葛根素抑制酒精导致细胞成脂分化研究的初步报告

目的探讨葛根素对酒精诱导人骨髓间充质细胞（MSCs）成脂分化的抑制作用。方法采用梯度离心法分离、培养人MSCs。取传代细胞,随机分为三组：对照组、模型组（酒精组）和实验组（酒精＋葛根素）。检测细胞内碱性磷酸酶（AIP）活性;油红“0”染色,脂肪细胞计数。结果分组干预10d,模型组细胞内ALP活性[（27±10）U／100mg蛋白]明显降低,显著低于实验组[（40±10）U／100mg蛋白]和对照组[（39±9）U／100mg蛋白],P〈0．05。实验组细胞内AIJP活性,与对照组比较差异无统计学意义,P〉0.05。干预21d,模型组脂肪细胞最多,实验组较模型组明显减少（P〈0．05）,对照组几乎无脂肪细胞出现。结论葛根素能抑制酒精诱导成人MSCs向脂肪细胞分化,保持其成骨分化能力。     

酒精性骨坏死发病机制的分子生物学实验研究

目的 :观察酒精诱导骨髓基质细胞 (Marrowstromalcells ,MSCs)的作用 ,揭示酒精性股骨头坏死新的发病机制。方法 :采用原代MSCs体外培养技术 ,取小鼠股骨骨髓细胞 ,分离获取MSCs。以酒精作为脂肪细胞分化诱导剂处理细胞 ,以苏丹Ⅲ染色 ,光镜下计数脂肪细胞。并测定细胞内甘油三酯、碱性磷酸酶活性和培养液中骨钙素含量。采用完整细胞斑点印迹分子杂交方法检测酒精 ( 0 .0 9mol/L)组和对照组细胞中 42 2(aP2 )mRNA和Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果 :以递增浓度酒精 ( 0 .0 3、0 .0 9、0 .15mol/L)处理细胞 2 1d ,MSCs分化生成的脂肪细胞数量随酒精作用时间延长及浓度增大而增多 ,具有一定时间、剂量依赖性。与对照组相比 ,细胞内甘油三酯含量明显增高 ,碱性磷酸酶活性随酒精浓度增大而降低 ,培养液中骨钙素含量显著减少。实验组中 42 2 (aP2 )mRNA表达含量 72 0 7.8± 3 3 1.3 ,显著高于对照组 65 2 .2± 62 .6,P <0 .0 0 1。其Ⅰ型胶原mRNA表达含量 3 5 67.3± 3 0 0 .9,明显低于对照组 7487.0± 488.4,P <0 .0 0 1。结论 :酒精能够从基因调控水平诱导MSCs大量分化为脂肪细胞 ,成骨分化减少 ,这可能是长期酗酒后股骨头骨髓内脂肪组织增多 ,骨内压增加 ,血流灌注减少 ,导致缺血 ,同时骨修复能力不足 ,从而发生     

地塞米松对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响

目的:观察不同浓度的地塞米松(Dex) 对人乳腺癌细胞系(MCF-7) 细胞增殖、细胞周期分布及P21/WAF1表达的影响.方法:以不同浓度Dex(10-10～10-6 mol/L)处理细胞,采用活细胞计数法观察细胞增殖情况;测定碱性磷酸酶(AKP)活性;通过流式细胞仪技术,测定Dex作用后其细胞周期分布;通过蛋白印迹分析的方法检测Dex对p21/WAF1表达的影响.结果:Dex对MCF-7细胞的增殖有明显抑制作用, 10-7mol/L Dex作用5 d后活细胞计数为对照组的70%,细胞在G0/G1期停滞; Dex还可使MCF-7 细胞AKP活性增高,这种作用具有时间和剂量依赖性;Dex对p21/WAF1表达无明显影响.结论:Dex对MCF-7细胞有明显的增殖抑制作用,细胞在G0/G1期停滞.     

