乙型肝炎病毒复制表达载体的构建与表达

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)复制表达载体,验证其在HepG2细胞系中的复制和表达。方法通过引物设计合成,以实验室构建的HBV C1亚型质粒通过PCR、酶切、克隆等分子生物学技术,构建HBV复制表达载体。利用转染试剂(Fugene HD Transfection Reagent)将载体质粒导入HepG2细胞,分别检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA在不同时间点的表达。结果酶切和测序结果均证实载体构建成功,通过瞬时转染细胞证实培养上清液中可检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA。结论利用分子克隆技术成功构建了HBV复制表达载体,可以在HepG2细胞系中复制表达。通过进一步改造,可以为HBV表型耐药以及复制活性研究提供支持。     

外源性microRNA介导的RNA干扰抑制HBV复制和表达

目的 设计并构建靶向HBV的外源性microRNA表达载体,观察其对HBV表达和复制的抑制作用.方法 以HBV P基因和X基因为靶基因,根据pcDNA6.2-G/W-miR载体要求,设计靶向HBV的microRNA序列,进行直接合成获得目的 片段并克隆到载体中,测序正确的载体通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RT-PCR、乙肝五项定量和荧光定量PCR检测其对HBV mRNA和HBV DNA的抑制作用.结果 质粒的转染效率为50%～60%,在这种状态下,外源性microRNA表达载体在HBV mRNA和HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平上均能显著抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达(P＜0.05).结论 外源性microRNA表达载体构建成功,并能抑制HBV靶基因的表达,为其在慢性HBV感染基因治疗中的应用奠定了基础.     

丙肝病毒核心蛋白抑制乙肝病毒转录与复制的实验研究

目的观察丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV core)对乙型肝炎病毒(HBV)基因转录和病毒复制的影响。方法将不同剂量的HCVcore表达质粒(pNKF-HC Vcore)转染HepG2.2.15细胞。以空载质粒(pNKF)转染HepG2.2.15细胞作为阳性对照,转染HepG2细胞作为阴性对照。以Northern吸印杂交检测HBV mRNA的转录水平,以Southern吸印杂交检测HBV复制中间体DNA的复制水平。结果20μg pNKF-HCV core转染HepG2.2.15细胞后,可使细胞中HBV mRNA转录水平及HBV复制中间体DNA复制水平明显降低,抑制率分别为51.9%及36.5%。10μg及15μg pNKF-HCV core较pNKF转染的HepG2.2.15细胞的HBV mRNA信号与HBV复制中间体DNA检出信号强度无显著差异。结论HCV核心蛋白达到一定的剂量后能够在一定程度上抑制HBV的转录与复制。     

HBX在肝癌细胞中通过下调miR-199a增强AKT的表达

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)调节miR-199a的表达在HBV相关性肝癌发生中的分子机制.方法 重组HBX腺病毒(Ad-HBX)感染人肝癌HepG2细胞,HBX的siRNA转染稳定表达HBV基因的人肝癌HepG2.2.15细胞,荧光定量PCR方法检测HBV相关性肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、miR-199a、AKT的mRNA表达水平及运用Western blot检测肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、AKT的蛋白表达水平;分别用miR-199a mimics和miR-199a inhibitor的转染肝癌细胞后,荧光定量PCR方法检测肝癌细胞中AKT的mRNA表达水平及运用Westem blot检测肝癌细胞中AKT的蛋白表达水平.结果 miR-199a在HepG2.2.15细胞中表达水平显著低于HepG2细胞,并且证实其表达下调受到了HBX的调控(P＜0.05),HepG2.2.15细胞中AKT表达水平显著高于HepG2细胞(P＜0.05),在HepG2.2.15细胞中过表达miR-199a能明显下调AKT表达水平以及在HepG2细胞中抑制miR-199a能明显上调的AKT表达水平(P＜0.05),此外,miR-199a的表达量在HBV相关性肝癌组织比相应的癌旁组织表达降低.结论 HBX可以通过miR-199a调节AKT导致HBV相关性肝癌发生.     

