RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因3个不同靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后,免疫细胞化学法（ICC）检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖情况。结果与对照组比较,构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性（F=18.64,q=4.293～4.925,P〈0.05）,而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性（q=0.631～0.126,P〉0.05）。转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调（F=68.39,q=13.71、14.37,P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（F=20.06～47.65,q=11.186、12.601,P〈0.01）。结论构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-sur-vivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖。     

RNA干扰survivin基因对HepG2细胞凋亡及化疗影响

目的探讨RNA干扰survivin基因对HepG2细胞凋亡及化疗敏感性的影响。方法构建针对HepG2细胞survivin基因的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-387。将HepG2细胞接种于6孔板中,分为空白对照组（不加药物）、阴性对照组（每孔加pshRNA-survivin-NC为3.2μg）、低浓度转染组（每孔加pshRNA-survivin-387为0.8μg）、中浓度转染组（每孔加pshRNA-survivin-387为1.6μg）、高浓度转染组（每孔加pshRNA-survivin-387为3.2μg）,作用48 h后收集细胞,流式细胞术检测各组细胞凋亡指数;将HepG2细胞接种于96孔板中,分为3组：空白对照组（不加药物）、阴性对照组（每孔加pshRNA-survivin-NC为0.2μg）、实验组（每孔加pshR-NA-survivin-387为0.2μg）,四甲基偶氮唑蓝法检测各组细胞分别与顺铂（2.0 mg/L）作用24、36、48、60 h后的增殖水平。结果各浓度转染组细胞的凋亡指数明显高于空白对照组和阴性对照组（F=228.87,q=10.45～38.21,P〈0.01）,高浓度转染组细胞凋亡指数高于低浓度转染组（q=23.99,P〈0.01）。顺铂对实验组细胞的细胞抑制率在24、36、48、60 h时明显高于空白对照组和阴性对照组（F=235.88～910.86,q=28.04～52.28,P〈0.01）。结论 pshRNA-survivin-387转染能诱导肝癌细胞的凋亡,增强肝癌细胞对顺铂化疗的敏感性。     

靶向survivin基因不同位点的siRNA对PC-3细胞增殖和凋亡的影响

目的观察靶向survivin基因不同位点的小干扰RNA（siRNA）对人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA表达的抑制作用以及对细胞增殖和凋亡的影响。方法根据survivin mRNA的结构特点,选取2个不同的作用位点,设计和构建负载survivin shRNA片段的2种重组质粒载体。以脂质体法转染PC-3细胞株,荧光显微镜下观察转染效率。实验分为survivin 1组、survivin 2组、阴性对照组和空白对照组。转染后24、48和72h,用半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞中survivin mRNA的表达,MTT法检测siRNA对PC-3细胞增殖的影响,流式细胞术检测凋亡率。结果与对照组相比,survivin 1组、survivin 2组对survivin mRNA的表达均能产生抑制效应,48h抑制率最高,survivin 1抑制率高,达52％。实验组均能抑制PC-3细胞的增殖,survivin 1抑制细胞增殖的能力强。转染48h后,细胞凋亡最明显,survivin 1组凋亡率高,达13．6％±1．8％。结论在RNAi研究巾,根据特定靶基因mRNA的结构特点来进行siRNA的设计和筛选,在前列腺癌的基因治疗中具有一定的实际应用价值。     

针对不同靶位点的siRNA对HepG2人肝肿瘤细胞株FOX03a表达的抑制作用

目的：探讨针对FOXO3a的小干扰RNA（siRNA）对HepG2 FOXO3a的表达、细胞增殖的抑制及细胞凋亡的作用。方法利用RNA干扰（RNAi）效应设计针对FOXO3a的不同siRNA,构建表达载体质粒并转染HepG2细胞系。RT-PCR和Western Blot分别检测FOXO3a mRNA及蛋白的表达,细胞生长实验和流式细胞观察转染前后细胞增殖及细胞凋亡的变化。另设一无意义RNA载体质粒为阴性对照。结果 P2、P3实验组,细胞核绿色荧光明显减淡,有细胞核的排出。特异性siRNA对FOXO3a mRNA及蛋白的表达具有抑制作用（P〈0.05）,细胞凋亡减少,增殖明显增加（P〈0.05）。结论抑制 FOXO3a 基因的表达能够减少HepG2细胞的凋亡,并增加细胞的增殖。FOXO3a有望成为治疗肝癌的有效的靶基因。     