辛伐他汀对酒精诱导大鼠骨髓基质细胞成脂及成骨基因表达的影响

目的观察辛伐他汀对酒精诱导大鼠骨髓基质细胞成脂及成骨基因改变的影响,探讨辛伐他汀治疗酒精性骨坏死的可能性。方法分离培养SD大白鼠骨髓基质细胞（MSCs）,随机分为三组：模型组：第1周以含终浓度0．09mol／L酒精的培养液培养,第2周停用酒精,实验组：第1周以含终浓度0．09mol／L酒精的培养液培养,第2周停用酒精,改以含终浓度1×10^-7mol／L辛伐他汀的培养液培养;对照组：全程以不加酒精和辛伐他汀的培养液培养。于实验第14天时收集细胞,以RT—PCR检测细胞中过氧化物酶体增殖子激活受体-γ（PPARγ）mRNA和骨钙素（OC）mRNA的表达。实验数据以均数±标准差（x^-±S）表示,采用SPSS10．0软件进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,样本均数间的两两比较采用LSD—t检验,检验水准仪=0．05。结果与对照组比较,模型组细胞PPARγmRNA表达水平明显升高（P〈0．05）,实验组细胞PPARγmRNA表达水平稍高（P〉0．05）;与对照组比较,模型组OCmRNA表达水平明显降低（P〈0．05）,实验组OCmRNA表达水平稍低（P〉0．05）。结论辛伐他汀能抑制酒精诱导MSCs成脂基因表达,对抗或解除酒精对MSCs的成骨分化的抑制而增加成骨基因表达,可能有治疗酒精性骨坏死的作用。     

QY1骨髓多能间质干细胞系多向分化潜能的检测

目的:检测QY1骨髓间质干细胞系在体外向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、血管内皮细胞和神经细胞分化的能力.方法:选用第5代QY1骨髓间质干细胞系,分别用成脂培养基、成软骨培养基、成骨培养基、5–氮胞苷、血管内皮生长因子、神经细胞培养液(诱导液1为10mmol/L β-巯基乙醇;诱导液2为2%二甲基亚砜和10-8mol/L地塞米松)对其进行定向诱导分化.采用染色法、免疫组化法、RT-PCR法鉴定分化后的细胞.结果:在成脂培养基培养21d左右出现大量含脂滴的脂肪细胞,苏丹III染色法检测脂肪细胞胞浆呈桔红色.在成软骨培养基培养21d左右有软骨结节形成,阿尔新蓝染色法将软骨结节染为深蓝色.在成骨培养基培养35d左右有凸出的骨结节形成,Von Kossa染色法显示有黑色矿化结节形成.在10μmol/L 5–氮胞苷诱导液中能出现自发性搏动的心肌细胞和肌管样结构,免疫组化法显示心肌特异性的表面抗体α-横纹肌肌动蛋白、心肌连接蛋白-43表达阳性,RT-PCR法检测有心肌特异性因子α-肌球蛋白重链表达.在含有50ng/mL血管内皮生长因子的诱导液中能出现呈直线排列的血管内皮细胞和血管内皮细胞网状结构,免疫组化法显示血管内皮特异性表面抗体CD31和VIII因子表达阳性.神经诱导液1处理组出现神经元,免疫组化法显示胶质纤维酸性蛋白表达阴性,神经元特异性核蛋白表达阳性;神经诱导液2处理组出现神经胶质细胞,免疫组化法显示胶质纤维酸性蛋白表达阳性,神经元特异性核蛋白表达阴性.结论:本研究证实QY1骨髓间质干细胞系细胞具有分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经元和神经胶质细胞的潜能,提示QY1骨髓间质干细胞系具有向多个胚层、7个方向分化的多向潜能.     