MiR-122对乙肝病毒复制影响的研究

目的探讨微型RNA122(mi R-122)在细胞水平对乙肝病毒(HBV)复制的影响。方法将mi R-122的表达载体p SU6-mi R-122和HBV感染性克隆p HBV1.3分别转染Hep G2.2.15和Hep G2细胞;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中HBs Ag和HBe Ag含量的变化,荧光定量PCR法检测细胞HBV DNA拷贝数的变化。结果mi R-122在Hep G2.2.15细胞和Hep G2细胞中均能够抑制HBs Ag和HBe Ag的表达,还可明显降低HBV DNA的拷贝数。结论mi R-122能够在细胞水平抑制HBV的复制。     

miR-583靶向调控DDX5促进HBV复制和表达

目的 探讨miR-583对乙型肝炎病毒(HBV)复制、表达的影响及相关作用机制.方法 体外培养人肝癌细胞HepG2、人稳转HBV病毒的肝癌细胞HepG2.2.15,并将HepG2.2.15分为空白对照组、NC-siRNA组(转染NC-siRNA)及miR-583 siRNA组(转染miR-583 siRNA).实时荧光...     

miR-122对乙型肝炎病毒抗原表达的影响

目的:探讨miR-122对乙型肝炎病毒HBsAg、HBeAg表达的影响.方法:设计合成2务miR-122的反义寡核苷酸(anti-miR-122,LNA-antimiR-122)、hsa-miR-122以及阴性对照anti-GFP,脂质体介导转染HepG2.2.15细胞.取细胞转染24h、48 h后的培养液,时间分辨荧光免疫法检测anti-miR-122组、LNA-antimiR-122组、hsa-miR-122组以及anti-GFP组HBsAg和HBeAg的表达,定量PCR检测各组HBV DNA的表达.转染48 h后,提取细胞内总RNA,Taqman技术实时荧光定量PCR检测各组miR-122的表达.结果:①转染48 h后anti-miR-122组、LNA-antimiR-122组miR-122表达明显受抑制,低于阴性对照组(P ＜0.001).hsa-miR-122组miR-122水平较阴性对照组升高(P＜0.001).②hsa-miR-122组HBsAg、HBeAg表达均低于阴性对照组(P ＜0.001);anti-miR-122组、LNA-antimiR-122组HBsAg、HBeAg表达均高于阴性对照组(P ＜0.001).③转染24 h与48 h后各组HBV DNA表达与阴性对照组比较无统计学意义(P＞0.05).结论:miR-122可调节乙型肝炎病毒抗原表达.     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

miR-122表达载体的构建及其对Bcl-xL,Bcl-2基因的抑制作用

目的构建miR-122真核表达载体并检测其表达对BEL-7402/5-FU细胞中耐药相关基因Bcl-xL,Bcl-2基因表型的作用。方法人工合成miR-122成熟cDNA序列,以质粒载体pSilencer 3.1-H1 neo为母本,构建miR-122真核表达载体,空载体作为对照,利用脂质体2000和G418筛选稳转至BEL-7402/5-FU细胞中。其中转染miR-122载体的细胞为miR-122转染组,转染空载体的细胞为空载体转染组,通过实时荧光定量RT-PCR检测未转染组、转染空载体组和miR-122转染组细胞中miR-122表达水平。验证miR-122载体是否在细胞中稳定表达。并通过实时荧光定量RT-PCR检测未转染组、空载体转染组和miR-122转染组中耐药相关基因Bcl-xL,Bcl-2的基因表达情况。结果 miR-122真核表达载体在BEL-7402/5-FU细胞中稳定表达,与未转染组和空载体转染组比较,miR-122转染组中Bcl-xL,Bcl-2的基因表达水平显著降低。结论 miR-122可下调耐药相关基因Bcl-xL,Bcl-2的基因表达,MiR-122是降低BEL-7402/5-FU细胞的5-氟尿嘧啶药物敏感性影响的潜在因素。     

APOBEC3G真核表达载体构建及抗HBV复制的初步研究

目的构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（APOBEC3G）真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒（HBV）复制的作用。方法采用RT-PCR法从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,利用脂质体转染法将pcDNA3.1-A3G转染HepG2.2.15细胞,分别于转染后第24、48、72 h收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。结果测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G编码区序列存在1处碱基同义突变;HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h表达量显著降低。结论成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供了实验基础。     

