兔角膜缘干细胞的体外培养、鉴定及形态学特点

目的 体外培养兔角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),观察其生物学特性.方法 用含20%胎牛血清DMEM:F12(1:1)培养基对兔LSCs进行体外培养,倒置显微镜及HE染色观察培养细胞体外生长的形态,免疫细胞化学AE5和P63染色鉴定并进行图像分析,透射电镜观察超微结构特点.结果 培养2～3 d细胞从组织块游出,6～8 d形成良好的单层,细胞多呈圆形或卵圆形.电镜观察,培养7 d LSCs呈卵圆形,表面有少量微绒毛突起;胞质内细胞器少,核大,核仁明显,核浆比例大,部分细胞可见双核现象.免疫组化观察,培养第7天,大量细胞AE5免疫反应染色呈阴性,阳性细胞数量较少,大量细胞P63免疫反应染色呈阳性;培养第14天,AE5阳性细胞数明显增多,免疫反应染色增强,阳性细胞的平均灰度值显著降低(7 d:184.30±9.85,14 d:133.36±25.00,P<0.01).P63免疫反应阳性细胞数第14天与第7天相比明显减少,而阳性细胞的平均灰度值显著增高(7 d:108.13±17.96,14 d:177.59±7.86,P<0.01).结论 应用组织培养方法获得的原始细胞具有与体内正常LSCs相一致的形态特征;培养第7天为LSCs生长的峰值期.     

兔角膜缘干细胞的体外培养和生物学特性观察

目的 探讨兔角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法 采用消化培养法，分2组培养，1组为消化并过滤后的角膜缘干细胞培养组，另1组为消化后未过滤的带组织块培养组，均用含20％胎牛血清的培养液培养，待细胞长成良好单层后消化传代，分别观察记录细胞在原代和传代培养时的生长特性并行HE染色观察。结果 过滤组角膜缘干细胞在培养24h后开始贴壁生长，7～10d形成良好单层，细胞以圆形或椭圆形为主，核较大，呈原始细胞特征，传代培养时见细胞体积逐渐增大，核变小，成纤维细胞少见；带组织块培养组原代培养时与过滤组无明显差异，传代时则见成纤维细胞渐增多，至第3代时占主导并抑制了角膜缘干细胞的生长。结论 采用消化培养法可成功培养出兔角膜缘干细胞，培养时应滤除组织块以减少成纤维细胞的影响。     

人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定方法。方法 应用消化培养法对人胎儿角膜缘上皮组织进行体外培养并观察记录培养细胞的生长特性；对胎儿角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测；并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果 胎儿角膜缘上皮细胞原代培养时生长旺盛，传代培养时保持高增殖速率。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞，并见较多HLA-DR阳性细胞；原代细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性，AEI和PCNA阳性；传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分；扫描电镜观察原代细胞以球形或短圆柱形为主，表面多突起和微绒毛。结论 采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力和低抗原性的人胎儿角膜缘干细胞．为临床眼表重建开辟了新的思路。     

兔角膜缘干细胞体外无血清培养及生物学特性初步研究

目的探讨兔角膜缘干细胞体外无血清培养方法及生物学特性并与传统的10%血清培养方法进行比较。方法获取兔角膜缘组织,酶消化法制成单细胞悬液,分含B27的无血清组和传统方法的10%血清组两组进行培养,观察两组细胞的生长情况,CCK-8检测其克隆增殖能力,细胞免疫化学染色方法对两组细胞进行鉴定。结果较传统10%血清培养组,无血清培养组培养的兔角膜缘干细胞表现出相似的生长特性及增殖能力,细胞免疫化学染色无血清组⊿Np63阳性细胞较10%血清组明显多,角蛋白K3（AE5）阳性细胞10%血清组较多。结论用含B27的无血清培养基可以培养获得角膜缘干细胞,减少了血清中不明成分对干细胞的影响,为角膜缘干细胞的体外培养、扩增及纯化提供了新的选择。     

角膜缘干细胞体外培养的研究进展

<正>角膜上皮细胞具有自我更新的能力,眼表的正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成。随着眼表疾病研究有突破性进展,角膜缘干细胞在眼表中的重要性越来越受到人们的重视,角膜缘干细胞体外培养的研究也日渐增多。笔者现就角膜缘干细胞的体外培养与临床应用作     

