西尼罗河病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用研究

建立特异、敏感、快速检测西尼罗河病毒(WNV)的SYBR Green实时荧光定量PCR方法.方法:针对西尼罗河病毒囊膜蛋白(E)的保守序列设计引物,建立WNV的实时荧光定量检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性以及稳定性.对保存的54例WNV感染者的血清样本进行检测,分析其检测的准确性.结果:建立的SYBR Green实时荧光定量PCR方法对WNV的检测具有高度的特异性,而对日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)等均无交叉反应,检测的灵敏度可达到100 pg.标准曲线具有较好的线性关系,相关系数为0.995,实时荧光定量PCR效率为100％.对54例WNV感染样本进行检测,准确率高达98.15％.结论:实时荧光定量PCR技术检测WNV具有较高的特异性、敏感性和稳定性,可作为临床诊断WNV的手段.     

应用MGB探针检测人乙型肝炎病毒的基因型

目的检测血浆或血清样本中人乙型肝炎病毒HBV的基因型,建立了基于MGB探针的实时荧光定量PCR检测体系。方法在HBV基因组型特异性碱基的聚集区域设计荧光定量PcR引物及探针。为保证特征特异性及高分辨率,选择设计MGB探针,然后将PCR扩增的产物纯化后进行基因克隆．克隆成功后提取的质粒制备为阳性质控品,从而建立完整的MGB探针法的荧光定量PCR检测体系,最后对该检测体系进行方法学评价。结果成功建立了基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测体系。方法学评价显示,该检测体系的灵敏度达50IU／mL;重复性好;特异性良好,以多种血浆病毒的核酸样品为模板进行检测时结果全为阴性。结论本研究建立基于MGB探针的HBV荧光定量PCR的基因分型检测方法,可以很好地定性的检测血浆或血清样本及血液制品中的人乙型肝炎病毒HBV的基因型及含量,对于该疾病的临床治疗具有重要的意义。     

多重荧光定量RT-PCR检测高致病性H5N6禽流感病毒

目的建立一种快速检测流感病毒A型(FluA)及高致病性禽流感(HPAI)H5N6病毒感染的荧光定量RT-PCR法。方法以人细胞核糖核酸酶P(RP)基因作为临床样本的内参基因,用Primer Express 3.0软件设计PCR特异性引物和探针,建立一种检测FluA及HPAI-H5N6病毒的一步法多重荧光定量RT-PCR方法,评估其灵敏度、特异性,并与上海之江公司提供的试剂及测序法进行比较。结果建立的多重荧光定量RT-PCR法检测FluA、H5、N6及RP质粒标准品的灵敏度均达102copies/m L。各对引物和相应探针仅检测出相应的病毒,在这些病毒和常见病原分析中未发现存在交叉反应,特异性达100%。用该法检测135例临床标本,结果显示FluA为23例,未发现HPAI-H5N6病毒的感染者;与上海之江公司提供的试剂的检测结果及基因测序结果一致。结论建立的一步法多重荧光定量RT-PCR法可用于FluA及HPAI-H5N6病毒感染患者的早期诊断。     

两种定量测定丙型肝炎病毒核酸的聚合酶链反应方法比较

目的：观察荧光定量聚合酶链反应（PCR）PE5700测定丙型肝炎病毒RNA的准确性。方法：所用临床评价血清盘由36份血清组成,其中包括1个5倍倍比稀释系列（7份）、9份阴性血清和20份阳性血清。使用临床评价血清盘比较2种测定方法的重复性、线性和临床样本符合情况。结果：实时荧光定量方法和全自动PCR－ELISA内标法检测系统的线性回归系数分别为0．9732和0．9995。全自动PCR酶联免疫附（ELISA）内标法检测系统不同含量的样本批内变异系数（log10)均比实时荧光定量方法低。临床样本的检测实时荧光定量方法与全自动PCR－ELISA内标法检测系统的相关系数为0．845,结论：实时荧光定量方法具有良好的线性和重复性,同时与全自动PCR－ELISA内标法检测系统有良好的相关性。     