MiR-122稳定转染细胞系的建立及其脂代谢特征

目的:利用稳定表达人miR-122前体的表达载体,转染低表达miR-122的人肝癌细胞系HepG2细胞,获得过量表达miR-122的稳定转染细胞系,探讨miR-122对肝脏细胞脂代谢的影响及其机制。方法:对已构建完成的表达质粒pEZX-hsa-mir-122和对照质粒pEZX-mir-control进行酶切鉴定,对酶切正确的克隆进行DNA测序,测序正确的克隆应用脂质体试剂转染,绿色荧光蛋白表达监测转染效率,应用嘌呤霉素筛选稳定转染细胞系,实时定量PCR在RNA水平鉴定miR-122的表达,蛋白质印迹法从靶分子水平验证miR-122的抑制功能,尼罗红染色观察细胞内脂质。结果:pEZX-hsa-mir-122质粒成功转染HepG2细胞,质粒携带的miR-122前体序列整合到细胞基因组中,获得过量表达miR-122的HepG2细胞株,细胞内成熟体miR-122可抑制靶基因的翻译,细胞内脂质明显增加。结论:人miR-122前体序列可整合在HepG2细胞基因组中,过量表达miR-122的HepG2细胞出现脂质代谢异常。     

干扰素对人肝癌细胞株HepG2.2.15凋亡的影响

目的：探讨肝癌细胞株HepG2.2.15通过低表达Fas逃避免疫监视，以及干扰素α(IFN-α)通过上调Fas 表达对细胞凋亡的影响。方法：用流式细胞术检测肝癌细胞株HepG2.2.15的 Fas表达及IFN-α对其Fas表达的影响；用激活性Fas单克隆抗体CH11诱导细胞凋亡的方法，研究肝癌细胞对Fas介导凋亡的抵抗以及IFN α对肝癌细胞凋亡的影响。结果：① HepG2.2.15细胞低表达Fas，经浓度分别为2000、1000、　500U/ml的IFN-α作用后，Fas表达均显著增加(P均<0.001)，且Fas表达率随IFN-α浓度的增加而增加；②CH11不能诱导HepG2.2.15细胞凋亡，IFN-α上调细胞Fas表达后，由CH11诱导的细胞凋亡增加(P均<0.01)，且凋亡率随IFN-α浓度的增加而增加。结论：肝癌细胞HepG2.2.15能抵抗Fas介导的凋亡，IFN-α可通过上调细胞Fas表达，促进CH11诱导的肝癌细胞凋亡。     

小鼠肝脏特异的微RNA在HeLa细胞中的转染与表达

目的观察miR-122在HeLa细胞内表达情况.方法将构建的miR-122真核表达质粒pAVU6 27-mir122以电穿孔法转染HeLa细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,通过Northern杂交和点杂交验证miR-122在HeLa细胞中的表达.结果阳性转染细胞与小鼠肝脏细胞Northern杂交及斑点杂交均出现放射自显影,而转染空质粒的HeLa细胞则无放射显影.结论 miR-122在HeLa细胞中获得正确表达.     

HBV对肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15中MMP-2及MMP-9的表达影响

目的研究基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9在肝细胞癌(HCC)细胞系HepG2和HepG2.2.15中的表达情况,探讨乙型肝炎病毒(HBV)对肝癌细胞系(HepG2,HepG2.2.15)中MMP-2、MMP-9表达的影响及其与癌细胞侵袭转移之间的关系。方法用明胶酶谱法检测HepG2细胞和稳定转染了HBV质粒的HepG2.2.15细胞中MMP-2和MMP-9的表达情况,观察两种细胞的某些生物学活性,用细胞生长曲线检测两者的生长速度。结果明胶酶谱法检测HepG2细胞中MMP-9的表达水平高于HepG2.2.15细胞(P<0.05),而两者MMP-2的表达差异不显著(P>0.05)。细胞生长曲线显示HepG2细胞的生长速度快于HepG2.2.15细胞。结论通过体外鉴定肝细胞癌细胞系HepG2细胞和HepG2.2.15细胞生长状态的差异,揭示了HBV的细胞内感染过程中HBV对肝细胞癌的生长具有一定的影响。HBV可影响明胶酶MMP-2和MMP-9的分泌及活性,进而对肿瘤的侵袭转移产生一定的影响。     

