顺铂抑制IL-8诱导人卵巢癌SKOV-3细胞的迁移作用及相关机制的研究

目的 观察外源性人白细胞介素-8 （IL-8）对人卵巢癌SKOV-3细胞迁移的影响,及顺铂对它的干预作用,初步探讨顺铂抑制细胞迁移的机制.方法 顺铂处理SKOV-3细胞,MTT法确定顺铂使用的最佳作用浓度;Transwell法观察顺铂对IL-8诱导SKOV-3细胞迁移的干预作用;ELISA法检测顺铂分泌IL-8情况;Western blot法检测NF-κB蛋白表达水平.结果 MTT结果显示：与对照组相比,顺铂浓度为100μg/ml对细胞增殖有显著抑制作用（P＜0.05）.浓度区间在200～400μg/ml的顺铂对细胞的增殖也有抑制作用,该范围内对细胞的生长抑制率无统计学差异（P＞0.05）.浓度为100μg/ml的顺铂,分别作用于SKOV-3细胞24 h、48 h、72 h,各时间组比较无统计学差异（P＞0.05）.IL-8（100 ng/L）处理细胞后,SKOV-3细胞的迁移能力增强,顺铂（100 μg/ml）具有抑制IL-8诱导的SKOV-3细胞迁移的作用,随着浓度的增高,迁移的细胞数由241.67减少到155.99,差异有统计学意义（P＜0.05）.顺铂刺激细胞后,与空白对照组相比,NF-κB蛋白表达水平降低（64.04±4.6）.结论 IL-8具有促进人卵巢癌SKOV-3细胞迁移的作用,顺铂可能是通过NF-κB细胞信号通路对卵巢癌细胞的迁移起抑制作用.     

细胞因子诱导的杀伤细胞对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应

目的探讨多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应。方法用健康人外周血单核细胞（PBMC）在体外用多种细胞因子诱导成CIK细胞,流式细胞术分析其表型特征,将培养14d的CIK细胞和对数生长期的SKOV-3细胞按不同效靶比共培养,MTT法检测CIK细胞对SKOV-3细胞的杀伤效应;将CIK细胞培养液上清作用于对数生长期的SKOV-3细胞,于培养24及48h用流式细胞仪检测卵巢癌细胞的凋亡情况。结果CIK细胞体外培养14d,CD3^＋CD56^＋双阳性细胞数量达（31．6±5．5）％。CIK对SKOV-3的杀伤效应在效靶比为5：1时,24h及48h抑制率分别为（16．52±2．52）％和（24．20±5．59）％,当效靶比为40：1时,其24h及48h抑制率分别为（53．98±5．02）％和（74．74±6．87）％。CIK细胞对SKOV-3细胞的抑制率随着效靶比的提高及作用时间的延长而提高。SKOV-3与CIK细胞培养液上清共培养24h及48h后凋亡率分别为（12．30±1．47）％和（27．13±2．03）％。结论CIK细胞可通过诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用。     

YKL-40在卵巢癌细胞生长中的作用

目的探讨YKL-40在卵巢癌细胞生长中的作用。方法选取上皮性卵巢癌细胞SKOV-3,人恶性胶质瘤细胞U87作为阳性对照,采用Western blot检测两种细胞YKL-40表达;构建YKL-40过表达慢病毒感染SKOV-3细胞,同时选取阴性空载感染SKOV-3细胞作为对照,采用Transwell试验检测细胞迁移能力,CCK-8试验检测顺铂对细胞增殖的影响。结果SKOV-3细胞YKL-40蛋白表达量为(0.004±0.001),明显低于U87细胞(P0.05),可见SKOV-3细胞基本不表达YKL-40蛋白;YKL-40过表达组SKOV-3细胞迁移数为(270.31±25.60)个,明显高于对照组,差异比较有统计学意义(P0.05);在1μg/L、2.5μg/L、5μg/L顺铂下,YKL-40过表达组SKOV-3细胞抑制率分别为(3.21±1.01)%、(17.20±2.78)%和(45.59±3.89)%,明显低于对照组(P0.05)。结论卵巢癌SKOV-3细胞不表达YKL-40蛋白,而YKL-40可增强SKOV-3细胞迁移能力,降低SKOV-3细胞铂类药物的敏感性,值得进一步研究。     