双重荧光定量RT-PCR法检测柯萨奇病毒A2和A5型

目的建立同时检测柯萨奇病毒A2和A5型(CVA2、CVA5)的双重实时荧光定量RT-PCR法。方法用Primer Express3.0软件设计高度特异性引物和荧光标记探针。通过优化反应体系,建立标准曲线,并评价双重荧光定量RT-PCR法的特异性、灵敏度和重复性。用建立的方法检测367例疑似手足口病患儿的粪便标本,并对阳性结果测序验证。结果荧光定量RT-PCR结果表明本实验所选的引物和探针可特异性检测并区分出CVA2、CVA5亚型,与其他肠道病毒的阳性核酸未发生交叉反应。该方法最低检测限达到102copies/m L,批内变异系数(CV)均1.49%。367份临床标本中CVA2型阳性23份,阳性率6.3%;CVA5阳性11份,阳性率3%,检测阳性结果与测序结果一致。结论成功建立了在单管中同时检测并鉴别CVA2、CVA5型的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法具有较好的灵敏度、特异性、重复性,可用于CVA2、CVA5型引起的暴发疫情的快速筛查和手足口病的流行病学的研究。     

EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立

目的 建立以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测猪细小病毒(PPV)的方法,为血液制品中病毒去除效果的工艺验证提供高效准确的技术平台.方法 根据PPV的VP2基因保守序列,设计并合成引物.对目的片段进行PCR扩增,将扩增的PPV病毒VP2基因片段克隆入PMD19-T载体,重组质粒PMD19-T-VP2经测序鉴定正确后,作为标准品模板,用于标准曲线的绘制和该实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性检测的材料.结果 应用重组质粒PMD19-T-VP2制作的荧光定量PCR扩增曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系;该方法检测灵敏度的下限能达到102copies/μl;与其他DNA病毒和同种属的细小病毒无明显的交叉反应;连续重复检测高、中、低浓度样品,批内批间变异系数小,重复性好.结论 以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测PPV的方法提高了检测灵敏度,缩短了工艺验证的时间.     

应用TaqMan荧光定量PCR技术建立HIV前病毒检测方法

目的建立HIV前病毒荧光定量PCR检测方法。方法常规培养8E5／LAV细胞，收集后计数，提取HIV前病毒核酸，运用实时荧光定量PCR法扩增晚期逆转录基因片段（HIVFL）。结果建立的实时荧光定量PCR技术检测灵敏度可达1拷贝，扩增结果稳定可靠。结论成功建立了HIV前病毒检测方法，为今后筛选和鉴定潜伏感染细胞以及评价抗-HIV药物的治疗效果奠定基础。     

双重荧光定量RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用

目的建立检测肠道病毒(EV)、B1型柯萨奇病毒(CVB1)的双重荧光定量RT-PCR法。方法用Primer Express 3.0软件设计特异性引物和探针,优化双重荧光定量RT-PCR反应体系,建立标准曲线并评价该法的灵敏度、特异性和重复性,用该法检测150份病毒性心肌炎患儿治疗前肛拭子和29份治疗后粪便标本,并与文献提供的PCR法进行对比。结果该法对EV、CVB1型肠道病毒检测具有较高特异性,检出限均为2×10-2TCID50/mL;具有较好的重复性,CV均<2.3%;标准曲线的相关系数(r2)分别为0.999和0.997,扩增效率(%)分别为98.809和96.564;179份临床标本用该法检测95份为EV病毒,其中59份为CVB1病毒,与文献提供的PCR法结果符合率为98.88%(P均>0.05)。结论建立的双重荧光定量RT-PCR法可同时检测并区分EV和CVB1型病毒,适用于病毒性心肌炎临床标本的检测。     

应用双重实时荧光定量反转录-聚合酶链反应方法同时检测A组轮状病毒和星状病毒

目的建立能同时检测轮状病毒A群和星状病毒双重实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法。方法根据上述2种病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析多重rRT-PCR的重复性、特异性、敏感性;以所建立方法对128例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果所建立的双重rRT-PCR检测方法对轮状病毒A群和星状病毒具有很好的特异性和重复性,轮状病毒A群灵敏度达到每个反应101拷贝,星状病毒灵敏度达到每个反应102拷贝。128例粪便标本中,轮状病毒A群和星状病毒的检出率分别为18.0%和3.1%。通过基因测序比对结果相符。结论构建可用于轮状病毒A群及星状病毒的双重rRT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