地塞米松抑制培养牛眼小梁细胞AQP1表达

目的测定地塞米松对体外培养牛眼小梁细胞水通道蛋白-1(aquaporin1,AQP1)表达的影响,探讨糖皮质激素性青光眼房水引流阻力的形成机制。方法将传3代的牛眼小梁细胞用数字表法随机分为对照和地塞米松处理组。将不同浓度的地塞米松(10-5、10-6、10-7mol/L)分别加入培养液持续培养14 d,免疫细胞化学方法检测小梁细胞AQP1表达水平,计算机图像分析软件测量细胞表面积。结果经不同浓度地塞米松处理后的小梁细胞AQP1表达量吸光度值A显著低于对照组(均P=0.000)。10-7mol/L地塞米松作用下细胞表面积显著大于对照组,而10-6mol/L和10-5mol/L地塞米松作用下细胞表面积显著低于对照组(均P=0.000)。结论地塞米松抑制牛眼小梁细胞AQP1表达,可能参与了糖皮质激素性青光眼的发生。     

神经肽Y Y1受体拮抗剂促进大鼠BMSCs成骨分化和股骨缺损修复

目的探索神经肽Y Y1受体拮抗剂（PD160170）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化以及骨缺损修复的影响。方 法第三代大鼠BMSCs成骨分化诱导培养,随机分为4组,对照组（等体积PBS）,终浓度分别为10-6、10-7、10-8 mol/L Y1受体拮抗 剂三浓度梯度组,在干预7、14 d时,分别进行碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色;在干预7、21 d时,采用q-PCR和Westen blot检测 I 型胶原（COLI）、骨钙素（OCN）和Runt相关转录因子2（Runx2）基因和蛋白的表达。采用300±20 g 雄性SD大鼠构建股骨髁 上骨缺损模型,直径为2.5 mm,随机分为3 组,每组6 只,分别每日局部注射0.2 mL溶液等体积PBS（对照组）、10-6 mol/L 和 10-8 mol/L Y1受体拮抗剂溶液,28 d后处死,Micro-CT检测观察骨缺损修复情况。结果ALP和茜素红染色发现,Y1受体拮抗 剂组细胞胞浆内棕色颗粒、细胞外周基质矿化结节均高于对照组,且具有浓度特异性,以10-8 mol/L最为明显;q-PCR及Westem blot检测发现,在成骨分化诱导第7天,10-8 mol/L Y1受体拮抗剂组COLI mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组,差异具有 统计学意义（P<0.05）;在第21天,10-8 mol/L Y1受体拮抗剂组OCN、Runx2 mRNA和蛋白表达明显高于对照组（P<0.05）。通过 micro-CT分析发现,在局部注射10-6 Y1受体拮抗剂28 d后,骨缺损BV/TV、骨密度、骨小梁数量高于对照组,差异均具有统计学 意义（P<0.05）;而骨小梁厚度（P=0.07）、骨体积（P=0.35）在各组之间差异无统计学意义。结论神经肽Y Y1受体拮抗剂可促进 BMSCs成骨分化以及骨缺损的修复,提示阻断Y1受体信号传导具有预防或治疗骨折、骨质疏松症等潜力,为临床药物研究提 供一定的实验依据。     

睾酮对3T3-L1脂肪细胞促酰化蛋白受体及下游信号蛋白的影响

目的:观察睾酮对3T3-L1(前)脂肪细胞促酰化蛋白(ASP)受体C5L2-mRNA和细胞表面C5L2蛋白表达的影响,以及睾酮对3T3-L1(前)脂肪细胞Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ蛋白以及ASP刺激的Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达的影响。方法:体外培养3T3-L1细胞,诱导细胞分化,用不同浓度睾酮作用于3T3-L1(前)脂肪细胞,孵育过夜后收获细胞,采用RT-PCR和流式细胞仪检测ASP受体mRNA和蛋白表达情况;采用Western Blot法检测基础状态和ASP刺激的Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达。结果:睾酮呈浓度依赖性均抑制3T3-L1成熟脂肪细胞C5L2-mRNA和蛋白的表达,10-6mol/L时mRNA和蛋白分别减少了60%(P<0.01)和27%(P<0.01)。但前脂肪细胞C5L2-mRNA和蛋白表达水平均无显著性差异。高浓度(10-6mol/L)睾酮在一定程度上抑制ASP刺激的成熟脂肪细胞Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ的表达,分别减少了52%(P<0.05),27%(P>0.05),50%(P<0.01)和57%(P<0.05);在前脂肪细胞,ASP-C5L2下游信号分子Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ表达无明显抑制作用。结论:睾酮抑制成熟脂肪细胞ASP信号分子表达,睾酮诱导ASP抵抗的发生机制与下调脂肪细胞表面ASP受体功能有关,与干扰ASP-C5L2信号转导途径有关。ASP抵抗参与了高睾酮引起的胰岛素抵抗状态的病理生理过程,ASP抵抗可能参与多囊卵巢综合征(PCOS)、肥胖症等多种疾病的病理生理过程。     

