铁皮石斛HSP70基因的克隆及冷胁迫表达分析

目的: 揭示铁皮石斛热激蛋白HSP70基因冷胁迫表达,为耐低温品系选育提供分子生物学基础。 方法: 根据已获得的HSP70基因片段序列,采用RACE方法从铁皮石斛中克隆到HSP70基因全长cDNA序列。预测其编码蛋白的结构与功能,并运用实时定量PCR进行冷胁迫下表达分析。 结果: 核苷酸序列分析表明该基因全长2 296 bp,包含一完整的1 944 bp的开放阅读框,编码647个氨基酸。氨基酸序列具有典型的HSP70特征并且与其他植物的HSP70有很高的同源性。冷胁迫表达分析说明该基因确实能被低温诱导表达。 结论: 首次克隆获得受低温诱导表达的铁皮石斛HSP70基因,为进一步研究铁皮石斛健康栽培与抗寒品系的选育奠定基础。     

滇重楼鲨烯合酶基因PpSQS的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆滇重楼鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因(PpSQS),对该基因进行序列分析及原核表达。 方法: 采用同源克隆和RACE技术获得PpSQS的cDNA,并对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET-30b(+)-PpSQS,在大肠杆菌Escherich coli BL21(DE3)中进行诱导表达。 结果: PpSQS基因cDNA全长1 498 bp,包含1个1 212 bp的开放阅读框(ORF),可编码403个氨基酸;PpSQS理论标准分子质量为46.36 kDa,等电点为pI 6.83;SDS-PAGE分析表明,经1 mmol·L^-1 IPTG诱导后,重组PpSQS蛋白在大肠杆菌中获得表达。 结论: 首次获得了滇重楼PpSQS基因cDNA全长序列,该基因编码产物具有植物SQS同源蛋白的典型特征,实现重组PpSQS在大肠杆菌中的表达。     

维脑康及银杏总内酯对局灶性脑缺血再灌注自噬和神经发生作用研究

目的: 观察维脑康及其活性成分银杏总内酯对局灶性脑缺血再灌注的保护作用及其机制。 方法: 采用大鼠60 min中脑动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)/24 h~14 d再灌注模型。蛋白免疫印迹法检测自噬基因Beclin-1表达。透射电镜观察神经元超微结构变化。免疫荧光法检测缺血侧神经发生。 结果: 维脑康(20,10 mg·kg^-1,ig)及其组分银杏总内酯(10,5 mg·kg^-1,ig)可促进缺血侧新生成熟神经元 (BrdU⁺-MAP-2⁺) 产生,抑制自噬基因Beclin-1表达,最终减轻缺血再灌注带来的神经元损伤。 结论: 维脑康可抑制缺血周边区神经元自噬、促进神经发生,说明自噬可能是有效中药维脑康促进缺血脑区自修复功能的干预靶点。     

地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1的克隆和表达分析

为了克隆地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1,分析地黄RgIAA1的时空表达特性及对逆境胁迫的响应。以拟南芥AtIAA14的cDNA序列为探针在地黄转录组数据库中进行比对,应用生物信息学方法分析RgIAA1的序列特征及进化关系,以实时荧光定量PCR技术检测RgIAA1在地黄不同组织以及逆境胁迫下的表达量。结果表明,获得1条903 bp的cDNA序列,包含一个681 bp完整的开放阅读框（ORF）,编码226个氨基酸,具有Aux/IAA家族蛋白的典型结构域和特征序列。RgIAA1在地黄不同组织中的表达呈差异表达,其中在地黄幼嫩叶片里表达强度最大,其次为茎,且随着叶片的伸展,RgIAA1表达强度不断降低。在连作时RgIAA1的表达量升高,NaCl和渍水胁迫下RgIAA1的表达量降低。实验首次克隆了地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1,为阐明其在地黄生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。     