β1整合素表达下调对人结肠癌细胞增殖和化疗敏感性影响

目的 观察β1整合素表达下调对人结肠癌HT-29细胞增殖和化疗敏感性的影响.方法 采用反义寡核苷酸（ASODN）技术转染HT-29细胞,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测β1整合素表达下调情况.MTT法检测HT-29细胞相对存活率.给予梯度浓度氟尿嘧啶（5-FU）,计算IC50.结果 实验组β1整合素条带吸光度积分（IAD）值/β-actin条带IAD值的比值及HT-29细胞的存活率与对照组相比显著降低（F=1 630.08,q=72.40,P〈0.01;t=4.37,P〈0.05）.5-FU＋ASODN组HT-29细胞对5-FU的IC50与5-FU组比较显著下降（t′=37.71,P〈0.05）.结论 β1整合素表达下调可抑制结肠癌细胞增殖,增强结肠癌细胞对化疗药物敏感性.     

CCN5基因敲降对MCF-7乳腺癌细胞增殖的影响及其作用机制

目的 探讨CCN5基因敲降对人乳腺癌细胞增殖的影响；探索CCN5在人乳腺癌细胞增殖中的作用机制；探寻CCN5与乳腺癌发生、发展中的相关性。方法 设置CCN5siRNA转染组，慢病毒空载体转染组，空白对照组，分别采用不同处理方法。CCN5siRNA转染组（以下简称“转染组”）：慢病毒载体介导的CCN5siRNA转染人乳腺癌细胞MCF-7；慢病毒空载体转染组（以下简称“空载组”）：慢病毒空载体转染人乳腺癌细胞MCF-7；空白对照组不进行任何转染操作。采用MTT法检测各组细胞的增殖能力变化，采用RT-PCR、Western blot检测各组细胞CCN5、Skp2和P27Kip1mRNA及蛋白表达。结果 MTT实验表明：转染组细胞增殖力高于空载组和空白对照组；RT-PCR和Western blot结果表明：转染组CCN5mRNA和蛋白水平低于空载组和空白对照组，差异有统计学意义（P <0.05）；转染组Skp2、P27Kip1mRNA和蛋白水平高于空载组和空白对照组，差异有统计学意义（P <0.05）。结论 CCN5siRNA抑制CCN5mRNA和蛋白表达，促进乳腺癌细胞增殖，并且...     

siRNA对腺样囊性癌细胞survivin基因蛋白表达与细胞增殖的影响

目的应用RNA干扰技术靶向阻断survivin基因表达，探讨其蛋白表达水平及对细胞增殖抑制作用。方法将siRNA真核表达载体Pgenesil-sur通过脂质体介导转染腺样囊性癌细胞，采用免疫组化法检测survivin基因蛋白表达；并用图象分析仪分析蛋白表达强度及表达抑制率。MTT法检测对腺样囊性癌细胞增殖的抑制作用。结果空白对照组、空质粒载体组、RNA干扰组survivin蛋白表达强度分别为：2．52&#177;0．10，2．48&#177;0．11，0．53&#177;0．10。经统计学分析表明转染Pgenesil—sur真核表达载体后。survivin基因蛋白表达水平明显减低（P〈0.05），其抑制率达到79％；转染空质粒载体与空白对照组差异无统计学意义（P〉0．05）；MTT法结果表明转染Pgenesil—sur真核表达载体后细胞增殖受到显著抑制，抑制率为38．80％（P〈0．05）；转染空质粒载体细胞增殖未受到抑制（P〉0．05）。结论靶向survivin siRNA能抑制体外培养的腺样囊性癌细胞survivin基因蛋白表达与细胞增殖作用。     