维甲酸对脂肪源干细胞中生殖标记表达的影响

目的探索脂肪源干细胞(ADSCs)在维甲酸(RA)诱导下是否表达原始生殖细胞标记碱性磷酸酶(ALP)及生殖标记基因vasa。方法分离培养2个月龄SD雌性大鼠ADSCs,传至第3代进行成脂、成骨诱导和表面标记鉴定。将第3代ADSCs分别用10-5、10-6、10-7mol/L RA诱导7 d和14 d,采用ALP检测试剂盒检测各组ALP的活性水平。用RT-PCR方法检测10-5mol/L RA组Vasa mRNA表达。结果将第3代ADSCs分别用10-5、10-6、10-7mol/L RA诱导7 d的D520 nm值分别为0.59±0.04,0.27±0.07,0.15±0.03,对照组为0.07±0.01,诱导14 d的OD值分别为0.42±0.02,0.34±0.01,0.19±0.02,对照组为0.07±0.01,说明RA能显著性促进ADSCs碱性磷酸酶的表达(P<0.01)。第3代ADSCs用10-5mol/L RA诱导7 d Vasa mRNA的表达为阴性。结论第3代ADSCs在维甲酸诱导下能够表达原始生殖细胞标记碱性磷酸酶,但用10-5mol/L RA诱导7 d不能表达生殖标记基因Vasa。     

碱性成纤维细胞生长因子对间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对间充质干细胞(MSCs)增殖的影响及其信号机制。方法:全骨髓贴壁法培养MSCs,流式细胞仪分析其表面MSCs标记(CD45、CD34、CD90、CD29)以及成骨、成脂肪等多向诱导分化潜能,鉴定其特征。MTT法分析不同浓度bFGF对MSCs增殖的影响,确立最佳浓度bFGF诱导MSCs增殖的时间特征,分别以磷脂酰肌醇3-激酶、促分裂素原活化蛋白激酶、磷脂酶C、蛋白激酶C、钙通道和钙泵选择性抑制剂等处理P3MSCs后,观察其对bFGF介导MSCs增殖的影响。结果:培养的MSCs表现CD90、CD29强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;bFGF诱导MSCs增殖呈时间和剂量依赖特征,5.4×10-4mol/L bFGF作用48 h时MSCs增殖达峰值;磷脂酶C阻断剂U73122、钙通道阻断剂和选择性蛋白激酶C阻断剂等明显抑制了bFGF所介导的MSCs增殖效应;尤其是非选择性PKC抑制剂Straurosporine、钙泵选择性抑制剂thapsigargin以及蓝尼定受体抑制剂Ryandoine均抑制bFGF所诱导的MSCs增殖。结论:bFGF通过Ca2+/PKC/Erk1/2途径促进MSCs的增殖。     

地塞米松对兔骨髓间充质干细胞存活增殖成骨的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)的持续生存能力及地塞米松对其存活、增殖、成骨分化能力的影响。方法:提取兔BMSCs,予不同浓度(0、10-9、10-8、10-7、和10-6mol/L)地塞米松,分别于1、3、5、7 d时观察地塞米松对BMSCs增殖的影响,作用1～4周后检测碱性磷酸酶水平;分别饥饿0～7 d,复苏1、3和7 d后,观察BMSCs的持续生存能力。结果:培养1 d地塞米松10-6mol/L组测得的OD值结果最高,而对照组结果最低,培养3、5、7 d时,地塞米松10-9mol/L组测得的OD值最高;同时,在2～4周10-9mol/L组增加碱性磷酸酶活性最明显;复苏1和3 d,对照组与饥饿1～7 d之间差异有统计学意义(均P<0.05),复苏7 d,各组两两之间差异无统计学意义(均P>0.05)。结论:BMSCs具有较强的持续生存能力,地塞米松对BMSCs有增加存活、促进增殖、成骨分化的作用。     

