绞股蓝总苷对谷氨酸诱导的胎鼠大脑皮层神经元氧化性损伤保护机制的研究

目的：探讨绞股蓝总苷（gypenosides,GP）对谷氨酸（glutamic acid,Glu）诱导的胎鼠大脑皮层神经元损伤的保护作用，并从信号通路角度探讨其作用机制。方法：以体外培养的13～14?d胎鼠大脑皮层神经元为研究对象，建立谷氨酸损伤和GP保护模型。采用MTT法测定细胞的存活率；荧光染料Ho33342和碘化丙碇（PI）荧光双染法鉴定细胞死亡方式；硝酸还原法测定细胞培养上清液中NO含量；生化法检测H2O2含量；流式细胞仪检测线粒体膜电位变化，分析GP对谷氨酸氧化性神经损伤的保护机制。结果：谷氨酸可导致神经细胞发生凋亡和坏死两种死亡方式；GP（200?μg/ml）可明显抑制谷氨酸引起的NO、H2O2含量的升高，有效地防止线粒体膜电位的下降，从而提高细胞存活率。结论：GP可明显拮抗谷氨酸介导的氧化性神经损伤，提高细胞的存活率，其机制可能与提高神经细胞内抗氧化酶活性，清除氧自由基对线粒体膜的损伤有关。     

蛇床子素通过激活 PI3K/Akt 通路减轻谷氨酸诱导的海马神经元损伤

目的：研究蛇床子素(osthole,OST)减轻谷氨酸诱导的HT22细胞损伤的机制。方法：建立谷氨酸诱导的 HT22细胞损伤模型;HT22损伤细胞经OST处理,MTS法检测细胞活力;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放 实验检测HT22细胞LDH漏出率;caspase-3活性检测试剂盒测定各组caspase-3活性;Western印迹法测定细胞内磷脂酰肌 醇(-3)激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K),蛋白激酶B(protein kinase B,Akt),磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化Akt(p- Akt)蛋白表达情况。结果：OST在0~10 mmol/L范围内呈剂量依赖性提高谷氨酸诱导的HT22细胞活力,降低LDH漏出 率,改善HT22细胞损伤。此外,OST显著上调谷氨酸损伤细胞p-PI3K和p-Akt蛋白表达,而PI3K抑制剂LY294002明显 抑制OST谷氨酸损伤细胞p-Akt蛋白表达的上调作用。结论：OST对谷氨酸损伤的HT22细胞具有保护作用,其保护作 用机制可能是通过激活PI3K/Akt信号通路来实现的。     

人参皂苷Rg1激活PI3K/Akt信号通路对6-OHDA毒性作用的影响

目的 探讨人参皂苷Rg1对抗6-羟基多巴胺(6-OHDA)毒性作用的信号通路.方法 MES23.5细胞常规培养,免疫印迹法观察人参皂苷Rg1预处理对6-OHDA诱导的磷酸化蛋白激酶B (Akt) 表达的影响,MTT法观察细胞的存活率.结果 6-OHDA可时间依赖性地降低MES23.5细胞磷酸化Akt的表达(F=24.51,P<0.01),人参皂苷Rg1预处理可明显增强磷酸化Akt的表达(t=471.60,P<0.01);人参皂苷Rg1预处理可明显降低6-OHDA对MES23.5细胞的损伤作用,此作用可以被磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002所阻断(F=25.12,P<0.01).结论 人参皂苷Rg1通过激活PI3K/Akt信号通路对抗6-OHDA对MES23.5神经细胞的毒性作用.     