深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养方法。方法 将2mm宽的兔角巩膜组织通过程序降温仪降温后置于-196℃液氮中深低温保存。1年后复温，应用消化培养法分别对冻存及新鲜的兔角膜缘干细胞进行体外培养，观察并记录细胞生长情况，HE染色观察培养细胞的形态特征。结果 经过深低温保存的兔角膜缘干细胞可以在体外被成功培养并传代，其在原代培养48h后开始贴壁生长，5d后生长较旺盛，但可见部分破裂和死亡细胞，约12d基本形成单层；传代培养时次日贴壁，7d形成单层。新鲜兔角膜缘干细胞原代培养时细胞形态相似，但破碎死亡细胞少见，且于7d左右即基本形成单层，传代时两者无明显差别。结论 深低温保存的角膜缘干细胞能被成功地进行体外培养，培养后细胞具有与培养的新鲜角膜缘干细胞基本相似的特性，为深低温保存的角膜缘干细胞培养后移植治疗临床眼表疾病提供了实验依据，并为眼库技术的发挥开辟了新的应用途径。     

去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的实验研究

目的探讨去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的可行性。方法取小块兔角膜缘组织,采用组织块 细胞悬液共培养,待细胞长至对数生长期,分别传代于去上皮羊膜和完整羊膜,甲基偶氮蓝比色(MTT)法对比两组细胞增殖率,并行AE_5免疫鉴定。结果原代细胞接种7d左右,生长至对数生长期,细胞融合成单层。去上皮羊膜组细胞传代培养效果明显优于完整羊膜组。AE_5单克隆抗体染色强阳性。结论去上皮羊膜上培养出的兔角膜缘组织既有角膜上皮特性,又具有强的增殖潜力。     

兔角膜上皮细胞体外原代培养和鉴定

目的 建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法,并观察其体外生长的生物学特性.方法 采用全角膜组织培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,通过形态学观察并应用免疫组织化学方法对细胞进行鉴定.结果 兔角膜上皮原代培养第2天,组织边缘有细胞游出,细胞和细胞核均呈圆形,胞核位于细胞中央或旁中央区;第3天,细胞呈扁平多...     

角膜缘干细胞培养后移植的研究进展

角膜上皮具有自我更新的能力。为保持上皮的完整性．其表层细胞不断更新，基底层细胞不断增殖以取代脱落细胞。1986年Schimer等通过研究首次明确指出角膜缘干细胞位于约1．5mm的角膜缘环形区域内的上皮细胞基质层内。此处的Vogt栅栏内的网状嵴上皮被认为是干细胞储存所。研究表明，角膜缘干细胞是角膜上皮细胞增殖、分化和移行的源泉。角膜缘缺损或角膜干细胞的丧失将导致角膜表面顽固的     

自体体外培养角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉11例

1 临床资料 2003-05/2004-04我院采用显微镜下手术切除局部病变组织联合自体体外培养角膜缘于细胞移植术治疗11例12眼翼状胬肉,男7例8眼,女4例4眼.     

小鼠骨髓间质干细胞的体外培养与多向分化潜能的鉴定

 【目的】 建立小鼠骨髓间质干细胞(MSC)体外培养?纯化?扩增方法,并进行体外定向诱导条件下的多向分化潜能鉴定?【方法】 取3～18月雄性C57BL/6J小鼠(共48只)骨髓细胞,贴壁培养后,用免疫磁珠法纯化,观察纯化后的细胞形态,对3?10?20代的MSC进行细胞生长曲线绘制;并检测细胞在不同诱导条件下向成骨细胞?脂肪细胞?肌肉细胞的分化能力?【结果】 小鼠MSC在体外可以诱导成成骨细胞?脂肪细胞?肌肉细胞?MSC连续传代培养达30代以上,细胞的形态?抗原表达无改变,并保持多向分化潜能?【结论】 该方法获得的MSC具有高度增殖?多向分化潜能?生物学特性稳定的特点?     