辛德比斯病毒和伪狂犬病毒制备方法的优化

目的优化辛德比斯病毒(Sindbis virus)和伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)的培养和制备方法,建立高效价病毒制备方法。方法从选用不同宿主细胞、不同的宿主细胞培养方式、以及不同的病毒悬液收集方式3方面考察病毒效价。病毒效价测定采用细胞病变法,按Karber氏法计算病毒效价。结果用非洲绿猴肾(Vero)细胞培养的Sindbis病毒效价(8.63±0.45)明显高于用幼仓鼠肾(BHK)细胞培养的病毒效价(7.63±0.30)(P<0.05);用Vero细胞培养的PRV效价(8.13±0.59)也明显高于用BHK细胞培养的病毒效价(6.94±0.71)(P<0.05);宿主细胞长满单层后继续换液培养或再传代培养2种提高病毒效价的方式所制备的病毒效价(7.69±0.98vs 7.54±0.69)的差异无统计学意义(P>0.05),可任选其一;收获病毒时,直接收集培养悬液离心组(直收-冻组)病毒效价(8.66±0.83)较先冻融2次再离心组(冻-收-冻组)病毒效价(8.14±0.91)高(P<0.05)。结论建立了制备高效价Sindbis病毒和PRV的方法;制备Sindbis病毒和PRV宜选用Vero细胞;病毒培养悬液直接离心分装即可,既简化操作又可获高效价病毒。     

乙型肝炎病毒外膜大蛋白临床意义及其与病毒复制的相关性

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）外膜大蛋白（LHBs）与 HBV 复制的相关性。方法随机收集深圳市第四人民医院2013年8～11月乙型肝炎患者血清标本170例,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 LHBs ,电化学发光法检测 HBV 表面抗原（HBsAg）及 HBV e 抗原（HBeAg）,实时荧光定量聚合酶链反应方法检测 HBV‐DNA 。按 HBeAg 结果分为 HBeAg 阳性组（58例）和 HBeAg 阴性组（112例）。比较 LHBs 和 HBV‐DNA 的阳性率,同时分析 LHBs 水平与 HBsAg 浓度及 HBV‐DNA 拷贝数的相关性。结果 HBeAg 阳性患者血清中,LHBs 阳性率与 HBV‐DNA 阳性率差异无统计学意义（χ2＝0．342,P ＞0．05）;HBeAg 阴性患者血清中,LHBs 阳性率与 HBV‐DNA 阳性率有统计学意义（χ2＝5．349,P＜0．05）。 LHBs 水平与 HBV‐DNA 拷贝数（r＝0．979,P＜0．05）、HBsAg 浓度（r＝0．923,P＜0．05）呈正相关。结论 LHBs 是从蛋白水平反映乙型肝炎患者体内病毒复制情况的可靠指标,尤其是对 HBeAg 阴性患者抗病毒治疗和预后判断有重要意义。     

EB病毒感染机制及临床研究进展

EB病毒（EBV）属于疱疹病毒γ亚科,是双链DNA病毒,人群普遍感染。其可逃避机体的免疫攻击,在B淋巴细胞内建立持续终身的潜伏感染。EBV感染可引起机体不同程度的免疫反应,可累及机体几乎所有脏器和组织,引起多种非恶性淋巴增殖性疾病、肿瘤性疾病及自身免疫病等。EBV的实验室检查有助于EBV感染的诊断及感染时相的判别。EBV感染机制复杂,感染后临床疾病谱广,轻重不一,预后千差万别,了解EBV感染机制及其相关疾病的预后情况及预后相关因素,对临床上进行更好的预防及治疗有重大意义。本文就EBV感染相关疾病、临床检测、治疗及预后的研究进展作一综述。     