大豆24 kDa油体蛋白基因与aFGF融合转化红花的研究

目的: 利用红花表达酸性成纤维细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor,aFGF),为利用植物生物反应器规模化生产aFGF奠定基础. 方法: 将人源aFGF基因改造为植物偏好性的aFGF基因序列,通过PCR搭桥技术克隆植物偏好的aFGF基因,利用酶切连接方法构建植物油体表达载体,通过冻融法转到根瘤农杆菌EHA105,利用农杆菌介导的方法转化到塔城红花中,对转化红花进行PCR,Southern杂交,RT-PCR分子检测. 结果: 扩增出植物偏好的aFGF基因的全长序列,并与大豆油体蛋白基因Doil基因融合,成功地插入到改造好的含有大豆油体蛋白启动子表达载体中, 探索了进行红花遗传转化的最佳条件,成功获得单位点插入的3个独立转化红花植株,在转录水平都有大小一致的aFGF的表达. 结论: 该实验成功构建了含aFGF植物油体表达载体,并筛选出最佳的遗传转化条件,A为0.6,侵染时间为10 min,共培养3 d,获得了aFGF转录水平表达的转基因红花植株,这将红花油体蛋白本身的皮肤保护作用,与FGFs的创伤修复作用累加,快速开发出外用创伤药物奠定基础.     

喘平缓释片体外释放与人体内吸收的相关性研究

目的: 研究喘平缓释片体外释放与人体内吸收的相关性。 方法: 以麻黄碱、伪麻黄碱为指标成分,体外采用转篮法结合HPLC测定喘平缓释片在不同pH介质中的累积溶出率;体内采用尿药法结合HPLC测定尿液中的药物浓度;应用Wagner-Nelson法评价喘平缓释片体内外相关性。 结果: 喘平缓释片人体内不同时间点的吸收百分数F与体外累积溶出率f的线性回归方程分别为F_麻黄碱=1.572 5f-20.729(R²=0.974 5),F_伪麻黄碱=1.237f-0.147 6(R²=0.959 5)。 结论: 喘平缓释片体内-体外相关性良好,体外释放度测定方法可用于控制喘平缓释片内在质量和预测其生物利用度。     

咖啡酸在大鼠体内的绝对生物利用度及其在肠道吸收特性的研究

目的：研究咖啡酸在大鼠体内的绝对生物利用度及其在肠道的吸收特性。方法：大鼠分别采用静脉（2 mg·kg^-1）、灌胃（10 mg·kg^-1）给药研究咖啡的绝对生物利用度;建立大鼠原位肠血管灌流模型研究咖啡酸在肠道的吸收率;采用Caco-2细胞模型研究咖啡酸的双向转运情况。结果：咖啡酸静脉（2 mg·kg^-1）、灌胃（10 mg·kg^-1）给药后,在大鼠体内的药动学行为均符合二室模型,咖啡酸的绝对生物利用度为14.7%;咖啡酸在肠血管灌流模型中的吸收率为12.4%;咖啡酸的P_appAP→BL及P_appBL→AP不随浓度的变化而变化,且在实验浓度的范围内,P_appBL→AP/P_appAP→BL均大于2。结论：咖啡酸绝对生物利用度低,肠道吸收率少,在Caco-2细胞单层模型中的转运途径可能为主动转运。     