小干扰RNA对人肝癌细胞株HepG2 Survivin基因表达的影响

目的构建Survivin基因特异性小干扰RNA(siRNA),检测siRNA-Survivin对Survivin基因表达的抑制,在人肝癌细胞株HepG2中研究survivin和survivin siRNA对细胞凋亡的影响。方法设计survivin siRNA序列,构建靶向Survivin siRNA真核载体。利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,通过相差显微镜下观察、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察转染后survivin的表达,以及HepG2细胞的凋亡。结果成功构建了survivin siRNA表达载体,并且si-survivin对survivin有明显抑制效应,可显著抑制HepG2细胞的发生凋亡。转染Survivin-siRNA细胞活性受到显著抑制(P<0.05),光镜下出现明显的凋亡形态,DNA电泳出现典型的凋亡"梯状"带。RT-PCR结果显示细胞转染24 h、48 h和72 h后HepG2 Survivin mRNA分别减少了56%、78%和50%,而siR-NA阴性对照与未转染细胞相比差异不显著。结论转染的Survivin-siRNA可特异性抑制肝癌细胞株HepG2凋亡抑制基因的表达,从而为肿瘤的基因治疗提供新的实验基础。     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的探讨生存素反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901凋亡的诱导作用。方法设计合成特异性靶向survivin ASODN。胃癌细胞株SGC901分为4组：空白对照组（Sham）、单纯脂质体对照组（Lip）、正义链转染对照组（LipSODN）、ASODN转染组（Lip-AKSODN）。作用12、24、48h后收获各组细胞。Westernblot法检测各组细胞survivin表达情况,倒置显微镜观察细胞生长形态变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中Ki67表达。结果脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞出现survivin蛋白表达明显下降;形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、凋亡小体形成;细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0．05）;细胞中Ki67表达水平明显降低。结论survivin反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。     

导入针对survivin基因的siRNA对大肠癌Lovo细胞凋亡和增殖的影响

目的：向大肠癌离体LOVO细胞中导入针对survivin基因的siRNA，并研究其对LOVO细胞凋亡的影响。方法：设计2条特异性针对survivin基因的siRNA，并体外转录法合成，利用脂质体导入LOVO细胞并检测转染后细胞的凋亡和增殖情况。结果：RTPCR检测survivin mRNA表达水平发现两RNA干扰组细胞内survivin mRNA表达量明显低于正常LOVO细胞；细胞凋亡检测结果发现两干扰组细胞凋亡率分别为21、5％和26、28％明显高于正常Lovo细胞；细胞增殖结果显示：两干扰组细胞增殖能力比正常Lovo细胞减弱。结论：针对survivin基因的siRNA能有效降低目的基因的mRNA表达，抑制LOVO细胞生长，细胞凋亡率明显增高。为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据。     

RNAi-chk1在抑制小鼠Lewis肺癌细胞生长作用的实验研究

目的观察chk1-RNAi联合放疗对Lewis肺癌细胞的抑制及凋亡情况。方法以脂质体Lipofectimine-2000介导,将chk1-536的siRNA表达载体转染小鼠Lewis肺癌细胞株,将其分为空白对照组、错义序列组、siRNA组,2Gy照射组、2Gy照射+错义序列组、2Gy照射+siRNA组。应用MTT法检测转染细胞抑制率、流式细胞术分析转染siRNA后细胞的凋亡,并应用RT-PCR检测转染细胞chk1-mRNA表达水平。结果 chk1-siRNA转染联合辐射组的Lewis肺癌细胞,与对照组相比较生长增殖受抑制、细胞凋亡增加;MTT法检测和流式细胞术分析示:chk1-siRNA转染联合辐射组的Lewis肺癌细胞生长增殖受抑制,细胞凋亡增加(P<0.05);同时,RT-PCR法检测该组细胞中chk1mRNA表达量下降(P<0.05)。并且siRNA转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡。结论针对chk-1的RNAi可以提高Lewis肺癌细胞的抑制率及放疗引起的肿瘤细胞的凋亡,对肿瘤有治疗作用,与放疗有协同作用。     