白藜芦醇对体外培养的人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV-3／DDP活性的影响

目的探讨白藜芦醇对体外培养的人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV-3／DDP活性的影响。方法采用四甲基偶氮蓝（MTT）法检测不同浓度（2．5、5、10、20、40、80μg／mL）白藜芦醇在不同作用时间（24、48、72、96h）对SKOV-3／DDP细胞体外增殖的影响。结果不同浓度的自藜芦醇组（2．5、5、10、20、40、80μg／mL）24、48、72、96h的增殖抑制率均显著高于对照组（P〈0．05或P〈0．01）,并且白藜芦醇对SKOV-3／DDP细胞的增殖抑制作用呈剂量-时间依赖性。结论自藜芦醇对SKOV-3／DDP细胞株的体外增殖有抑制作用,有望成为一种新的药物应用于卵巢癌的治疗。     

PC-3悬浮成球细胞中ABCG2表达及其对化学治疗耐药性的实验研究

目的：探讨人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3悬浮成球细胞中ATP结合盒膜转运蛋白G超家族成员2（ABCG2）的表达及其对化学治疗的耐药性。方法：体外无血清悬浮培养PC-3细胞,逆转录定量-PCR检测PC-3悬浮成球细胞中ABCG2 mRNA的表达,采用MTT法检测PC-3悬浮成球细胞对顺铂的耐药性,计算半数抑制浓度（IC50）,并与PC-3贴壁细胞作对比。结果：PC-3悬浮成球细胞可以在无血清培养条件下生存并形成悬浮细胞球,PC-3悬浮成球细胞中ABCG2 mRNA的相对表达水平是PC-3贴壁细胞的33．98倍（P〈0．05）,其IC50是PC-3贴壁细胞的4．26倍（P〈0．05）。结论：人PC-3悬浮成球细胞中ABCG2表达水平较高,该类细胞对化学治疗具有较强耐药性。     

硫化氢抑制顺铂致人骨髓间充质干细胞的损伤

背景：在使用顺铂进行化疗时,常因造血干细胞损伤造成严重的骨髓抑制,而目前临床上还没有一种有效的化疗细胞保护剂来减轻其不良反应。目的：探讨硫化氢对顺铂致人骨髓间充质干细胞损伤的保护作用。方法：应用硫氢化钠作为硫化氢的供体,用不同浓度的硫氢化钠与顺铂同时作用于人骨髓间充质干细胞48h后,甲氮甲唑蓝法（MTT）检测细胞存活率,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,Western blot检测蛋白的表达。结果与结论：MTT检测发现顺铂可降低骨髓间充质干细胞的存活率,硫氢化钠可呈浓度依赖性的对抗顺铂对人骨髓间充质干细胞生长的抑制作用,0.5,1mmol/L硫氢化钠与20mg/L顺铂共同作用人骨髓间充质干细胞48h后会引起NF-κB（p65）上调和IκB-α的下调,1mmol/L硫氢化钠与20mg/L顺铂在作用6h后磷酸化蛋白激酶1/2明显上调。结果提示,硫化氢可能通过蛋白激酶-NF-κB信号通路来抑制顺铂致人骨髓间充质干细胞的损伤作用。     