藏药甘青乌头化学成分研究

对甘青乌头Aconitum tanguticum全草的化学成分进行研究。应用硅胶,ODS,Sephadex LH-20,制备HPLC等各种色谱技术进行分离纯化,采用MS,NMR等波谱技术鉴定化合物结构。甘青乌头乙醇总提取物经石油醚、乙酸乙酯萃取后的剩余水溶液经AB-8大孔吸附树脂,依次用水,30%,60%,95%乙醇洗脱,合并回收溶剂分别得到各洗脱部分。从30%,60%乙醇洗脱部分共分离得到19个化合物,分别鉴定为紫丁香苷(1),香草酸4-O-β-D-阿洛糖苷(2),阿魏酸4-O-β-D-阿洛糖苷(3),阿魏酸4-O-β-D-葡萄糖苷(4),芥子酸4-O-β-D-葡萄糖苷(5),4-羟基-肉桂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷(6),槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→2)-[α-L-鼠李糖基-(1→6)]-β-D-半乳糖苷-7-O-α-L-鼠李糖苷(7),山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖基-(1→2)-[α-L-鼠李糖基-(1→6)]-β-D-半乳糖苷-7-O-α-L-鼠李糖苷(8),槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖基(1→6)-β-D-半乳糖苷-7-O-α-L-鼠李糖苷(9),山柰酚-3-O-[β-D-葡萄糖基-(1→3)-(4-O-反式-对香豆酰基)]-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-半乳糖苷-7-O-α-L-鼠李糖苷(10),槲皮素-3-O-[β-D-葡萄糖基-(1→3)-(4-O-反式-对香豆酰基)]-α-L-鼠李糖基-(1→6)-β-D-半乳糖苷-7-O-α-L-鼠李糖苷(11),红景天苷(12),2-(3,4-二羟基苯基)乙醇 1-O-β-D-葡萄糖苷(13),(7S,8R)-去氢二松柏醇-9'-O-β-D-葡萄糖苷(14),citrusin B (15),异叶乌头碱(16),tanaconitine(17),山栀苷甲酯(18)和淫羊藿次苷B₁(19)。除化合物 4,13,16和17 外,其余化合物均为首次从甘青乌头中分离得到。     

肝龙胶囊对大鼠慢性酒精性肝损伤的防治作用研究

目的: 研究肝龙胶囊对大鼠慢性酒精性肝损伤的防治作用及作用机制。 方法: 采用梯度浓度乙醇灌胃12周建立慢性酒精性肝损伤模型。检测大鼠血清中ALT,AST,TG,CHO,TNF-α水平和肝组织中GSH,SOD,MDA,ADH和Alb的水平,以及肝脏病理学检查,并对其损伤程度进行病理分级。 结果: 肝龙胶囊能降低肝损伤大鼠血清中ALT,AST,CHO,TG, TNF-α和肝组织中MDA的含量(P<0.01),提高肝组织中抗氧化剂GSH和SOD的活性(P<0.01);病理切片观察可见,模型组大鼠肝小叶结构大部分被破坏,肝细胞索紊乱,胞浆内出现弥漫性大小不等的脂肪空泡,可见灶状坏死和炎性细胞浸润;各治疗组大鼠肝损伤均有不同程度的减轻。 结论: 肝龙胶囊对大鼠慢性酒精性肝损伤有显著的防治作用。     

塔中栽培荒漠肉苁蓉化学成分研究

对新疆塔中栽培荒漠肉苁蓉Cistanche deserticola Y. C. Ma干燥肉质茎的化学成分进行研究。采用正相硅胶、凝胶 Sephadex LH-20,MCI,ODS以及半制备高效液相色谱等方法进行分离纯化,运用 NMR,MS等波谱方法以及理化性质结合文献数据对分离得到的化合物进行结构鉴定。结果从塔中栽培荒漠肉苁蓉干燥肉质茎85%乙醇提取物中分离得到17个化合物,其结构鉴定为salsaside B(1)、紫丁香苷(2)、去甲基紫丁香苷(3)、松柏苷(4)、(2E,6E)-3,7-dimethyl-8-hydroxyoctadien-1-O-β-D-glucoside(5)、(+)-丁香脂素(6)、2S,3S,4S-trihydroxy-pentanoic acid(7)、panaxytriol(8)、β-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃木糖苷(9)、草夹竹桃苷(10)、3-methyl-but-2-en-1-yl-β-D-glucopyranoside(11)、苄基葡萄糖苷(12)、4-羟基苄基-β-D-葡萄糖苷(13)、烟酰胺(14)、对羟基苯甲酸(15)、对羟基苯乙醇(16)、半乳糖醇(17)。化合物 3,6~13 为首次从该属植物中分离得到,化合物 1,4,5 为首次从该种植物中分离得到。     