绞谷蓝皂苷含药血清对谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用

目的研究绞股蓝皂苷（gypenosides,GP)含药血清对谷氨酸(glutamic acid ,Glu)诱导的氧化性神经损伤的保护作用。方法采用中药血清药理学方法，收集GP含药血清，以体外培养的胎鼠大脑皮层神经元为研究对象，采用倒置相差显微镜观察细胞形态；MTT法测定细胞存活率；Ho33342/PI荧光双染法鉴定细胞死亡方式；生化法检测细胞内超氧化物歧化酶（Super Oxide Dismutase，SOD）活性和谷胱甘肽（L-Glutathione，GSH）含量；流式细胞仪测细胞内游离Ca²⁺变化，综合评价GP含药血清对谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用。结果谷氨酸可导致神经细胞发生凋亡和坏死；GP含药血清能明显拮抗谷氨酸的细胞损伤作用，提高细胞的存活率，维持细胞内较高GSH含量和SOD活性，抑制细胞内游离Ca²⁺浓度的升高。结论GP含药血清能明显拮抗Glu诱导的氧化性神经毒性，以400mg· kg^-1·d^-1GP灌胃含药血清作用最显著。     

脱氟烷诱导神经元HO-1mRNA表达信号通路的研究

目的 研究脱氟烷(desflurane)诱导氧糖剥夺损伤神经元血红素氧合酶-1表达的信号转导通路,探讨脱氟烷脑保护机制.方法 将96孔和6孔培养板上培养7d的大鼠海马神经元随机分为6组(n=12):正常培养组(C组),神经元按正常培养方法培养;氧糖剥夺组(I/R组),神经元缺糖缺氧后复糖复氧处理;氧糖剥夺 6% desflurane组(Des组),神经元缺糖缺氧的同时接受6% desflurane麻醉;氧糖剥夺 6% desflurane 10μmol/L tin-protoporphyrin (HO-1抑制剂)组(Tin组)、氧糖剥夺 6% desflurane 10μmol/L LY 294002 (PI3-K抑制剂)组(LY组)、氧糖剥夺 6% desflurane 10μmol/L Triciribin (Akt抑制剂)组(Tri组)神经元进行缺糖同时分别加入tin-protoporphyrin、 LY 294002或Triciribin使其终浓度均为10μmol/L后同D组处理.96孔培养板的神经元进行细胞存活率的检测.6孔培养板的神经元进行神经元纯度鉴定、神经元凋亡、HO-1mRNA表达、PI3-K和Akt蛋白表达的检测.结果 Des组PI3K和Akt蛋白表达增加,HO-1mRNA表达增加,神经元存活率增加、凋亡率降低(vs I/R组,P<0.01).Tin组PI3K和Akt蛋白表达变化不明显(vs Des组,P0.05), HO-1mRNA表达降低,神经元存活率降低、凋亡率增加 (vs Des组,P<0.01). LY组PI3K和Akt表达降低,HO-1mRNA表达降低,神经元存活率降低、凋亡率增加(vs Des组,P<0.05或P<0.01). Tri组PI3K表达变化不明显(vs Des组,P0.05), Akt表达降低,HO-1mRNA表达降低,神经元存活率降低、凋亡率增加(vs Des组,P<0.05或P<0.01).结论 Desflurane通过PI3-K/Akt信号转导通路诱导大鼠海马神经元HO-1表达,保护了神经元.     

阿魏酸钠抗Aβ25-35诱导的皮层神经元凋亡作用的PI-3K/Akt通路

目的观察磷脂酰肌醇3位羟基激酶(PI-3K)的特异性阻断剂LY294002对阿魏酸钠抗β淀粉样蛋白(25-35)(Aβ25-35)诱导培养的皮层神经元凋亡作用的影响。探讨磷脂酰肌醇3位羟基激酶/Akt(PI-3K/Akt)信号转导通路是否参与了阿魏酸钠的抗凋亡作用。方法以Aβ25-35诱导大鼠皮层神经元凋亡模型,用倒置显微镜观察细胞形态变化,用Hoechst33258核染色分析神经元凋亡,并计算神经细胞的凋亡率。结果阿魏酸钠对Aβ25-35诱导的皮层神经元凋亡有保护作用,使神经细胞凋亡率下降。LY294002可以抑制阿魏酸钠的抗凋亡作用。结论在Aβ25-35诱导大鼠皮层神经元凋亡模型中,PI-3K/Akt信号转导通路参与了阿魏酸钠的抗凋亡作用。     