C-myc 参与β-Catenin 介导的肺腺癌 A549／DDP细胞的化疗耐药的实验研究

目的探讨C-myc与β-Catenin介导的肺腺癌A549/DDP的耐药相关性。方法 MTT细胞毒实验比较A549与A549/DDP细胞对顺铂的敏感性;Western blot检测在顺铂作用前、后β-catenin及C-myc在肺腺癌A549及A549/DDP中的蛋白表达及免疫荧光定位;流式细胞仪检测不同剂量的顺铂作用下两株细胞以及A549/DDP转染C-myc siRNA前后的凋亡和周期变化。结果 MTT细胞毒实验结果显示顺铂对A549和A549/DDP细胞的IC50值分别为（5.769±0.24）μmol/L和（28.373±0.96）μmol/L,与A549细胞比较． A549/DDP顺铂耐药4.92倍。 Western blot 结果显示β-Catenin 及C-myc蛋白在A549/DDP细胞的表达较A549高,顺铂作用48 h后A549细胞的β-catenin及C-myc表达较顺铂作用前下调（ P＝0.007）, A549/DDP细胞的β-catenin及C-myc表达较顺铂作用前上调（ P＝0.006）;免疫荧光定位结果显示顺铂作用48 h后A549及A549/DDP细胞的β-Catenin由膜/质/核表达转为质/核表达,C-myc表达由浆/核表达转为核表达。流式结果显示随着顺铂剂量的增加,细胞凋亡率成剂量依赖性增加。 A549/DDP中转染C-myc siRNA 48 h后引起细胞S期阻滞,G0/G1期细胞积聚,凋亡率增加（P＝0.013）,IC50值明显下降（P＝0.009）。结论β-catenin的下游靶基因C-myc在调节A549/DDP的耐药性中起到一定作用,C-myc siRNA可以提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。     

抑制葡萄糖调节蛋白78基因表达逆转卵巢癌顺铂耐药作用的实验研究

目的探讨以葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因为靶向的RNA干扰(RNAi)抑制GRP78基因的表达,对人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP的影响。方法以GRP78基因为靶向的pSilencerTM3.0-H1-GRP78 siRNA重组质粒的构建,脂质法转染至细胞中;RT-PCR及Western blot方法检测GRP78 mRNA及蛋白表达;Western blot方法检测CHOP蛋白表达;MTT法检测不同浓度顺铂作用下细胞存活率,计算IC50及耐药指数。结果 RT-PCR及Western blot检测转染GRP78 siRNA重组质粒24 h、48 h7、2 h均能明显抑制SKOV3/DDP细胞GRP78基因表达,其中48h抑制效果最为明显;抑制SKOV3/DDP细胞GRP78基因表达能上调CHOP蛋白表达;顺铂作用24h,SKOV3/DDP细胞的IC50(26.13μg/ml)是其亲本SKOV3细胞IC50(8.25μg/ml)的3.1倍;转染pSH1Si-GRP78重组质粒后SKOV3/DDP细胞IC50(11.62μg/ml)明显降低。结论转染GRP78 siRNA重组质粒有效抑制SKOV3/DDP细胞GRP78基因表达;抑制GRP78基因表达能逆转SKOV3/DDP细胞的顺铂耐药性。     

人骨肉瘤细胞系HOS肿瘤干细胞样细胞亚群的分离与鉴定

目的探索无血清培养基培养人骨肉瘤细胞系HOS细胞,筛选并鉴定人骨肉瘤细胞系HOS中肿瘤干细胞相关亚群。方法通过无血清悬浮培养初步富集骨肉瘤细HOS肿瘤干细胞,观察其形成肿瘤干细胞球过程中的细胞形态,并在有血清培养基中诱导其分化。各种浓度化疗药物顺铂(CDDP)和阿霉素(DXR)分别处理HOS悬浮细胞球与HOS贴壁细胞,MTT法检测两种细胞对化疗药敏感性。Real-time PCR检测HOS悬浮细胞球与HOS贴壁细胞干细胞相关基因ABCG2、Bmi1、Nanog、Oct3/4、Sox10、STAT3表达情况。将HOS悬浮细胞球与HOS贴壁细胞分别接种于BALB/c裸鼠,观察成瘤情况。结果人骨肉瘤细胞系HOS细胞能够在无血清培养基中存活、增殖并形成肿瘤干细胞球。HOS悬浮细胞球对于化疗药物的敏感性较HOS贴壁细胞高。Real-time PCR结果显示HOS悬浮细胞球较HOS贴壁细胞高表达肿瘤干细胞相关基因ABCG2、Bmi1、Nanog、Oct3/4、Sox10、STAT3。HOS悬浮细胞球体内成瘤能力较HOS贴壁细胞强。结论无血清悬浮培养可以初步富集人骨肉瘤细胞系HOS悬浮细胞球,且这些细胞具有肿瘤干细胞特性。     