Simultaneous diagnosis of dengue virus,Chikungunya virus,and Zika virus infection using a new point-of-care testing (POCT) system based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method

IntroductionDengue fever, Chikungunya fever, and Zika virus infection have similar symptoms and overlapping areas of endemicity and so cannot be distinguished clinically. Rapid diagnosis tests are available for each infection but each test covers only single target. There are PCR-based methods available that test for all three infections simultaneously, not applicable for in-vitro diagnostic use. The aim of this study was to evaluate the diagnostic accuracy of a new point-of-care testing (LAMP POCT) based on loop-mediated isothermal amplification method that tests for all three viruses simultaneously, using serum or urine samples, and takes about 45 min.MethodsLAMP POCT was evaluated as the comparator on 67 individuals, of whom 56 had dengue, three had Chikungunya, two had Zika virus infection and six did not have any kind of these infections confirmed by RT-PCR.ResultsAmong individuals with dengue, the sensitivity of LAMP POCT was 100% in samples collected in the first 3 days after illness onset, all three patients with Chikungunya were LAMP POCT positive, and both patients with Zika virus infection were LAMP POCT negative. There were no false-positive test results.ConclusionsLAMP POCT has potential utility as a point-of-care combination test for dengue and Chikungunya viruses, but further prospective studies are needed among individuals with Chikungunya virus and Zika virus infection, using serum and urine samples.     

140例成人人类免疫缺陷病毒感染与丙型肝炎病毒感染相互影响

目的 了解经输血或单采浆献血感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的患者中丙型肝炎病毒(HCV)的感染率；分析HIV与HCV感染的相互影响。方法 对140例经输血或单采浆献血感染HIV的患者血清抗HCV、HBV—M、肝脏生化功能、CD4^ 和CD8^ 细胞计数、纤维胃镜、肝胆脾B超进行分析。结果 140例HIV感染和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者中HCV抗体阳性者占91．5％(128／140)；HIV和HCV混合感染者肝功能损害较轻，与单纯HIV感染者比较，其肝功能、B超改变、CD4^ 细胞计数之间差异无统计学意义。结论 经输血或单采浆献血感染的HIV感染者中存在着极高的HCV感染(91．5％)。HIV和HCV混合感染者与单纯HIV感染者比较，肝功能损伤并不严重，提示HIV可能并不加速丙型肝炎的进展。     

Replication and expression of a recombinant Sindbis virus in mosquitoes

A recombinant Sindbis virus, TE/3'2J/ANTI-S, containing LaCrosse virus small segment cDNA in antisense orientation, was inoculated into Aedes triseriatus mosquitoes. Virus replication and LAC-ANTI-S RNA expression were analysed temporally and spatially. TE/3'2J/ANTI-S virus titre peaked at 5.0 log₁₀ TCID₅₀ in heads 6–9 days post infection (p.i.) and decreased to 3.4 log₁₀ TCID₅₀ by 37 days p.i. Salivary glands contained 4.4 log₁₀ TCID₅₀ of virus 6 days p.i.; titres were lower in other organs. LAC-ANTI-S RNA levels paralleled virus titre. SIN E1 antigen was detected in many mosquito organ systems, but in specific cells and tissues of some organs. TE/3'2J/ANTI-S virus exhibited different cellular tropisms in salivary glands of Aedes and Culex mosquitoes.     

Oncolytic vaccinia virus for the treatment of cancer

Introduction: Gene therapy offers promising approaches for the development of anticancer agents with new modes of action. Among gene therapy vectors, vaccinia virus has emerged as an attractive agent especially when used as an oncolytic virus.

Areas covered: This review describes the use of vaccinia virus in cancer therapy as a gene therapy vector, as an oncolytic virus and in the generation of oncolysates. The main achievements of each field are summarized with a special emphasis on vaccinia as an oncolytic vector and its combination therapies. The virus that has advanced furthest in clinical trials, GM-CSF expressing JX-594, is described in detail and its preclinical and clinical data are reviewed.