PI3K/Akt通路对缺氧缺血皮质神经元细胞GLUT3转位的影响

目的 研究PI3K/Akt通路对大鼠缺氧缺血皮质神经元细胞葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)转位的影响.方法 将原代培养的大鼠皮质神经元随机分为对照组、缺氧缺血组、缺氧缺血加LY294002 (PI3K特异性抑制剂)组,用Western blot检测3 h后3组细胞中PI3K/Akt磷酸化蛋白的表达,RT-PCR检测GLU...     

P13K/Akt通路在药物放射增敏中作用的机制

目的 进一步探讨PI3K/Akt信号转导途径在药物放射增敏中作用的分子机制.方法 体外培养HeLa细胞,多西紫杉醇(docetaxel)和顺铂(cisplatin)单独及分别联合P13K抑制剂LY294002作用24 h,X线6 Gy剂量照射;Western blot检测Akt、磷酸化Akt(pAkt)、Bad、磷酸化Bad(pBad)蛋白的表达变化;RT-PCR检测Bad、Ku70、Ku80 mR-NA的表达变化;中性彗星电泳检测不同处理组细胞DNA的损伤.结果 ①docetaxel+LY294002联合照射组、cispla-tin+LY294002联合照射组Bad mRNA表达增高,Ku70 mRNA表达减低,Ku80 mRNA表达无明显变化;②docetaxel+LY294002联合照射组、cisplatin+LY294002联合照射组Bad蛋白表达增高,pAkt、pBad蛋白表达减低,Akt蛋白表达无明显变化;③docetaxel+LY294002联合照射组、cisplatin+LY294002联合照射组细胞彗星电泳尾距明显长于单纯药物增敏照射组.结论 ①docetaxel和cisplatin药物增敏照射能够明显活化PI3K/Akt信号转导途径;②抑制PI3K/Akt信号转导途径能够抑制Ku70表达,减少细胞DNA损伤后的再修复,提高促凋亡因子Bad的表达,促进细胞的凋亡.     

绞股蓝皂甙抗谷氨酸诱导的氧化性神经毒性

目的：探讨绞股蓝皂甙(gypenoside，GP)对谷氨酸(glutamate，Glu)介导的氧化性神经毒性的拮抗作用。方法：体外培养胎鼠大脑皮层神经细胞，建立Glu氧化性损伤模型，用MTT法测定细胞活力，透射电镜观察Glu所致的神经细胞死亡方式，流式细胞术分析细胞凋亡率。结果：GP以时间依赖性方式明显拮抗谷氨酸介导的氧化性神经毒性，于Glu损伤前达到最佳保护效果，Glu氧化性毒性导致神经细胞发生凋亡兼具坏死特征的死亡，Glu损伤组细胞凋亡率(21．63％)明显高于正常对照组(0．09％)及GP保护组(8．94％)。结论：GP可明显拮抗Glu介导的氧化性神经毒性。     

PI3K/Akt信号通路抑制剂对胃癌细胞SGC7901中Skp2和NAG-1表达的影响及其效应

目的 研究PI3K/Akt信号转导通路靶向抑制剂LY294002对胃癌细胞SGC7901中S期激酶相关蛋白2(Skp2)和非甾体抗炎药诱导基因-1(NAG-1)表达的影响.方法 将LY294002作用于胃癌细胞株SGC7901,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率,流式细胞术AnnexinV2FITC/PI染色法检测细胞凋亡率,RT-PCR检测NAG-1、Skp2 mRNA的表达情况,Western blot检测p-Akt(Ser473)和总Akt(t-Akt)的表达情况.结果 LY294002可明显抑制SGC7901的生长,呈时间-剂量依赖性,并出现典型的细胞形态学改变;10、30、50 μmol/L的LY294002作用12 h后细胞凋亡率分别为(12.7±0.42)%、(36.5±0.45)%和(64.1±0.79)%,显著高于空白对照组的(2.3±0.36)%,差异均有统计学意义(P<0.01);LY294002可下调p-Akt的蛋白表达,而t-Akt的表达未发生改变;LY294002可上调NAG-1 mRNA的表达,并下调Skp2 mRNA的表达.结论 阻断PI3K/Akt信号转导通路可改变胃癌细胞株SGC7901中Skp2和NAG-1的表达,并能明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与其抑制Akt磷酸化及调控NAG-1、Skp2 mRNA表达水平有关.     