siRNA沉默血管VEGFR-1基因对乳癌生长抑制作用

目的探讨应用化学修饰的小干扰RNA（siRNA）沉默人裸鼠乳癌移植瘤新生血管中的血管内皮生长因子受体-1（VEGFR-1）基因对移植瘤生长的影响。方法将组织瘤块接种于裸鼠右侧第二对乳腺的脂肪垫内,肿瘤长至一定大小时,随机分为对照（A）组、转染试剂对照（B）组、siRNA治疗（C）组。于肿瘤局部分别注射PBS溶液、Lipofectamine 2000^TM转染试剂和Lipofectamine 2000^TM转染试剂包裹的VEGFR-1 siRNA。22d后处死全部动物,取肿瘤,测其大小;用RT—PCR及蛋白印迹法检测乳癌组织VEGFR-1基因的表达。结果与A、B组比较,C组移植瘤增长趋势受到明显抑制（F=158．18、55．72,q=11．39、14．05,P〈0．01）;RTPCR结果表明,与A、B组比较,C组明显下调了VEGFR1 mRNA的表达（F=385．06,q=33．43,34．52,P〈0．01）;蛋白印迹法结果亦显示,C组明显下调了VEGFR-1 mRNA的表达（F=114．11,q=9．31,20．75,P〈0．01）。A组和B组各指标差异无显著性（P〉0．05）。结论化学修饰的siRNA介导的RNAi可以降低人乳癌裸鼠移植瘤血管中VEGFR-1的表达,抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,是潜在的肿瘤治疗的新方法。     

As2O3对人胃癌多药耐药细胞模型的逆转耐药作用

目的体外建立人胃癌细胞多药耐药模型,研究多药耐药机制及三氧化二砷（As2O3）对其逆转耐药作用。方法采用阿霉素（ADM）浓度梯度递增法诱导建立人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/ADM,MTT法检测SGC7901/ADM细胞对ADM、长春新碱（VCR）、紫杉醇（TAX）的敏感性及As2O3对其逆转耐药倍数,免疫细胞化学法（PV法）检测细胞P-糖蛋白（P-gp）、Caspase3表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 SGC7901/ADM细胞对ADM、VCR和TAX均耐药,耐药倍数分别是7.49、7.56及5.33。在As2O3作用48h后,3种抗癌药物对SGC7901/ADM细胞生长抑制50%时的浓度（IC50）明显降低,差异有显著性（F=169.766-1 199.812,q=6.86-70.40,P〈0.01）;耐药细胞经As2O3及环孢素A（CsA）作用后,P-gp表达明显下调,差异有显著性（F=42.870,q=7.70-21.50,P〈0.01）;As2O3高浓度组细胞中Caspase3表达上调,差异有显著性（F=7.220,q=6.63,P〈0.05）。As2O3作用组SGC7901/ADM细胞凋亡率随As2O3浓度增加而增加（F=1 986.63,q=21.23-95.08,P〈0.05）。结论 SGC7901/ADM细胞具有多药耐药性,As2O3可逆转其耐药,并呈剂量依赖性。     

Apo-2L对放射线诱导鼻咽癌CNE细胞凋亡作用

目的了解凋亡素2配体（Apo-2L）与放射治疗协同对体外培养鼻咽癌CNE细胞增殖周期及凋亡率的影响。方法 MTT法检测不同浓度Apo-2L对鼻咽癌CNE细胞的影响,确定Apo-2L与细胞作用时间及浓度。将细胞随机分为对照组、Apo-2L组、Apo-2L＋放射组及单纯放射组,分别给予相应的处理后制成细胞悬液,流式细胞仪分析细胞凋亡率和细胞周期变化。结果鼻咽癌CNE细胞的抑制率与Apo-2L的浓度呈正相关（r=0.91,P〈0.05）,当用浓度为100μg/L的Apo-2L处理CNE细胞24h,Apo-2L＋放射组凋亡率较其他各组明显升高,差异有显著性（F=8.64,P〈0.05）。Apo-2L＋放射组G2-M期比率较其他各组显著降低（F=7.74,P〈0.05）。结论Apo-2L对体外培养鼻咽癌CNE细胞有抑制增殖和促进凋亡作用;Apo-2L联合放射线治疗可以使细胞周期同步化,并明显提高CNE细胞的凋亡率。     