胰岛素、地塞米松、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对3T3-L1脂肪细胞脂肪水孔蛋白表达的调节作用

目的通过细胞培养研究胰岛素样生长因子-1(IGF鄄1)、地塞米松对成熟脂肪细胞水孔蛋白(Aquaporinadipose,AQPap)基因表达的影响,并与胰岛素的作用相比较,以此了解AQPap基因表达的影响因素,探讨其在肥胖及糖尿病发病中所起作用。方法用不同浓度(10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)的胰岛素、IGF鄄1(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)及地塞米松刺激液(10-6、10-7、10-8mol/L)刺激诱导分化第9天的3T3鄄L1细胞6h;提取细胞RNA,运用半定量RT鄄PCR技术,检测AQPapmRNA表达量的变化。结果与对照组相比,10-9mol/L胰岛素刺激细胞6h可使AQPap基因表达下降16%,10-6mol/L胰岛素使之下降超过50%。IGF鄄1也降低AQPap的基因表达,但相同浓度(10-7mol/L)刺激下,IGF鄄1的作用要弱于胰岛素(P<0.05)。地塞米松对AQPapmRNA的表达量无明显影响,不过,同时给予10-6mol/L的地塞米松和胰岛素与单用10-6mol/L胰岛素相比,AQPapmRNA的表达量有所上升(P<0.05)。结论胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap的表达起抑制作用,并呈剂量及时间依赖性。IGF鄄1也有抑制作用,但较胰岛素弱。地塞米松能够拮抗胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap基因表达的下调作用。     

VEGF-165基因修饰的MSCs诱导分化后治疗兔股骨头缺血性坏死的实验研究

目的：探讨VEGF-165基因联合单纯骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stemcells,MSCs）治疗激素性股骨头坏死的可行性。方法：1）体外分离、培养兔MSCs,纯化并鉴定兔MSCs;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后以1μgPeDNA3．1-hVEGF165：3μl阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染,通过ELISA检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。2）测定在正常条件培养和成骨备件培养下,转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。3）实验动物连续三天大剂量（40mg／kg）臀部肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠,通过MRI和组织病理学检查,建立动物模型。4）随机分成4组,每组14只。经皮穿刺于右侧股骨头,（1）生理盐水组,（2）单纯MSCs组,（3）hVEGF165基因转染MSCs组,（4）诱导分化后的hGVEF165基因转染MSCs组。8周后,组织病理学检查成骨和细胞成活情况。结果：1）hVEGF165基因转染的MSCs能成功分泌VEGF蛋白。2）成骨条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组（P〈0．05）;而在正常条件培养下,基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。3）成功建立ANFH模型。4）组织学评分：生理盐水组1．8±0．72;单纯MSCs组8．54±0．37;hVEGF165基因转染MSCs组11．96±0．26;诱导分化后的hGVEF165基因转染MSCs组13．7±0．43,各组间差异有显著性（P〈0．05）。诱导分化转基因干细胞组与单纯干细胞组和生理盐水组之间差异非常显著（P〈0．01）。结论：诱导分化后的hVEGF165基因转染MSCs组成骨能力更好,修复股骨头缺血性坏死的能力也是最强。     