沉默ATF5对卵巢癌裸鼠成瘤的影响

目的研究沉默人转录激活因子5（ATF5）后对卵巢癌SKOV-3细胞体外增殖、凋亡及体内成瘤的影响,探讨人类卵巢癌基因治疗的新途径。方法将慢病毒携带的小干扰RNA感染卵巢癌SKOV-3细胞（实验组）,空载体转染的卵巢癌SKOV-3细胞（空载体对照组）和卵巢癌SKOV-3细胞（空白对照组）进行对照,对比观察细胞的生长状态;MTT法检测细胞的增殖生长情况;罗氏凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况;分别于裸鼠皮下接种3组卵巢癌SKOV-3细胞,观察各组裸鼠的存活状态、种植瘤生长情况;RT-PCR检测瘤组织中ATF5mRNA的表达;Western-Blot方法检测瘤组织中ATF5蛋白的表达;苏木素-伊红染色（HE染色）观察瘤组织生物学形态变化。结果经转染ATF5基因的小干扰RNA后,在相同培养时间内3组细胞的增殖和生物学形态没有明显差异,但实验组细胞凋亡数量较其他两组明显增多。皮下接种成瘤后,3组裸鼠的成瘤率没有明显区别,实验组与空载体对照组和空白对照组相比,肿瘤成瘤时间晚,生长缓慢;移植瘤ATF5mRNA表达及蛋白表达降低;细胞分裂象明显减少,凋亡现象明显。结论沉默ATF5对人上皮性卵巢癌裸鼠移植瘤生长有抑制作用,这可能成为卵巢癌基因治疗的新靶点。     

沙利霉素逆转P-gp介导的肾癌ACHN细胞多药耐药的实验研究

目的探讨沙利霉素对肾癌ACHN细胞多药耐药的逆转及其机制。方法实验分为对照组、阿霉素组、沙利霉素组及阿霉素和沙利霉素联合用药组,药物作用24h后,CCK-8方法检测肾癌细胞的生长活性,免疫细胞化学法检测肾癌细胞P-糖蛋白（P-gp）的表达情况。结果 10μg/ml阿霉素对肾癌ACHN细胞的生长抑制率仅为4.758%。沙利霉素组对肾癌ACHN细胞生长抑制率呈剂量依赖性,并高于阿霉素组（P〈0.05）,其中以10μmol/L组抑制率最高（达17.555%）。联合用药组的生长抑制率高于沙利霉素组及阿霉素组（P〈0.05）,以10μmol/L沙利霉素＋10μg/ml阿霉素组的抑制率最高（达45.447%）。与阿霉素组比较,经沙利霉素处理过的肾癌ACHN细胞中的P-gp蛋白表达下降（P〈0.05）。结论沙利霉素增强了肾癌ACHN细胞对阿霉素的敏感性,耐药性逆转的机制之一可能与沙利霉素下调癌细胞中P-gp的表达有关。     