筛选调节HBV增殖和HBsAg产生的宿主细胞的miRNA

目的筛选调节乙型肝炎病毒(HBV)增殖和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)产生的宿主细胞的miRNA。方法用328种miRNA的反义链转染HepG2 2.2.15细胞,72 h收获上清,MTS检测细胞的增殖活性,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平,实时定量PCR检测其中HBV DNA的拷贝数。构建筛选到的miRNA的过表达载体,转染HepG22.2.15细胞,也分别用MTS、ELISA和实时定量PCR进行检测。结果 miR-199a-3pASO、miR-210ASO和miR-185ASO促进了HBsAg产生和HBV增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210、miR-185的过表达,分别抑制了HBsAg的产生和HBV的增殖(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的ASO转染组与对照组相比,分别降低了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05);miR-199a-3p、miR-210和miR-185的过表达载体转染组与对照组相比,分别增加了细胞内miR-199a-3p、miR-210和miR-185的表达水平(P<0.05)。结论在没有对细胞的增殖活性产生影响的情况下,miR-199a-3p、miR-210和miR-185抑制了HBV表面抗原的产生和HBV的增殖,miRNA作为病毒与宿主细胞相互作用中的调节因子,在HBV的生命活动周期中具有重要作用。     

HBV转染肝癌细胞系基因表达谱改变的研究

目的 利用寡核苷酸芯片筛选HBV感染应答基因,探讨HBV感染分子致病机制.方法 选用Agilent Human 1A Oligo基因芯片进行乙型肝炎基因表达改变的研究,用Cy3标记实验细胞(HepG2.2.15细胞),Cy5标记对照组细胞(HepG2细胞),比较HepG2.2.15细胞与HepG2细胞之间的基因表达谱差异;用适时定量PCR(RQ-PCR)对部分差异基因进行验证.结果 通过杂交、扫描、统计学分析,根据P Value LogRatio值及gProcessed signal/rProcessed signal值从近20 000个基因中共筛选出差异表达基因744个,其中423个基因表达上调,321个基因表达下调.用RQ-PCR技术对其中4个相关基因胰岛素样生长因子2(IGF2)、甲胎蛋白(AFP)、干扰素同源序列结合蛋白(ICSBP)、核糖核苷酸还原酶缩多氨酸M1(RRM1)的表达差异进行了验证,与表达谱的结果基本保持一致.结论 通过验证,表达谱芯片的杂交结果真实可靠,为下一步继续进行差异表达基因的研究、了解HBV的致病机制打下了基础.     

乙型肝炎病毒对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体诱导凋亡的影响及其机制

目的：研究乙型肝炎病毒（HBV）转染后,细胞对肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体（TRAIL）诱导 的凋亡的敏感度变化及作用机制。通过人肝癌细胞HepG2及转染了HPV全基因组的HepG2.2.15细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感度研究,探讨HBV感染对细胞凋亡的影响及其机制。方法：流式细胞仪检测TRAIL诱导的凋亡反应和细胞表面TRAIL蛋白的表达,酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清液中分泌型TRAIL蛋白质的表达,半定量逆转录聚合酶链反应检测TRAIL受体和其转导通路中凋亡拮抗分子FLIP的表达。结果：HepG2和HepG2．2．15对TRAIL诱导的凋亡率分别为51．60％和9．12％。与HepG2相比,HepG2．2．15细胞表面TRAIL蛋白质及其受体的表达都有不同程度的下调,而抵抗细胞凋亡的分子－FLI的表达却显著上调（P＜0．01）,两细胞系上清中分泌型TRAIL的表达量差异无显著意义（P＞0．05）。结论：HBV转染可以抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡,可以下调细胞表面TRAIL蛋白质及其受体的表达,但使FLIP的表达显著上调。这能从一定程度上解释HBV感染逃逸机体免疫监视,持续存活,导致相应病理变化的机制。