蜜环菌的化学成分研究

对蜜环菌Armillaria mellea发酵培养物的化学成分进行研究。采用硅胶、Sephadex LH-20柱色谱等方法进行分离纯化,根据波谱数据及与对照品对照鉴定化合物结构。从蜜环菌发酵培养物中分离鉴定了10个化合物,分别为2-羟基-4-甲氧基-6-甲基苯甲酸(1),苔藓酸(2),蜜环菌戊素(3),麦角甾醇(4),染料木素(5),大豆素(6),胡萝卜苷(7),染料木苷(8),尿嘧啶(9)和甘露醇(10)。化合物 1~10 均为首次从蜜环菌发酵培养物中分离得到,其中,化合物 1~4,6,10 在蜜环菌菌丝体或菌索中已有报道。通过二维核磁波谱确证,首次报道化合物3以DMSO为溶剂的氢、碳谱数据,是对该类成分波谱数据的补充。     

金荞麦苯丙氨酸解氨酶基因FdPAL 的克隆及原核表达

目的:克隆金荞麦苯丙氨酸解氨酶(FdPAL)基因DNA和全长cDNA序列,对该基因进行序列分析,原核表达及其活性相关研究.方法:采用同源克隆和RT-PCR技术扩增苯丙氨酸解氨酶基因的DNA序列和全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析;构建PAL原核表达载体pET30b(+)-FdPAL,在大肠杆菌Escherich coli BL21( DE3)中进行诱导表达,使用分光光度计法定量测定其酶活,使用薄层色谱法鉴定其催化活性.结果:金养麦PAL基因DNA序列全长2 583 bp,由2个外显子,1个内含子构成(命名为FdPAL,GenBank登录号为HM628904);cDNA序列包含1个2 169 bp的开放阅读框(ORF),编码722个氨基酸,理论相对标准分子质量78.31 kDa,等电点5.94.SDS-PAGE分析表明,诱导后的新生蛋白质相对标准分子质量为75.37 kDa;诱导4h后,表达产物的苯丙氨酸解氨酶比活力最高,达到4 386 nmol·g-1·min-;薄层色谱结果表明,诱导表达产物具有催化苯丙氨酸转化为肉桂酸的活性.结论:首次从金荞麦中克隆到PAL基因,该基因具有植物PAL同源基因的典型特征;重组的金荞麦PAL基因表达载体[pET30b(+)-FdPAL]能有效地在大肠杆菌Ecoli BL21 (DE3)中表达,并形成具有一定催化功能的酶.     

植物生长调节剂对川白芷生长发育及其产量品质的影响

为了探明植物生长调节剂对药用植物川白芷产量、品质的影响,文章用5种不同植物生长调节剂矮壮素(CCC)、缩节胺(PIX)、赤霉素(GA₃)、多效唑(PP₃₃₃)、马来酰肼(MH)在莲座期处理川白芷,在收获期通过测量川白芷的生物性状,应用HPLC检测川白芷根中欧前胡素、异欧前胡素的含量。研究表明除较高浓度的赤霉素对川白芷早期抽薹有促进作用,其他植物生长调节剂均有不同程度的抑制作用。在较低浓度时,赤霉素对早期抽薹和总香豆素含量影响不大。但其对植株生长有促进作用,进而促进了产量的提高。用质量浓度为30 mg·L^-1的赤霉素GA₃处理,既可以保证川白芷的生长发育,从而得到较高的产量,另外还可以保证其含有较高的有效成分。     