SYK调控缺氧/缺糖损伤诱导的大脑皮质神经元凋亡及其机制

目的 探讨抑制脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)对缺氧/缺糖损伤诱导的大脑皮质神经元的凋亡的影响及相关机制.方法 分离培养10只SD怀孕大鼠(190 ～230 g,胎龄16d)胎鼠的大脑皮质神经元细胞并用MAP2免疫荧光法进行鉴定.建立缺氧/缺糖损伤的体外模型,caspase-3荧光检测试剂盒检测caspase-3活性,Annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡,qRT-PCR检测SYK和凋亡相关的原癌基因Fra-1 mRNA的表达,Western Blot检测SYK、Bcl-2和Fra-1蛋白的表达.Control组:无转染处理的缺氧/缺糖损伤的神经元;SYK siRNA组:转染SYK siRNA的缺氧/缺糖损伤的神经元;SYK-Fra-1 siRNA组:同时转染SYK siRNA和Fra-1 siRNA的缺氧/缺糖损伤的神经元;non-specific siRNA组:转染non-specific siRNA的氧/缺糖损伤的神经元.结果 MAP2免疫荧光鉴定为神经元细胞.缺氧/缺糖损伤诱导神经元SYK表达(P＜0.01),RNA干扰抑制SYK表达后caspase-3活性(P＜0.05)和细胞凋亡(P＜0.01)均显著降低,但是Fra-1 mRNA (P ＜0.01)和蛋白(P＜0.05)表达量明显上升.用RNA干扰技术同时抑制SYK和Fra-1后,caspase-3活性(P＜0.01)显著上升但Bcl-2蛋白表达(P＜0.01)显著降低.结论 Fra-1介导了SYK对缺氧/缺糖损伤诱导的神经元凋亡的调节,为脑卒中所致的神经元缺血性损伤的治疗提供了新的靶点.     

rhEPO通过调节PI3K/AKT信号通路改善大鼠脑出血后神经元损伤

目的 研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)是否可以通过调节PI3K/AKT信号通路来改善大鼠脑出血后的神经元损伤。方法SD大鼠构建脑出血(ICH)模型,并给予rhEPO药物治疗,采用TUNEL法和试剂盒检测神经细胞凋亡及凋亡蛋白Caspase 9表达;采用Real-Time PCR法和Western blot法检测PI3K、AKT的基因和蛋白磷酸化水平的表达。结果与ICH非治疗组相比,rhEPO治疗组中神经元凋亡细胞数和Caspase 9活性表达明显降低(P<0.05); rhEPO治疗组PI3K和AKT的蛋白磷酸化水平表达和mRNA表达显著升高 (P<0.05)。结论重组人促红细胞生成素rhEPO具有神经保护作用,可以通过调节PI3K/AKT信号来改善大鼠脑出血后的神经元损伤。     

藻酸双酯钠对大鼠皮层神经细胞谷氨酸兴奋毒性的保护作用

目的:观察藻酸双酯钠(Polysccharide Su lfate,PSS)对培养神经细胞谷氨酸兴奋毒性的保护作用。方法:体外培养大鼠皮层神经细胞,加入谷氨酸观察谷氨酸对神经细胞的兴奋毒性及PSS的保护作用,以碘化丙啶染色,流式细胞仪定量分析细胞凋亡百分率;以荧光分光光度法测定细胞内游离钙及caspase 3活性的变化。结果:Pss50,100,150ug/m l能显著减少细胞死亡,降低乳酸脱氢酶(LDH)漏出量及丙二醛(MDA)生成,提高超氧歧化酶(SOD)活性,抑制细胞内[Ca2+]i累积以及caspase 3活性,抑制神经细胞凋亡。结论::PSS对培养神经细胞谷氨酸兴奋毒性具有显著的保护作用,其机制可能与PSS抑制细胞内[Ca2+]i累积以及抗脂质过氧化作用有关。     

