以上的目的蛋白.该重组蛋白能够降低STZ诱导的小鼠高血糖模型的血糖水平.结论在大肠埃希菌BL21（DE3）中成功表达了人gAPN蛋白,经变性、纯化、复性后得到具有生物学活性的蛋白.     

人幽门螺杆菌26 000外膜蛋白与热休克蛋白双价疫苗的构建和表达及抗原性研究

目的构建含人幽门螺杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)和26 000外膜蛋白(OMP)编码基因的重组载体,进行核苷酸序列分析,并在大肠杆菌BL21中表达,研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础.方法利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中,扩增HspA编码基因片段,将目的基因HspA与载体pET32a(+)经kpnⅠ、BamH I 双酶切后,进行连接、测序;同时将重组载体pET32a(+)/HspA和pET32a(+)/Omp26分别经Hind Ⅲ、BamH I 双酶切, 通过凝胶电泳回收pET32a(+)/HspA和26 000 OMP DNA片段,经T4连接酶将HspA和26 000 OMP编码基因通过酶切粘端进行连接,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体,并在大肠杆菌BL21(DE30)中表达,表达产物经纯化后,以western 印迹法检测其抗原性.结果经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp HspA和26 000外膜蛋白编码基因,由951bp组成,与GenBank报道的相比较,有1.15%的bp发生变异,1.26%的氨基酸残基改变;经SDS-PAGE分析发现,融合基因表达的蛋白相对分子质量(Mr)为59×103 ,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为20×103,可溶性表达产物占全菌总蛋白的19.96 %;重组蛋白经含Ni2+琼脂糖树脂纯化后,其纯度达95%以上;western 印迹法检测显示,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗26 000 OMP单克隆抗体所识别,具有良好的抗原性.结论成功地克隆并融合表达了Hp HspA和26 000 OMP,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制和快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的基础.     

重组人胶原蛋白肽在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建含有胶原蛋白基因的原核表达载体pET32a-CP6,并转入大肠杆菌BL21 (DE3)中进行高效表达,为获得大量可溶的胶原蛋白肽提供可靠依据.方法:将重组表达载体pET32a-CP6转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG为诱导剂,对温度、接种量、诱导时机、IPTG诱导浓度等各种发酵参数进行优化,筛选高效表达的发...     

ULBP3胞外段分子伴侣10融合蛋白的构建与表达

[目的] 研究ULBP3基因的功能,构建、表达ULBP3胞外段分子伴侣10重组融合蛋白。[方法] 将ULBP3胞外段cDNA连接在重组原核表达质粒pET28a-chaperonin 10中chaperonin 10基因的下游,构建chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,Western blot鉴定。[结果] 酶切鉴定证实,chaperonin10-ULBP3融合基因的pET28a原核表达载体构建正确,该原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经筛选获得的阳性重组菌稳定表达chaperonin10-ULBP3重组融合蛋白。[结论] 成功表达了ULBP3胞外段重组融合蛋白,可进一步用于ULBP3功能实验研究。     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达,在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的 :HIV- 1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法 :1PCR法扩增的 HIV-1p17基因片段克隆至 p ET2 8c质粒 ;2重组质粒分别在大肠杆菌 BL 2 1、BL 2 1(DE3)、BL 2 1(DE3) plys S及 HMS174 (DE3)中表达 ;3用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白 ;4用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果 :重组质粒在 BL (DE3)中表达量最高 ,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32 % ,纯化后其纯度达 95% ,纯化蛋白可与 p17Mc Ab和 HIV- 1阳性血清发生特异反应。结论 :带有HIV- 1p17片段的重组质粒 p ET2 8c在大肠杆菌 BL2 1(DE3)中获得高效表达 ,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究 ;用 Ni- NTA金属树脂层析法纯化蛋白 ,方法简便 ,蛋白丢失少 ,纯度高 ;纯化的重组蛋白 HIV- 1p17可用来临床早期诊断 HIV- 1感染者 ,同时可预测患者的临床进程。     

SARS冠状病毒PUMC_2株N蛋白cDNA的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化SARS冠状病毒N蛋白。方法用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET32a表达载体,转化E.coliBL21进行原核表达并纯化出SARS冠状病毒N蛋白。结果实现了SARS冠状病毒N蛋白的表达及纯化。结论用基因重组方法表达的SARS冠状病毒N蛋白可为其进一步功能研究提供条件。     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