hTERT表达水平对乳腺癌干细胞体外生物学行为的影响

目的观察人端粒酶反转录酶反义寡核苷酸(h TERT ASODN)对乳腺癌干细胞生物学行为的影响。方法合成针对人端粒酶反转录酶(h TERT)的反义寡核苷酸,以脂质体转染的方法将其转染入乳腺癌干细胞,设为ASODN组,以正义序列转染作为阴性对照组,并设未处理对照组。RT-PCR和Western blot分别检测各组h TERT基因和蛋白表达。应用CCK8法检测转染对乳腺癌干细胞增殖的影响,Transwell小室法检测干细胞侵袭、迁移能力。结果 RT-PCR和Western blot检测结果显示,ASODN组h TERT基因相对表达量为0.40±0.03,低于阴性对照组(0.81±0.05)和未处理对照组(0.79±0.04),F=137.33,P<0.001;h TERT基因蛋白相对表达量为0.39±0.06,低于阴性对照组(0.87±0.04)和未处理对照组(0.90±0.02),F=59.29,P<0.001。CCK8结果显示,乳腺癌干细胞培养12、24、36、48和60 h,ASODN组细胞增殖能力明显低于阴性对照组和未处理对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell侵袭实验,ASODN组穿越Transwell小室的细胞数为8.40±0.36,低于阴性对照组(15.64±0.13)和未处理对照组(14.31±1.12),F=94.56,P<0.001。Transwell迁移实验,ASODN组穿越Transwell小室的细胞数为30.6±8.03,低于阴性对照组(51.40±5.66)和未处理对照组(53.11±6.34),F=20.11,P=0.002。结论 h TERT ASODN可显著抑制乳腺癌干细胞体外增殖、侵袭和迁移能力。     

血清一氧化氮检测在肺癌诊断中的临床意义

目的探讨血清中癌胚抗原（CEA）和一氧化氮（NO）水平在肺癌中的表达及其诊断价值。方法采集肺癌患者血清100例,良性肺病患者血清80例,并与80例健康人作比较。应用化学发光免疫分析法和硝酸还原酶法分别检测血清中的CEA和NO。结果肺癌患者血清中CEA和NO分别是（39．42±24．61）ng／mL、（123．30±25．21）μmol／L,明显高于良性肺病组（8．21±3．42）ng／mL、（99．12±21．61）μmol／L及健康对照组（7．31±4．30）ng／mL、（77．81±17．61）μmol／L,P均小于0．01。结论肺癌血清中CEA和NO水平显著升高,提示CEA与NO参与了肺癌的发生和发展,故CEA和NO检测是肺癌患者非常有用的辅助诊断指标。     

溶血磷脂酸与CA125在复发性卵巢癌中的价值分析

目的 分析血浆溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）及CA125在卵巢癌复发患者中的表达情况和监测价值.方法 选择2013年1月-12月广州市第一人民医院收治的32例上皮性卵巢癌复发患者,测定血浆LPA和CA125表达情况,检测同期28例上皮性卵巢癌治疗后完全缓解患者、30例初诊上皮性卵巢癌患者及30例正常女性的血浆LPA和CA125作为对照,分析LPA和CA125在卵巢癌复发患者中的敏感度和特异度.结果 上皮性卵巢癌复发组血浆LPA（9.52±4.64 mol/L）明显高于完全缓解患者组（2.02±1.94 mol/L）（t=7.96,P＜0.05）及正常人群组（1.91±2.21 mol/L）（t=8.15,P＜0.05）,与初诊患者组（9.19±2.47 mol/L）差异无统计学意义（t=0.35,P＞0.05）,上皮性卵巢癌复发组血浆CA125（75.42±10.66 U/ml）明显高于完全缓解患者组（11.42±9.67 U/ml） （t=28.830,P＜0.05）及正常人群组（10.45±6.42 U/ml）（t=24.220,P＜0.05）,与初诊患者组（63.29±132.32 U/ml）差异无统计学意义（69.29±7.32 U/ml）（t=2.622,P＞0.05）.采用LPA和CA125诊断上皮性卵巢癌复发的诊断价值有差异（χ^2=37.834,P=0.022）,其中LPA敏感度（93.8％）高于CA125（65.6％）,特异度无明显差异（χ^2=24.501,P=0.99）.结论 LPA水平对判断上皮性卵巢癌的复发有重要价值,可能成为监测上皮性卵巢癌复发的新方法.     