Expert opinion: Vaccinia virus has great potential in cancer gene therapy, especially when used as an oncolytic virus. In particular, JX-594 has shown promising preclinical and clinical data, and a multi-continental randomized Phase III trial in hepatocellular carcinoma is expected to start soon.     

自噬与乙型肝炎病毒复制的关系

目的：探究自噬与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制之间的相互关系。方法利用 HepG2细胞,转染绿色荧光标记的微管相关蛋白轻链3(GFP-LC3),分别在正常和饥饿条件下培养,另共转染 HBV WT 和GFP-LC3,正常条件培养,免疫荧光观察细胞自噬;分别转染1.3 mer HBV 野生型质粒(HBV WT)与 HBV 突变型(HBV X-)质粒,正常和饥饿两种条件下培养,蛋白印迹检测自噬相关蛋白 LC3和乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的表达;细胞转染 HBV WT 后,分别正常条件培养(对照组),无血清饥饿培养(饥饿组),加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)培养(3-MA 组),采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞上清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎 e 抗原(HBeAg)的含量。结果转染 HBV WT 质粒的细胞内自噬荧光颗粒较对照组明显增加发生自噬的细胞比例分别为13%和2%;饥饿组 HBsAg 含量(1.856±1.415)较对照组(1.531±0.944)升高,HBeAg 含量(0.533±0.391)较对照组(0.334±0.110)升高,差异具有统计学意义(P <0.05);自噬抑制剂组 HBsAg 含量(1.184±0.759)较饥饿组(1.856±1.415)降低,HBeAg 含量(0.306±0.130)较饥饿组(0.533±0.391)降低(P <0.05);蛋白印迹显示,转染HBV WT 质粒的细胞中 LC3蛋白表达较 HBV X-组增高,且在饥饿条件下,HBc 蛋白的表达增高。结论乙型肝炎病毒可诱导细胞自噬的发生,且自噬可促进乙型肝炎病毒的复制。     

环介导的等温扩增技术对HBV、HCV和HIV核酸检测的研究

目的建立环介导的等温扩增技术(LAMP)对HBV、HCV和H IV核酸检测的方法并对检测灵敏度和特异性作初步考核。方法通过引物设计和筛选、内质控的设计与时间分辨浊度检测方法的运用,建立LAMP HBVDNA、HCV RNA和H IV RNA扩增体系;用连续稀释的阳性样本和不含任何病毒核酸的正常人血浆考核所建立的LAMP扩增体系的灵敏度和特异性。结果建立了LAMP HBV DNA扩增体系及HCV/H IV RNA双联检体系,该体系对5 CP/m l的HBV DNA样本的检出率为51.85%,对100 CP/m l的HCV RNA阳性样本的检出率为61.90%,对100 CP/m l的H IV RNA阳性样本的检出率为45%。对考核样本检测的相对灵敏度和特异性均为100%。结论LAMP HBV、HCV和H IV检测灵敏度较高,在进一步优化以后能用于HBV、HCV和H IV的核酸检测。     

系统性红斑狼疮患者EB病毒和人疱疹病毒6型感染的探讨

目的探讨EB病毒(EBV)和人疱疹病毒6型(HHV 6)感染在系统性红斑狼疮(SLE)中的作用。方法采用巢式聚合酶链反应(PCR)检测SLE患者和正常对照者外周血中HHV 6 DNA;应用逆转录PCR(RT-PCR)和Southern杂交技术,检测EBV阳性标本增殖期基因BZLF1、BARF1和BcLF1的表达。结果SLE患者组EBV阳性率高于对照组(P=0),但HHV 6阳性率与对照组差异无显著性(P=0.735 4),SLE患者EBV与HHV 6检出率有明显相关性(P=0.015 9)。32例EBV DNA阳性者中有2例检出BARF1 mRNA,均为活动期,且HHV 6DNA阳性。16例BcLF1 mRNA阳性者中有14例HHV 6 DNA阳性,相关性好。均未检测到BZLF1的表达。结论SLE患者EBV阳性率和BcLF1 mRNA的表达均与HHV 6有明显相关性,SLE患者中可能存在EBV和HHV 6的相互激活作用。