乌拉尔甘草HMGR基因cDNA的克隆与序列分析

目的:对乌拉尔甘草3.羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR)的cDNA克隆并进行序列分析.方法:根据NCBI数据库中的豆科其他物种HMGR的cDNA保守区设计引物,利用同源扩增和cDNA末端快速扩增技术从甘草根中获得目的基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开发阅读框,Prosite分析蛋白质的基本结构域,Clustal x比对已有HMGR的氨基酸序列,并构建进化树.结果:得到1个全长为1 842 bp的HMGR的cDNA序列,含有1 722 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码573个氨基酸,具有HMGR家族的特异序列,推测的氨基酸序列与豌豆、蒺藜苜蓿的氨基酸序列一致性分别为84%,76%.结论:对甘草HMGR基因的cDNA进行了克隆,为进一步研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A在甘草酸生物合成途径中的作用提供了理论依据.     

丹参转录因子SmbHLH1基因的克隆和表达分析

目的:获得丹参转录因子SmbHLH1全长基因,分析SmbHLH1基因在丹参不同组织部位,以及不同诱导子处理后的表达差异.方法:利用RT-PCR等技术获得SmbHLH1基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmbHLH1基因在丹参不同部位的表达情况,及在不同处理条件下的表达情况.结果:获得的SmbHLH1基因由999个核苷酸组成,编码332个氨基酸,蛋白相对分子质量约36 kDa;半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量最高,其次是茎,在叶和花中有微量表达;茉莉酸甲酯,以及酵母提取物和Ag+共同诱导,会抑制该基因的表达,水杨酸和脱落酸对该基因的影响不大.结论:丹参SmbHLH1基因是bHLH家族新成员,其功能可能与油菜素内酯信号途径有关.     

黄精属5种药用植物根状茎的结构及其组织化学定位

目的: 研究5种黄精属植物黄精Polygonatum sibiricum、多花黄精P. cytonema、长梗黄精P. filipes、湖北黄精 P. zanlanscianense和玉竹P. odoratum的显微结构及组织化学定位。 方法: 运用荧光显微镜观察维管束的类型,运用扫描电子显微镜观察晶体的形态,运用组织化学开展多糖、皂苷与挥发性成分的定位研究。 结果: 黄精属植物的维管束结构类型主要有外韧型、不完全周木型和周木型3类,种间导管分子排列疏密有区别。扫描电镜下,黏液细胞内的针晶束形似柱晶束。黄精属植物根状茎中,多糖类物质多分布于黏液细胞中,皂苷类和挥发油类物质多分布在黏液细胞以外的基本组织中。 结论: 黄精属植物根状茎中维管束类型和导管的排列状态特征可以作为种间鉴别的重要依据;多糖与皂苷类化合物的分布于不同的细胞组织。     

白木香乙酰乙酰基辅酶A硫解酶基因(AsAACT)的克隆与表达分析

目的：对国产沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis （Lour.）Gilg乙酰辅酶A酰基转移酶（acetyl-CoA C-acetyl transferase,AACT）基因AsAACT全长进行克隆并展开生物信息学分析和表达分析,为解析沉香萜类次生代谢产物的生物合成机制奠定基础。方法：根据获得的白木香转录组数据库AACT部分转录本序列设计引物,采用RT-PCR及RACE技术,以白木香茎cDNA为模板,克隆获得AsAACT全长,进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR,以GADPH为内参,分析白木香愈伤组织受不同伤害胁迫AsAACT的表达模式。结果：AsAACT开放阅读框（opening reading frame,ORF）为1 236 bp,编码411个氨基酸残基,酶命名为AsAACT;白木香愈伤受物理伤害（切割）后表达量没有明显变化,但受化学伤害（MeJA）后4 h表达量升高了5.5倍,说明该基因对MeJA诱导的化学伤害较敏感,且能够在早期响应伤害胁迫。结论：通过AsAACT基因的全长cDNA克隆和表达特性分析,为后续深入研究其在沉香倍半萜合成途径的功能奠定基础。