人CD81细胞外区大环原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:构建人CD81-LEL基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达. 方法:通过PCR扩增得到CD81-LEL基因编码区片段,与pMD18-T载体连接,经序列测定后,再将该扩增片段亚克隆入原核表达载体pET32a( )中.酶切鉴定正确的表达载体pET32a-CD81-LEL转化表达菌BL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白. 结果:成功构建了原核表达载体pET32a-CD81-LEL;SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达且呈可溶性状态,Western-blot显示目的蛋白正确表达,并用镍离子亲和层析法获得纯化的重组蛋白. 结论:CD81-LEL可以在大肠杆菌中表达,为进一步研究CD81与丙型肝炎病毒(HCV)包膜糖蛋白E2的结合提供了有用的研究资料.     

重组Trx-ApoO融合蛋白的构建与表达

目的:构建人载脂蛋白O (apolipoprotein O, ApoO)表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原Trx-ApoO融合蛋白.方法:以人类肝脏cDNA文库为模板,聚合酶链反应(PCR) 法扩增ApoO DNA,将测序正确的目的基因片段插入质粒pET-32a (+)相应位点构建重组质粒并转化E.coli B...     

Soluble expression and characterization of the immunoreactive multiepitope antigen of Toxoplasma gondii in E.coli]

OBJECTIVE: To obtain soluble expression product of immunoreactive recombinant multiepitope antigen of Toxoplasma gondii from E.coli. METHODS: The gene encoding the multiple epitopes (MEG) of Toxoplasma gondii was amplified by PCR from the original plasmid containing MEG gene and cloned into the prokaryotic soluble expression vector pET32a. After identification by enzyme digestion and sequencing, the positive recombinant plasmid pET32a-MEG was transformed into BL21(DE3), which was induced with IPTG for expression of the target antigen. The relative molecular mass, solubility and antigenicity of the expression products were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. RESULTS: The recombinant expression plasmid pET32a-MEG was successfully constructed and the highly efficient expression of the antigen was achieved after IPTG induction of E.coli. Improvement of the induction condition increased the expression product which accounted for about 28% of the total bacterial protein. The target protein, with good solubility and a relative molecular mass of about 31 000, was purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and could be well recognized by mouse and rabbit antisera derived by infection of the animals with Toxoplasma gondii B36 and RH, respectively. CONCLUSION: The recombinant multiepitope antigen has good antigenicity and potential value in diagnosis and vaccine development of toxoplasmosis.     

人核心蛋白聚糖的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 在大肠杆菌中高效表达人核心蛋白聚糖,并建立适当的纯化方法,制备重组蛋白.方法 根据GenBank中人核心蛋白聚糖的序列设计特异性引物,从人肝cDNA文库中PCR扩增核心蛋白聚糖的编码序列,克隆到原核表达载体pET42a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,获得以高效表达的目的 重组蛋白;用SDS-PAGE和质谱鉴定重组蛋白.结果 重组蛋白主要以包涵体形式表达,SDS-PAGE显示其分子质量与预期结果相符;经质谱鉴定,表达的重组蛋白为人核心蛋白聚糖.结论 成功地在大肠杆菌中高效表达了人核心蛋白聚糖,并纯化得到人核心蛋白聚糖蛋白,经鉴定,纯化所得到的蛋白为人核心蛋白聚糖.     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

一种缺失核定位信号区的hbFGF的表达及纯化

目的：为了研究缺失核定位信号区的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)独特的转运机制，在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达和纯化了缺失核定位信号区的hbFGF。方法：将PCR扩增得到的hbFGF cDNA片断克隆到表达载体pET3c中，重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，通过离子交换和肝素亲和层析从菌体上清中纯化目标蛋白，MTT法检测促分裂活性。结果：hbFGF的表达量约为全菌体蛋白的20％，纯化的缺失核定位信号区的hbFGF的促分裂活性与缺失核定位信号区的hbFGF标准品相当。结论：BL21(DE3)／pET3c表达系统能高效表达缺失核定位信号区的hbFGF，纯化得到的hbFGF可用于进一步的研究。