地塞米松对马兜铃酸诱导的人肾小管上皮-间充质转化的作用及可能机制

目的探讨地塞米松(Dex)对马兜铃酸诱导的肾小管上皮-间充质转化(EMT)的影响及可能机制。方法体外培养的人肾小管上皮细胞(HKC)分为阴性对照组、马兜铃酸(AA,10μg/ml)作用组、Dex(100μmol/L)作用组、AA(10μg/ml)+无水乙醇(100μmol/L)组、AA(10μg/ml)+Dex(100、10、1、0.1、0.01μmol/L)共同作用组,培养细胞48h,应用激光共聚焦显微镜(CFMS)观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)的表达,采用Real-timePCR和WesternBlot方法检测α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad7mRNA和蛋白的表达。结果 AA作用48h后,CFMS观察发现HKC细胞E-cadherin表达减弱而α-SMA表达增强;地塞米松干预后,E-cadherin表达逐渐增强而α-SMA表达减弱,且呈剂量依赖性。Real-timePCR、WesternBlot结果均显示,与阴性对照组相比,AA组α-SMA、p-Smad3、TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均显著增强,E-cadherin、Smad7mRNA和蛋白的表达均减弱(P0.05)。同AA作用组比较,AA+Dex共同作用组随Dex剂量增加,α-SMA、p-Smad3、TGF-β1mRNA和蛋白的表达逐渐减弱,E-cadherin、Smad7mRNA和蛋白的表达逐渐增强(P0.05),而无水乙醇却无此作用。结论 Dex可抑制AA诱导HKC细胞发生EMT,并同时下调EMT过程中TGF-β1和p-Smad3的表达、上调Smad7分子的表达,提示TGF-β1/Smad下调可能是Dex抑制EMT发生的机制之一。     

孕酮对脂肪细胞促酰化蛋白受体和下游信号蛋白表达的作用

目的 观察孕酮对3T3-L1(前)脂肪细胞促酰化蛋白(ASP)受体C5L2 mRNA和细胞表面C5L2蛋白表达的影响,以及孕酮对ASP下游信号蛋白的作用.方法 体外培养3T3-L1细胞,诱导细胞分化,不同浓度孕酮作用于3T3-L1(前)脂肪细胞,孵育过夜后收获细胞,分别采用RT-PCR和流式细胞仪检测ASP受体mRNA和蛋白表达情况;采用Western印迹法检测基础状态和ASP激发后Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ蛋白表达.结果 孕酮最大抑制成熟脂肪细胞14% C5L2 mRNA (P＞0.05)和蛋白表达22%(36%±15%vs 46%±12%,P＜0.01),高浓度孕酮(1 × 10-6 mol/L)能显著性抑制前脂肪细胞66%C5L2 mRNA(0.17±0.11 vs 0.50±0.18,P＜0.01)和29%C5L2蛋白表达(36%±16%vs 51%±20%,P＜0.05).高浓度孕酮在一定程度上抑制ASP激发后成熟脂肪细胞Gαq/11,Gβ,p-PKCα和p-PKCζ的表达,各蛋白表达分别减少了41%(0.71±0.21 vs 1.20 ±0.24,P＜0.05),63%(0.55±0.32 vs 1.48±0.40,P＜0.05),49%(0.53±0.20 vs 1.04 ±0.19,P＜0.01)和32%(0.36 ±0.10 vs 0.53 ±0.20,P＞0.05).在前脂肪细胞,高浓度孕酮显著性抑制ASP刺激的59%Gαq/11(0.42 ±0.18 vs 1.04±0.28,P＜0.01),43%Gβ(0.77 ±0.09 vs 1.35 ±0.27,P＜0.05),51%p-PKCα(0.44 ±0.15 vs 0.90 ±0.25,P＜0.05)和30%p-PKCζ(0.27±0.08vs 0.39±0.12,P＜0.05)蛋白表达.结论 孕酮诱导ASP抵抗的发生,ASP抵抗参与了高浓度孕酮引起的脂肪细胞胰岛素抵抗状态的病理生理过程.     