多西他赛联合恩度对前列腺癌PC-3细胞的体外作用

目的探讨多西他赛联合恩度对前列腺癌PC-3细胞的作用及其可能机制。方法将体外培养的PC-3细胞随机分为恩度组、多西他赛组、恩度与多西他赛联合组、无药物干预对照组,分别采用MTT法、流式细胞术、RT—PCR和Western—Blot方法,检测各组细胞的增殖、凋亡及MMP-9、MRP、Bcl-2、BaxmRNA和Bcl-2、Bax蛋白表达。结果多西他赛与恩度对PC-3细胞增殖有呈时间依赖性的抑制作用,两药联合的抑制率高于单独用药（F=8．38～16．39,P〈O．05）,G2／M期细胞比例较对照组增加（F=210．60,q=4.08,P％0.05）。与恩度组、多西他赛组比较,恩度与多西他赛联合组的MMP～9、MRP、Bcl-2mRNA表达明显降低（F=48．32～201．27,q=8．47～16．87,P％0．05）,BaxmRNA表达明显升高（F=101．60,q=4．46～11．29,P〈0．05）,Bcl2蛋白表达明显降低（F=121．80,q=2．95～26．92,P〈0．05）,Bax蛋白表达明显升高（F=342．80,q=3．23～5．26,P〈0．05）。结论多西他赛与恩度对PC-3细胞的生长均有-定的抑制作用,两药联合应用的效果优于单独用药,其机制与降低MMP-9、MRP、Bcl2表达、增高Bax表达有关。     

Tempol对紫外线照射所致HaCaT细胞损伤保护作用

目的观察氮氧化物4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶（Tempol）对中波紫外线（UVB）照射所致人角质形成细胞（HaCaT细胞）损伤的保护作用,并探讨其发生机制。方法在HaCaT细胞培养系统中加入不同浓度的Tempol进行培养,12h后洗掉培养液中的Tempol,用30mJ／cm^2 UVB照射细胞后,重新加入培养液继续培养24h。用MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定细胞凋亡率。RT—PCR方法测定FoxO3a和BubR1基因的表达。结果UVB照射组与正常对照组相比,细胞增殖活性明显降低（F=27．71,q=13．57,P〈0．05）,FoxO3amRNA的表达明显增强（F=13．93,q=9．79,P〈0．05）,BubR1mRNA的表达明显减弱（F=29．69,q=14．54,p〈0．05）,凋亡率明显增高（x^2=93．69,P〈0．05）;与UVB照射组相比,不同浓度的Tempol可以恢复UVB照射细胞的增殖能力（q=3．24～13．60,P〈0．05）,降低照射细胞的凋亡率（x^2=12．02～101．02,P〈0．05）,下调FoxO3amRNA的表达（q=2．92～9．95,P〈0．05）,上调BubR1mRNA的表达（q=2．97～14．61,P〈0．05）。结论Tempol可以保护HaCaT细胞免受uVB照射造成的损伤。     

奥沙利铂联合5-Fu术前短程冲击化疗对诱导结直肠癌细胞凋亡的影响

目的：探讨奥沙利铂（L-OHP）联合五氟尿嘧啶（5-Fu）术前短程冲击化疗对结直肠癌细胞凋亡的影响,为结直肠癌新辅助化疗方法提供理论依据。方法对60例结直肠癌患者均分为两组,一组术前采用L-OHP联合5-Fu短程冲击化疗,另一组术前不作化疗。采用RT-PCR法检测凋亡抑制基因Survivin mRNA的表达,用免疫组化检测bcl-2、p53及ki-67的表达,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果相较于对照组,新辅助化疗组Survivin mRNA表达水平明显降低,bcl-2、ki-67阳性面积率及p53阳性面积率也明显降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）,细胞凋亡率高于对照组（P〈0.05）。结论术前L-OHP短程冲击化疗能够诱导癌细胞凋亡,可能是通过下调survivin mRNA的表达来调控或协同其他凋亡因子,从而达到新辅助化疗治疗的效果。