兔脂肪来源干细胞表面标记分析及向心肌样细胞分化

目的分析兔脂肪来源干细胞（adipose-derived stern cells,ADSCs）表面标记并且对其进行体外诱导,观察其向心肌细胞分化的潜能,探讨脂肪来源细胞治疗缺血性心脏病的可能性。方法应用酶消化法获得兔ADSCs,并在DMEM培养基中进行体外培养。取第二代细胞以流式细胞术鉴定其表面标记。第二代细胞经5-AZA（浓渡为10μmol／L）处理24h,第2天更换新鲜培养液,以后每3d换液1次,诱导3周后,应用RT-PCR检测心肌细胞特异性α肌球蛋白重链（α—MHC）基因及免疫荧光检测心肌肌钙蛋白（cTNT）。结果流式细胞术检测显示Sca1、CD44、CD117高表达,CD34和CD45低表达。诱导后细胞表达cTNT。RT—PCR显示与正常心肌组织＊MHC阳性条带对照,诱导后ADSC也在相同位置出现α-MHC的阳性条带,而未诱导ADSC没有阳性条带出现。结论ADSC具有间质干细胞的特征,ADSC在一定诱导条件下向心肌样细胞分化,是一种有潜力的治疗缺血性心脏病的移植细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外优化条件的研究

目的通过比较5种不同体外培养人骨髓问充质干细胞（hMSCs）条件，找到一种能在质和量上均能满足需要的体外培养条件。方法使用Percoll-Paque液（1．073g／ml）分离人骨髓血，采用DMEM＋15%的小牛血清、人体白蛋白、人血清、脐带血清及MesenCult培养基，在相同培养条件下，动态观察hMSCs的生长状况、细胞数量变化，通过流式细胞仪检测细胞的纯化状况。结果5种培养条件在一定时相内均能获得较为纯化的hMSCs，但在生长速度和纯化率上存在一定的差异。结论Mesen Cult是一种较为优秀的hMSCs培养基．胎儿脐带血清培养也能在短期内获得足量纯化的hMSCs．人血清的使用还需要做进一步的研究。     

带角膜缘干细胞的板层角膜移植术治疗严重角膜病变

目的 报告带角膜缘干细胞的异体板层角膜移植术治疗严重角膜病变的疗效。方法 供体角膜选用新鲜尸体眼球，制作的板层角膜植片包括透明角膜、角膜缘和角膜缘周围4mm的巩膜，移植到已去除病变组织的眼球表面，观察眼表结构的愈合情况。结果 63例（63眼）角膜病变患者被实施了带角膜缘干细胞的板层角膜移植术，经过5～52月，平均（12．5土6．2）月的随访，大部分患者维持较稳定的眼表，但有3例患者出现明显的上皮排斥反应，经过强化抗排斥治疗，2例被控制；1例蚕蚀性角膜溃疡患者于术后6月复发；所有角膜良性肿瘤患者在随访期内均未见复发。结论 带有活性角膜缘干细胞的异体板层角膜移植是治疗伴有角膜缘干细胞缺乏或功能障碍的严重角膜病变的较好方法。     

自体角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉43例临床观察

目的 评价自体角膜缘干细胞移植术治疗翼状胬肉的疗效。方法采用自体角膜缘干细胞移植术治疗54眼(43例)翼状胬肉，其中原发性翼状胬肉38眼，复发性翼状胬肉16眼。16眼复发性胬肉均经过两次以上的单纯胬肉切除术或结膜下转移术。结果 术后随访6-18个月，无术后并发症发生。49眼无胬肉组织再生，5眼在术后8—11个月复发，复发率为9．3％。结论 自体角膜缘干细胞移植术能为受损的角膜缘提供新的干细胞，是一种安全、有应用前景的治疗翼状胬肉的手术方式。     

The Development of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Culture in vitro

Objective To review the development of bone marrow mesenchymal stem cells culture in vitro. Data sources The data cited in this review were mainly obtained from the articles listed in Medline and PubMed. The search terms were “bone marrow mesenchymal stem cell” and “cell culture”. Study selection Articles regarding the development of BM-MSCs culture in vitro, as well as the challenge of optimizing cell culture environment in 2D vs 3D. Results Improving the culture conditions increase the proliferation and reduce the differentiation. Optimal values for many culture parameters remain to be identified.Expansion of BM-MSCs under defined conditions remains challenges, including the development of optimal culture conditions for BMSC and large-volume production systems.