地塞米松对紫杉醇诱导人卵巢癌细胞株SKOV-3细胞凋亡的影响

目的：探讨地塞米松预处理对紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡的影响。方法：应用MTT比色法检测地塞米松对紫杉醇抑制细胞增殖的影响,TUNEL法形态学观察细胞凋亡,流式细胞仪PI单染测定地塞米松预处理对紫杉醇诱导人卵巢癌细胞株SKOV-3细胞凋亡及细胞周期的影响。结果：不同浓度地塞米松对紫杉醇抑制SKOV-3细胞增殖有不同程度的拮抗作用,TUNEL分析表明地塞米松预处理后能抑制紫杉醇诱导SKOV-3细胞凋亡,流式细胞仪PI单染法分析表明,用地塞米松预处理后再用紫杉醇组的细胞凋亡率为（5.55±0.53）%,而单用紫杉醇组细胞凋亡率为（13.90±1.62）%,地塞米松进行预处理组细胞凋亡率明显降低（P〈0.01）,且与细胞周期中G2/M期无关。结论：不同浓度地塞米松对紫杉醇抑制SKOV-3细胞增殖有不同程度的保护作用,地塞米松能够拮抗紫杉醇诱导人卵巢癌细胞株SKOV-3细胞凋亡,且与细胞周期中G2/M期无关。     

重组质粒pcEgr-hp53的构建及在A549和SKOV-3细胞中电离辐射诱导p53基因和蛋白的表达

目的构建重组质粒pcEgr-hp63,并探讨其在A549和SKOV-3细胞中的辐射诱导表达及抗癌作用。方法将野生型p53 cDNA全长插入pcDNA3．1质粒多克隆位点,用Egr-1启动子替代pcDNA3.1质粒CMV启动子,构建成pcEg-hp53重组质粒;通过脂质体介导转染法将重组质粒坶hp53和pcDNA3.1分别转染入A549和SKOV3细胞株,并经G418筛选稳定克隆并扩增培养。采用RT-PCR和流式细胞术的方法检测了不同剂量X-射线照射转染后的A549和SKOV-3细胞053基因转录水平和蛋白表达的变化。结果经限制性内切酶酶切鉴定,辐射诱导表达载体pcEg-hp63构建正确。与0Gy比较,A549-hp53和SKOV-3-hp53经0．5-5Gy照射后,p53mRNA水平增高;A549．hp53在2-5Gy后,p53蛋白表达显著增高（P〈0．01）,SKOV-3-hp63其蛋白表达随剂量（0．5-5Gy）增加而明显增加（P〈0．05-P〈0．01）。A549-hp53与A549-vect相同照射剂量组比较,其p53蛋白表达在0．5Gy照射后明显下降（P〈0．05）,2-5Gy照射后明显增高（P〈0．01）;SKOV-3-hp53与SKOV-3-vect相同照射剂量组比较,其蛋白表达在0Gy时增高,0.5-5Gy照射后明显增高（P〈0．01）。结论X-射线可激活早期反应生长因子Egr-1,无论肿瘤细胞p53基因状态如何,均可诱导其下游基因p53 mRNA及其p53蛋白表达增强。     

紫杉醇联合奈达铂治疗中晚期卵巢上皮性癌的疗效分析

目的观察紫杉醇分别联合奈达铂（NDP）及顺铂（DDP）方案对中晚期卵巢癌治疗的近期疗效及不良反应。方法将42例中晚期卵巢癌患者随机分为治疗组和对照组。治疗组：紫杉醇＋奈达铂;对照组：紫杉醇＋顺铂。分析两组的近期疗效及不良反应。结果治疗组与对照组的近期有效率分别为54．55％和49．00％,差异无统计学意义（P〉0．05）;治疗组白细胞减少的发生率（55．00％）和对照组（63．00％）,差异无统计学意义（P〉0．05）;治疗组血小板减少发生率（36．40％）高于对照组（25．00％）,但无显著性差异（P〉0．05）;治疗组胃肠道反应发生率（18．20％）低于对照组（85．00％）,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论奈达铂＋紫杉醇为中晚期卵巢癌的有效化疗方案。