神经元型一氧化氮合酶在人胎脑的表达

目的研究神经元型一氧化氮合酶（nNOS）在2～7月龄正常人胎脑大脑皮质和海马结构的表达情况。方法采用免疫组织化学技术，光镜下观察nNOS在不同月龄正常人胎脑大脑皮质和海马结构的表达情况；利用计算机图像分析技术测量不同月龄额叶皮质和海马结构内嗅区皮质nNOS表达的平均吸光度。结果光镜下2月龄时人胎脑大脑皮质和海马结构中没有nNOS表达，3月龄时上述部位开始出现nNOS阳性产物的表达，阳性产物主要存在于神经细胞的胞质和突起，胞核不着色。4月龄时阳性产物增多（P〈0．05），5月龄与4月龄之间相比变化不明显（P〉0．05），6、7月龄nNOS表达持续增强（P〈0．05）。结论nNOS在3～7月龄的人胎脑大脑皮质和海马结构中有表达，其表达与胎脑神经细胞的发育规律一致，表明其产物一氧化氮（NO）与人胎脑的发育密切相关。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ在缺氧缺血性神经细胞死亡中的作用

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在缺氧缺血性神经细胞死亡中的作用。方法体外实验采用原代培养的大鼠胎鼠皮质神经细胞,给予缺氧再给氧处理;体内实验采用线栓法建立大鼠局灶性短暂性脑缺血再灌注损伤模型。用噻唑蓝比色法测定神经细胞生存率,用电泳迁移率变动分析法检测PPARγ的结合活性。结果缺氧处理后的神经细胞,其PPARγ的结合活性明显增加,以对照组活性为100,而缺氧3h组为160.3,缺氧3h再给氧的2、4、8h分别为157.5、136.6、103.3;缺氧3h及再给氧2h组与未处理组相比(P<0.01)。缺血处理后的神经细胞,其PPARγ的结合活性也明显增加,以假手术组为100,则手术组缺血侧、未缺血侧分别为144.8、102.6,缺血侧PPARγ的结合活性与未缺血侧及假手术组相比(P<0.01);PPARγ拮抗剂GW9662能明显增加缺氧再给氧后神经细胞的生存率,以对照组(CTL)生存率为100%计算,单纯缺氧组为58.6%,不同浓度的GW9662(0.5、1、2.5)预处理后分别为68%、73.6%和89.7%,GW9662预处理组与单纯缺氧再给氧组相比(P<0.05或P<0.01);GW9662能明显降低由于缺氧而增高的PPARγ结合活性,以未处理组为100,单纯缺氧组、GW9662预处理组分别为184、105,GW9662预处理组神经细胞PPARγ的结合活性与单纯缺氧再给氧组相比,P<0.01。结论PPAR     

急性分离的大鼠海马及皮层神经元快速失活钾电流特性的比较

目的 探讨海马及皮层神经元细胞膜上快速失活钾通道的特性。方法 急性分离大鼠海马及皮层神经元;利用whole-cell膜片钳技术记录IA电流。结果 海马神经元上的IA通道电流幅度较皮层神经元大、潜伏期短。结论 海马神经元与皮层神经元上的IA电流特征存在差别。     

脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响

目的：探讨脑缺血再灌注不同时间对大鼠海马神经元自噬及PI3K/mTOR通路的影响。方法：72只大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注组（分别再灌0、6、12、24、36 h）,每组12只。采用四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型。神经功能缺损评分评价大鼠海马神经功能,HE染色检测大鼠海马神经细胞损伤,透射电镜下观察海马神经元内自噬小体,Western blot检测Beclin-1、LC3 II、p62、p-PI3K、p-Akt及p-mTOR蛋白表达。结果：与假手术组比,随着脑缺血再灌注的时间延长,脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积、自噬小体数量均增加（均P＜0.05）;随着脑缺血再灌注的时间延长,大鼠海马组织自噬相关蛋白Beclin-1和LC3 II表达显著上调、p62表达下调（P＜0.05）;PI3K/mTOR通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表达显著下调（P＜0.05）。结论：脑缺血再灌注可增强大鼠海马神经元自噬,抑制PI3K/mTOR信号通路。     

一氧化氮在缺氧复氧所致神经细胞凋亡中的作用及银杏叶提取物的保护效应

为探讨银杏叶提取物对缺氧复氧神经细胞凋亡中一氧化氮 (NO)动态表达的作用 ,对大鼠大脑皮质神经细胞原代分离培养 ,用原位末端标记法 (TUNEL)及流式细胞术检测细胞凋亡 ,用荧光分光光度法检测细胞培养上清液中亚硝酸根含量的变化。结果 :缺氧复氧致胎鼠大脑皮质神经细胞凋亡中NO含量呈双时相增高 (单纯缺氧 2h及缺氧 18h复氧 18h) ,银杏叶提取物 (EGB)对此双时相的NO升高有抑制作用 ,氨基胍 (AG)可抑制缺氧 8h复氧 18h组的NO升高 ,对缺氧 2h组的NO升高无抑制作用。提示 :NO参与了缺氧复氧过程中神经细胞凋亡 ,银杏叶提取物对缺氧复氧神经细胞凋亡有保护作用 ,其作用可能是通过抑制NO而实现的。     

中药更年春方通过ERβ及PI3K/Akt信号通路对Aβ25-35致大鼠胎鼠海马神经元损伤的保护作用

 目的 观察中药更年春方（Gengnianchun formula，GNC）通过雌激素受体β（estrogen receptor β，ERβ）及PI3K/Akt信号通路对β淀粉样蛋白25-35片段（Aβ_25-35）致大鼠胎鼠海马神经元细胞损伤的保护作用。方法 采用Aβ_25-35作用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系，通过CCK-8法检测细胞活力摸索Aβ_25-35及GNC含药血清（GNC serum，GS）处理神经细胞的合适浓度及时间。采用Aβ_25-35作用大鼠胎鼠海马神经元构建阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的体外模型，分为无血清对照组、模型组、GS组、空白血清对照（normal saline serum，NS）组和PHTPP（选择性ERβ拮抗剂）组。利用正置显微镜观察细胞形态、CCK-8法检测细胞活力及LDH释放法检测细胞损伤。利用Hoest33258/PI双重荧光染色实验、qRT-PCR及Western blot实验检测细胞凋亡相关指标。结果 与无血清对照组相比，模型组大鼠胎鼠海马神经元胞体及突触出现明显的收缩崩解和细胞碎片、细胞活力下降、LDH释放升高。与模型组和NS组相比，GS组大鼠胎鼠海马神经元胞体及突触的收缩崩解和细胞碎片减少、细胞活力上升、LDH释放减少、PI阳性神经元细胞数目下降、神经元bax/bcl-2 mRNA、cyt-c mRNA水平及bax/bcl-2、cleaved-caspase 3、cyt-c蛋白表达水平下降、p-Akt蛋白表达水平上升。与GS组相比，PHTPP组大鼠胎鼠海马神经元bax/bcl-2 mRNA、cyt-c mRNA水平及bax/bcl-2、cleaved-caspase 3、cyt-c蛋白表达水平上升、p-Akt蛋白表达水平下降。结论 GNC对Aβ_25-35致大鼠胎鼠海马神经元的损伤具有保护作用，此作用是通过ERβ及PI3K/Akt信号通路介导的。