睾酮对3T3-L1脂肪细胞炎症因子生成的影响及其机制研究

目的 探讨睾酮对3T3-L1成熟脂肪细胞炎症因子生成的影响及分子机制.方法 3T3-L1前脂肪细胞诱导成熟,采用不同浓度睾酮(10-9、10-7、10-5mol/L)分别处理10～30 min及12、24及48 h后,提取上清液用ELISA法检测炎症因子白介素6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的浓度;RT-PCR检测细胞内IL-6、MCP-1mRNA的生成;免疫印迹检测核因子-κB(NF-κBp65)的磷酸化及表达.随后再用10-4mol/L NF-κB的抑制剂吡咯二烷二硫氨基甲酸(PDTC)预处理2 h,再加入睾酮,再观察上述结果的变化.结果 (1)与无睾酮组相比,睾酮3种浓度处理组3T3-L1脂肪细胞上清液IL-6、MCP-1的含量均明显增多(P<0.05),以10-5moL/L睾酮处理24 h时上清液两种因子含量较其他处理组明显增多(P<0.05).与无睾酮组相比,睾酮3种浓度处理组3T3-LI脂肪细胞12 h时,IL-6、MCP-1 mRNA的水平明显增加(P<0.05),以10-5moL/L睾酮处理12 h时两种因子的mRNA水平较其他组明显增加(P<0.05);(2)睾酮3种浓度短时间(10～30 min)处理3T3-L1脂肪细胞时,与无睾酮组相比,均可使NF-κBp65的磷酸化增加(P<0.05),其中以10-5mol/L的作用最明显(P<0.05);睾酮处理3T3-LI脂肪细胞12 h时,NF-κB p65的磷酸化明显增加(P<0.05),其中以10-9和10-5mol/L组较其他组作用明显(均P<0.05);(3)用NF-κB的抑制剂PDTC预处理2 h后,再用睾酮处理,上清液两种因子含量及其mRNA水平明显降低(均P<0.05).结论 睾酮可通过NF-κB途径促进成熟脂肪细胞炎症因子的分泌.     

睾酮对胰岛素敏感细胞胰岛素受体底物1和葡萄糖转运载体4表达的影响

目的探讨雄激素对胰岛素敏感性影响的可能的分子机制。方法诱导3T3-L1前脂肪细胞系和C2C12成肌细胞系分别分化为3T3-L1脂肪细胞和C2C12骨骼肌细胞,然后对这两种细胞分别以10-9mol/L睾酮处理4、8、12、24及48h,并以不同浓度(10-12~10-5mol/L)的睾酮处理24h,用Western印迹的方法检测两种细胞在以两种方法处理后胰岛素受体底物1(IRS-1)和葡萄糖转运载体4(GLUT4)表达的变化。结果随着10-9mol/L浓度的睾酮处理时间的延长,IRS-1和GLUT4在两种细胞的表达逐渐增加,IRS-1于12h达峰后下降。3T3-L1脂肪细胞及C2C12骨骼肌细胞中12h峰值分别是0h对照的(1·42±0·42)倍和(1·53±0·14)倍,均P<0·05;GLUT4于24h达峰后表达下降[3T3-L1脂肪细胞及C2C12骨骼肌细胞中24h峰值分别是0h的(3·22±0·10)倍和(5·17±1·06)倍,均P<0·05]。当睾酮处理浓度从10-12mol/L逐渐增加时,IRS-1在两种细胞的表达逐渐增加,于10-9mol/L达峰值后表达逐渐下降[在3T3-L1脂肪细胞和C2C12骨骼肌细胞,10-9mol/L睾酮处理后的峰值较空白对照分别增加(4·23±0·27)倍和(3·16±0·15)倍,均P<0·05]。GLUT4在C2C12骨骼肌细胞的表达随着睾酮浓度的升高有增加的趋势[经10-7mol/L睾酮处理后的表达量是空白对照的(2·99±0·15)倍,P<0·05,于10-7mol/L后增加趋势不明显。在3T3-L1脂肪细胞中,GLUT4的表达于10-11mol/L达峰值[较空白对照增加(2·58±0·02)倍,P<0·05],然后随着睾酮浓度的升高表达下降。结论睾酮影响胰岛素信号转导分子的表达存在剂量和时间上的双向作用。     

IR-3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞的建立

目的探讨3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞（insulin resistant 3T3-L1 adipocytes cell, IR-3T3-L1）最佳的建立条件。方法采用
地塞米松（Dexamethason,DEX）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（3-isobutyl-methylxanthine, IBMX）和不同浓度的胰岛素（10-8、10-7、
10-6 mol·L-1）诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,Oil red O染色确定最佳胰岛素诱导浓度,继而用1 μmol·L-1 DEX
诱导建立IR-3T3-L1 脂肪胰岛素抵抗细胞。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（Glucose oxidase-peroxidase, GOD-POD）法对
IR-3T3-L1细胞的最佳诱导时间（24~120 h）及其稳定时间（24~48 h）进行了考察。结果Oil red O染色发现3T3-L1前脂肪细胞
用DEX、IBMX和10-6 mol·L-1胰岛素诱导9 d,>90% 的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞;用1 μmol·L-1 DEX培养96 h后,脂肪
细胞葡萄糖消耗率达到最大（P=0.0003）;稳定时间考察发现,在36 h内葡萄糖消耗与对照组比较有统计学意义（P<0.001）。结
论3T3-L1前脂肪细胞在1 μmol·L-1 DEX、0.5 mmol·L-1 IBMX 和10-6 mol·L-1最佳胰岛素浓度作用下诱导分化为成熟的脂肪细
胞后,用1 μmol·L-1 DEX培养96 h即可成功诱导成IR-3T3-L1-IR脂肪胰岛素抵抗细胞,且在36 h内稳定。
     

葛根素预防酒精性股骨头坏死的实验研究

目的:从细胞学和动物学实验观察葛根素预防酒精性股骨头坏死的作用。方法:①细胞学实验:分离培养小鼠骨髓基质细胞,随机分为3组:A.模型组(给予酒精0.09mol/L处理细胞),B.实验组(酒精0.09mol/L和葛根素终浓度为0.01mg/ml),C.对照组(无酒精和葛根素)。苏丹Ⅲ染色,光镜下脂肪细胞计数;测定细胞内甘油三酯含量、碱性磷酸酶活性和细胞培养液中的骨钙素含量。10天后收集细胞,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,检测各组细胞中成脂转录因子PPARγ mRNA和成骨基因Osteocalcin mRNA的表达。②动物学实验:取4周龄健康昆明小白鼠300只,随机分为3组,A组:灌胃法给予烈性白酒(含乙醇46%)20mL/(kg.d),肌注Ns10ml/(kg.d);B组:同法给予等量白酒,肌注葛根素注射液0.5g/(kg.d);C组(对照组):同法给予普通饮用水20mL/(kg.d),肌注NS10ml/(kg.d)。于实验4、6、8、10个月分批处死动物,检测动物的血清学、肝脏和股骨头组织学、基因表达等变化。结果:(1)细胞学实验:上述处理细胞并培养21天后,实验组中脂肪细胞数量、细胞内甘油三酯含量均明显低于模型组(P<0.001),且与对照组差异不显著(P>0.05)。上述处理细胞并培养12天后实验组中细胞内碱性磷酸酶活性、细胞培养14天后培养液中骨钙素含量,均明显高于模型组(P<0.001),且与对照组差异不显著(P>0.05)。实验组和对照组细胞中PPARγmRNA的表达明显低于模型组(P<0.05),而对照组与实验组间的差异无显著性(P>0.05)。实验组和对照组细胞中OsteocalcinmRNA表达明显增高,分别是模型组的1.9倍和2.4倍(P<0.01),而实验组与对照组间的差异无显著性(P>0.05)。(2)动物学实验:实验6个月时:①3组血清CHO、TG、ALP分别为:(6.39±0.49)、(3.19±0.11)、(2.98±0.36)mmoL/L,(1.01±0.15)、(0.71±0.13)、(0.68±0.22)mmol/L,(161.6±32.44)、(196.5±31.52)、(203.4±22.83)IU。②A组出现脂肪肝,股骨头骨小梁变细稀疏,髓内造血组织减少,脂肪与空骨陷窝明显增多。B组股骨头内脂肪稍增加,空骨陷窝比正常C组少。3组最大脂肪细胞平均直径和空骨陷窝计数分别为(40.02±3.25)、(39.15±3.67)、(38.51±3.09)μm,(13.5±1.6)、(9.8±2.2)、(10.3±2.7)%。③A组中PPARγmRNA呈高表达,Osteocalcin mRNA呈低表达。B组和C组中PPARγ mRNA呈低表达,Osteocalcin mRNA呈高表达。始自6个月,A组各数据和B、C组间差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),B、C组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:葛根素能够对抗酒精的毒性作用,抑制酒精诱导骨髓基质细胞的成脂分化,维持其成骨分化,能够预防小鼠酒精性ONFH的发生。